心肌的基本功能是泵出血液，心脏要行使此功能，必定与心肌细胞的能量代谢密切相关。研究表明[1]，心肌细胞中线粒体体积占心肌细胞总体积的30%以上，这提示线粒体在心肌搏动时的关键作用。在心肌梗死发生的病理过程中，心肌细胞必然经过从缺血、缺氧，并最终发生心肌细胞凋亡，而该过程与线粒体的生理状态密切相关。研究发现[2-3]，心肌缺血缺氧后，活性氧(ROS)的过量产生在急性心肌细胞凋亡的病理过程中发挥关键的信号传递作用。Son Y等[4]的研究发现，ROS可以通过氧化修饰蛋白中的关键氨基酸残基，从而激活MAPK家族成员。国内学者也发现[5]，p38蛋白作为ROS的下游蛋白，参与心室重构过程中的心肌纤维化。本研究以心肌梗死大鼠为研究对象，观察冠状动脉结扎后不同时间节点心肌组织中ROS及p38蛋白含量，初步发掘ROS对p38蛋白的潜在关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂：南京建成羟自由基测定试剂盒，南京建成超氧阴离子自由基试剂盒，南京凯基Trizol试剂，南京凯基总RNA提取试剂盒，大连宝生物反转录试剂盒，南京凯基全蛋白提取试剂盒，南京凯基BCA蛋白定量试剂盒，北京博奥森兔抗人p38一抗，北京博奥森β-actin一抗，北京博奥森山羊抗兔二抗。

1.2 实验动物及分组：由宁夏医科大学动物实验中心购的健康雄性SD大鼠30只，体重250～300 g。所有大鼠随机分为3组，分别为健康对照组、假手术组(sham组)和心肌梗死组(AMI组)，根据结扎时间将AMI组大鼠分为冠脉结扎后6、12、24 h 3个亚组，每组大鼠6只。

1.3 心肌梗死大鼠模型建立：采用既往的制备心肌梗死大鼠的方法[6]制备急性心肌梗死大鼠模型，即使用3%戊巴比妥钠溶液45 mg/kg浓度腹腔注射麻醉大鼠，固定于鼠台上，常规记录心电图。大鼠麻醉后气管插管，连接动物呼吸机，潮气量3 mL/100 g，呼吸频率55 次/min，做好上述准备后实施手术。大鼠左侧胸前备皮3 cm×3 cm，碘伏消毒，左侧第3、4肋间胸骨旁开口，依次剪开皮肤、皮下组织及肌肉组织，剪断第3肋骨，暴露心脏；剪开心包，于大鼠左心耳下缘肺动脉圆锥间距主动脉根部2～3 mm处，用6～0眼科无创缝合线穿过前降支，并连同一小束心肌结扎，目测大鼠心肌结扎区出现颜色变白、局部心肌运动减弱后，心电监护发现对应区域出现ST段上台超过0.2 mV时认为结扎成功。观察大鼠心脏无出血后，逐层缝合大鼠胸腔。大鼠自主呼吸后拔出气管插管，常温复苏，复苏后单只大鼠分笼饲养。为预防术后感染发生，每只腹腔注射青霉素20万单位。

假手术组大鼠开胸后于冠状动脉相同部位穿线但不结扎，其余处理同AMI组；对照组大鼠不采取任何处理措施。

而后，她又相继出演了许多风格迥异的角色。从爱奇艺自制网络剧《在线爱》中的女二号杜若西，到传记电影《画圣》中姿质丰艳的杨贵妃，再到古装喜剧《梦回唐朝》中的武顺，赵多娜的戏路越来越宽，演技也愈发成熟。

1.4 心肌梗死的判断及标本收集:大鼠冠状动脉前降支结扎成功标志，即相应供血区域心肌颜色变暗。逐层关闭大鼠胸腔并持续观察心电监护，发生心律失常者给予相关药物处理。大鼠心肌梗死模型建立成功，为后续实验提供心肌组织来源。

1.5 心肌组织中ROS测定：分别于冠状动脉前降支结扎后6 h、12 h及24 h处死大鼠，迅速开胸，剪下心脏，冰生理盐水洗净血液，剪除左、右心耳及残留大血管，滤纸过滤干，在乳头肌平面将心脏横断分为两部分，近心尖部非梗死区域心肌组织，电子天平称取待测心肌组织重量，制备10%组织匀浆，低温离心机3 000 min离心10 min，取组织匀浆上清液,利用生理盐水按1∶9、1∶19稀释成1%和0.5%的组织匀浆。获取匀浆后，分别按下列方法测定匀浆中羟自由基及超氧阴离子含量：①羟自由基含量测定。取0.5%组织匀浆0.03 mL，37 ℃加热3 min，按照说明书方法配置反应体系，37 ℃反应1 min(秒表计时)后立即加入显色剂终止反应，混匀，室温放置20 min后，550 nm下测定各管吸光度值。规定每mL或每cm3内106个细胞在本反应体系中，使反应液中H2O2浓度增加1 mmol/L为一个产生羟自由基能力单位。产生羟基自由基能力(U/mL)=(测定管吸光度-对照管吸光度)/(标准管吸光度-标准空白管吸光度值)×标准管浓度(8.824 mmol/L)×1 mL/取样量×样本测试前稀释倍数。②超氧阴离子含量测定。取1%组织匀浆0.03 mL，按照超氧阴离子自由基试剂盒说明书方法配置反应体系，混匀后37 ℃恒温水浴加热40 min后立即加入显色剂终止反应，混匀，室温放置10 min后，550 nm下比色。在反应体系中，每克物质在37 ℃反应40 min所产生的超氧阴离子自由基，相当于1 mg维生素C所抑制的超氧阴离子自由基的变化值为一个活性单位。产生超氧阴离子活力单位(U/mL)=(测定管吸光度-对照管吸光度)/(对照管吸光度-标准管吸光度)×标准管浓度(0.15 mg/mL)×样本测试前稀释倍数。

1.6 Realtime PCR检测p38 mRNA的表达:使用Trizol试剂提取心肌标本中总RNA，逆转录合成cDNA，用特异性扩增p38 mRNA的引物(F：CTCTCGCCCTTTCCAAT；R：AGGGTCGTCACGAGGTAC，159bp)，以β-actin(F：CACTGTGCCCATCTACGA；R：TGATGTCACGCACGATTT，155 bp)作为内参进行Realtime PCR(PCR扩增参数：95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，57 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40个循环检测得到的数据，根据2-△△Ct方法分析p38 mRNA表达水平。

1.7 West Blot检测p38蛋白表达:获取的心肌组织匀浆后，使用南京凯基全蛋白提取试剂盒提取全蛋白、BCA蛋白定量，取样，经过上样、电泳、转膜、封闭，滴加兔抗p38摇晃12 h，PBST转膜15 min 3次；滴加生物素标记二抗，摇晃3 h，PBST洗膜后行ECL发黄，胶片曝光；使用凝胶成像系统进行灰度分析，测定各组p38蛋白条带光密度值及β-actin条带光密度值，两者之比做为p38蛋白表达的相对值。

1.8 统计学方法：使用SPSS 11.5统计软件，计量资料用表示，多样本均数之间用单因素方差分析比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌ROS含量：3组大鼠心肌组织中ROS(超氧阴离子和羟自由基，以O2-和OH-表示)含量差异有统计学意义(P<0.05)；心梗组中的3个亚组相比，其心肌组织中ROS含量差异有统计学意义(P<0.05)。上述结果提示，急性心肌梗死以后，大鼠心肌组织中ROS随结扎时间进展而显著升高，其ROS水平显著高于假手术组和健康对照组；而假手术组和健康对照组大鼠心肌组织中ROS含量差异无统计学意义(P>0.05)，提示单纯手术因素对心肌组织中ROS影响不大，见表1。

 

表1 3组大鼠心肌组织中ROS含量的比较

  

组别nO2-OH-AMI组 结扎后6h656．44±9．65167．17±14．32 结扎后12h6106．97±7．58193．74±18．44 结扎后24h6183．44±10．75253．37±20．92假手术组60．96±0．16132．29±12．48对照组61．00±0．25130．45±13．30F值673．9059．08P值<0．05<0．05

2.2 各组大鼠心肌p38 mRNA及蛋白表达：3组大鼠心肌组织中p38 mRNA含量差异有统计学意义(P<0.05)，其中以结扎6 h后p38 mRNA表达量最多，随结扎时间延长，p38 mRNA含量逐步下降，见表2；3组大鼠心肌组织中p38总蛋白含量差异无统计学意义(P>0.05)，见表2，提示心肌梗死后心肌组织中p38总蛋白含量无明显变化；3组大鼠心肌中磷酸化p38蛋白差异有统计学意义(P<0.05)，见表2，提示结扎6 h后心肌组织中p-p38含量最多，此后逐步下降。

 

表2 大鼠心肌组织p38 mRNA、p38总蛋白及p-p38蛋白表达量的比较

  

组别np38mRNAp38总蛋白p-p38蛋白AMI组 结扎后6h62．305±0．2461．285±0．2130．867±0．1032 结扎后12h61．673±0．1201．303±0．250．592±0．086 结扎后24h61．421±0．1091．204±0．1940．338±0．076假手术组61．103±0．0241．328±0．2220．144±0．04健康对照组61．000±0．0011．214±0．1940．139±0．034F值20．880．39110．40P值<0．05>0．05<0．05

3 讨论

近年来ROS在细胞缺血、缺氧中特殊的类似于第二信使的作用逐渐被研究者所重视。ROS是机体细胞线粒体氧化磷酸化过程中产生的“副产品”，生理状态下，在线粒体呼吸过程中有2%～5%的氧被转换成ROS[7]。这些“副产品”会失效，原因在于线粒体内的抗氧化系统，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还原蛋白等将对过量ROS发挥灭活作用[8]。当细胞在遭受缺血缺氧以后，细胞线粒体内会产生大量的ROS，超过线粒体内抗氧化系统灭活ROS的能力，细胞内ROS持续增多，将对细胞产生直接损伤，甚至使细胞凋亡。

本研究以急性心肌梗死大鼠为研究对象，在结扎大鼠冠状动脉后6、12、24 h检测心肌组织中的ROS含量(超氧阴离子及羟自由基)，结果显示ROS均显著上升，这种急剧上升的趋势与Zorov等[9]的研究相符，也符合他们提出的“ROS诱导、ROS释放现象”，即线粒体内产生的ROS可能导致其他心肌细胞线粒体内ROS的显著增加，并在细胞质中发出“震荡波”，诱发其他线粒体也释放ROS，导致ROS的爆发性上升。

已有文献报道，ROS可以直接激活p38蛋白，参与靶细胞损伤[10]。本研究显示，3组大鼠相比，心肌组织中p38 mRNA含量增加，可能与ROS激活p38蛋白、增加p38蛋白合成相关；p38总蛋白含量变化不大，而磷酸化的p38蛋白有明显变化趋势，结扎冠脉6 h组大鼠心肌组织中磷酸化p38蛋白含量最高，随后磷酸化的p38蛋白逐步下降。该结果与国内来丽娜等[11]的研究类似。心肌梗死后大量的ROS产生可以造成磷酸化的p38过度激活，当磷酸化的p38蛋白升高达峰值后，其含量逐步下降，推测还有潜在的机制减少p38蛋白的进一步磷酸化，这个过程可能具有保护意义。

为使S7-200 PLC与变频器能够正常通讯，不仅要编写PLC的通讯程序，还需要对变频器的参数做正确的设置，正确建立两者之间的物理接线方式，才能够实现通讯的目的[7]。

综上所述，ROS在大鼠心肌梗死以后可能通过ROS诱导、ROS释放的触发机制大量生产，并至少通过增加磷酸化p38蛋白含量的途径发挥生物学作用；大鼠心肌梗死6 h以后磷酸化p38蛋白生成量最多，此后含量逐步下降，该过程可能对心肌梗死大鼠有保护作用，详细的机制仍有有待于进一步研究。

[参考文献]

[1] 陈军喜，孙坚.脓毒症老年患者心肌线粒体氧化损伤[J].中华临床医师杂志，2016，3(6)：838-843.

[2] 郑安财，李菊香.线粒体ROS与心房颤动[J].中国病理生理杂志，2017，33(10)：1917-1920.

[3] Konstantinidis K，Whelan RS，Kitsis RN.Mechanisms of cell death in heart disease[J].Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology，2012，32(7):1552-1562.

[4] Son Y，Cheong YK，Kim NH，et al.Mitogen-activated protein kinases and reactive Oxygen species:how can ROS activate MAPK pathways[J].Journal of Signal Transduction，2011，5:791.

[5] 孙红霞.依那普利抗心肌纤维化作用及分子机制研究[D].长春：吉林大学，2008.

[6] 陈乾，徐方芳.急性心肌梗死大鼠心肌p38蛋白的表达及意义[J].宁夏医科大学学报，2012，34(3)：241-243.

[7] Kowaltowski AJ，De Souza Pinto NC,Castilho RF,et al.Mitochondria and reactive Oxygen species[J].Free Radical Biology & Medicine，2009，47(4):333-343.

[8] Orrenius S，Gogvadze V，Zhivotovsky B.Mitochondrial oxidative stress:implications for cell death[J].Annual Review of Pharmacology and Toxicology，2007，47:143-183.

[9] Zorov DB，Filburn CR，Klotz LO，et al.Reactive Oxygen species (ROS)-induced ROS release:a new phenomenon accompanying induction of the mitochondrial permeability transition in cardiac myocytes[J].The Journal of Experimental Medicine，2000，192(7):1001-1014.

[10] Kumphune S，Chattipakorn S，Chattipakorn N.Role of p38 inhibition in cardiac ischemia/reperfusion injury[J].European Journal of Clinical Pharmacology，2012，68(5):513-524.

[11] 来丽娜，宋丽华.ROS/PKC/p38 MAPK途径在山茱萸多糖抑制心肌细胞缺氧/复氧损伤的作用[J].中国病理生理杂志，2014，30(12)：2201-2205.