坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）为新生儿常见胃肠道急诊，与NEC相关的病死率高达20%～30%[1]，常见诱因如早产、肠内喂养和感染等目前已确定，但其发病机制的不确定，临床仍然缺乏明确而有效的治疗策略[2]，还缺乏早期手术干预控制病程的足够证据，NEC早期监测与预防极为关键[3]。因而需要建立NEC的可靠动物模型进行深入研究，而目前常见的建模方法均存在一定的不足。本实验造模采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法，旨在建立一种从症状表现、病理生理与生化指标等方面都与人类NEC类似，且简便易行，可重复性好的动物模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与造模方法

SD（Sprague Dawley）大鼠雌雄不限，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，许可证号：SCXK（沪）2012—0002，合格证号：0278317。30只出生3天的实验新生大鼠分2组[4，5]：①正常对照组，离开母鼠后常规喂养，不给予任何干预与刺激；②NEC模型组，离开母鼠后，采用肠内配方奶（PetAg小动物通用配方奶粉，美国PetAg公司生产，批号H3564L）喂养、缺氧-高氧暴露和冷应激的方法，即新生大鼠在灌气鼠笼中使用100%CO2持续充气环境中5 min，然后保持97%O2环境中5 min，每天两次，连续3天，并加腹膜腔注射生理盐水。第7天，杀死大鼠，取胃肠道组织（十二指肠末端至回盲部肠管）行组织病理学检测。

两组患者生活质量 VAS 评分（±s），治疗前、后情绪状态和心理状态评分（见表3）及两组患者术后生活质量VAS评分对比（见表4）显示比较差异P＜0.05。

1.2 大鼠肠道组织HE染色病理学检测

主要试剂：二甲苯（成都市科龙化工试剂厂），伊红（上海迈坤化工有限公司，批号：20120831），苏木精（SIGMA，批号：041M0014V）。

主要仪器：轮转式切片机（RM2235型，LEICA公司），病理组织漂烘仪（tec 2500型，常州市郝思琳仪器设备有限公司），显微镜（BX43型，OLYMPUS公司），隔水式恒温培养箱（PYX-DHS500BS-Ⅱ型，上海跃进医疗器械有限公司）。

采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验，以α＜0.05为显著性检验水准。

1.3 Elisa法检测炎症因子水平

NEC模型组的炎性因子（TNF-α、IL-1β和IL-6）含量均显著大于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

实验步骤：①试剂准备，使用前将所有试剂和样本平衡至室温，标准品配制。②加样及孵育，加抗体及孵育，洗涤后加HRP及孵育，洗涤后加TMB及孵育。③终止反应并测定吸光度，计算结果。标准品和样本的OD（optical density）值减去零标准的OD值，取两个复孔的均值；建立标准曲线和公式，根据所测OD值计算出各样本的浓度。

主要仪器：酶标仪（BIO-RAD Model680），洗板机（Mindray MW-12A），恒温箱（DHG-9140A型，扬州鸿都电子），高速离心机（Thermo ST16R）。

1.4 统计学方法

实验步骤：肠管组织石蜡切片，常规HE染色后镜检。

2 结果

2.1 大鼠一般情况变化

肠道病理组织采用Shiou等新的标准双盲法计分[6]，即0分：肠黏膜绒毛完整，组织结构正常；1分：轻微黏膜下和（或）固有层肿胀分离；2分：中度黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿；3分：重度黏膜下和（或）固有层分离，黏膜下和（或）肌层水肿，局部绒毛脱落；4分：肠绒毛消失伴肠坏死。病理评分大于等于2分者视为NEC。NEC模型组的评分显著大于正常组，差异有统计学意义（P＜0.01），见表1。

2.2 大鼠肠道组织HE染色病理学检测

两组别大鼠肠道组织HE染色（hematoxylin-eo⁃sin staining）在光镜下可见，如图1所示。正常组：肠黏膜上皮完整、连续，细胞与腺体排列规则，黏膜及黏膜下层无炎症细胞浸润；NEC组：肠绒毛水肿，粘膜固有层及粘膜下层大量炎症细胞浸润（以中性粒细胞和嗜酸性粒细胞为主），肠腔毛细血管充血，甚至可见肠上皮坏死。

本研究首先采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的综合应激方法建立NEC新生大鼠模型，并发现NEC大鼠的肠管组织Shiou评分及炎性因子（INF-α、IL-1β和IL-6）的水平均有升高，表现出其肠道有不同程度损伤。

NEC模型组大鼠综合应激刺激3天后出现活动减少，食奶减少，腹胀、腹泻，精神萎靡，体重下降。其中1只只因拒食乳而逐渐衰竭死亡；对照组无异常，生长发育良好，体重稳定增长，进食及排便正常。

  

图1 大鼠肠道组织HE染色光镜观察（HE,×200）

2.3 炎性因子含量比较

主要试剂：TNF-α Elisa试剂盒（CSBE11987r），IL-1β Elisa试 剂 盒（货 号 ：CSBE08055r），IL-6 Elisa试剂盒（货号：CSB-E04640r）。

 

表1 肠道病理组织Shiou计分及炎症因子水平比较

  

※ 与正常对照组比较，P＜0.01

 

组别SD大鼠∕只Shiou计分NEC模型组正常对照组t/P 14 15－4.34±0.82 ※0.41±0.70 14.12∕0.00 IL-1β 312.25±204.26 ※54.48±34.40 4.82∕0.00检测指标INF-α 42.72±18.46 ※8.73±5.70 6.81∕0.00 IL-6 2.29±0.90※0.87±0.67 4.90∕0.00

3 讨论

机械设计制造自动化就是利用先进的科学技术与网络信息技术实现机械设计、制造的过程，在传统机械设计中需要耗费更多人工与精力，冗杂的程序与计算给生产带来复杂性与难度，自动化的机械设计制造实现以后就改变了这种操作难度大的不足。一方面，自动化代表的信息技术能减少不必要的设计编程，即简化了繁重的设计制造内容；另一方面通过减少人工操作环节也间接降低了人工作业可能存在的危险性，对提高机械制造安全大有裨益。

NEC是最常见的新生儿胃肠道急诊，病死率较高。具体机制未明，早产、肠道喂养及缺氧缺血等已被证实同NEC的发生密切相关，配方乳人工喂养更是其中的高危因素。与母乳喂养相比，配方乳人工喂养能使NEC的发病率升高6～10倍，因为胃肠道中的粘液层的保护因素下降是关键环节。本文的研究证实，NEC大鼠肠绒毛水肿、充血，甚至有肠上皮坏死与缺失，且NEC大鼠肠道病理组织Shiou评分显著大于正常，显示其明显损伤及坏死，粘膜损失可能是一个独特的NEC的特点[7]。有研究表明NEC肠粘膜损伤是由氧自由基介导下导致血小板活化因子（PFA）、白三烯和TNF-α等炎性介质释放作用的结果，炎症介质释放是NEC发生的最后的共同通路或关键环节[4]。同样，研究发现，NEC模型组的炎性因子（TNF-α、IL-1β、IL-6）含量显著大于正常对照组，提示TNF-α、IL-1β、IL-6等参与NEC肠管细胞损伤和随后的细胞死亡过程，故治疗策略是否通过抑制炎症标志物和氧化应激的水平，从而有效地保护NEC诱导的回肠变性，尚需进一步确认。

目前，国内外有以下其它几种NEC建模方法[8-9]，一是缺氧-复氧，而临床上发现围生期窒息并不会引起NEC发病率的增高，用缺氧-复氧造模虽然简便，但很少出现典型的NEC症状及肠道病理变化。二是缺血-再灌注（ischemia∕reperfusion，I∕R），主要是采用肠系膜上动脉结扎法，但单纯I∕R后的早产鼠和足月新生大鼠并未出现腹胀、腹泻等症状，肠道上皮细胞及绒毛也均未见任何损伤，单纯的I∕R对肠道的损伤往往是一过性的，较少导致典型的NEC。三是注射各种炎性介质，炎症介质会造成内毒素血症，出现多器官广泛病变，且其病变好发部位与NEC患儿不同，常发生于空肠，结肠和直肠并不受累。因而采用上述单一因素造模法其成功率较低，急需改良或综合。自1974年Barlow等采用配方乳人工喂养、缺氧以及细菌接种成功建立新生大鼠NEC模型后，大部分学者都以此为基础运用早产+人工喂养+缺氧冷刺激来建模。Lodha等[4]研究表明，综合采用人工喂养+缺氧的方法对3日龄大鼠进行造模，其NEC的发生率为56%，尽管该模型的成功率仍未达到研究预期，但较上述单因素模型有显著提高，它已用于NEC肠道损伤的保护作用等研究[10-11]。

从表10的“假设方差相等”行读取数值，t值是0.1646，Sig.(双侧)是双尾T检验的显著性概率0.8725，大于0.05。可以得出结论：上行与下行的裂缝率无显著差异，这表明路面裂缝率应该与行车方向没有必然的联系。

本次研究采用肠内配方喂养、低氧高氧暴露和冷刺激的的这种综合方法建立动物模型较为理想。建模操作简便易行且成功率高，建模时间较短，可重复性好。症状表现、病理生理和生化指标等都与人类NEC类似的动物模型，可广泛适用于NEC的转化研究。

鄂早18：籼型常规早稻，湖北省黄冈市农业科学研究所选育，于2003年湖北省农作物品种审定委员会审定，2005年国家品种审定委员会审定，其稻米品质好、产量高，是湖北省多年来的早稻主导品种［4］。

在民族团结进步教育中倡导实现“双主体”模式，提升教育者与教育对象之间的互动性。加强教育者的交互性思维，使教育者与大学生在新式载体中形成积极互动，将大学生的学习、生活同教育主题有机连接起来，将民族团结进步教育内涵与大学生的精神诉求紧密结合起来，引导他们树立正确民族观念的同时建立起理性的思维方法。

参考文献：

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[2]ATHALYE JAPE G,MORE K,PATOLE S.Progress in the field of necrotising enterocolitis：year 2012[J].J Matern Fetal Neonatal Med,2013，26（07）：625-632.

[3]LIN H Y,CHANG J H,HUNG M Y,et al.Prevention of necrotizing enterocolitis in preterm very low birth weight infants:is it feasible?[J].Journal of the Formosan Medical Association，2014，113（08）：490-497.

[4]LODHA A,ASZTALOS E,MOORE A M.Cytokine levels in neonatal necrotizing enterocolitis and long-term growth and neurodevelopment[J].Acta Paediatrica，2010，99（03）：338-343.

[5]SHENG Q,LUN Z,CAI W,et al.Protective effects of hydrogen-rich saline on necrotizing enterocolitis in neonatal rats[J].Journal of Pediatric Surgery，2013，48（08）：1697-706.

[6]KOJIMA Y,SASAKIS S,LMURA M,et al.Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis[J].J Biol Chem，2011，286（14）：12123-12132.

[7]SANGILD P T,SIGGERS R H,SCHMIDT M,et al.Diet-and colonization-dependent intestinal dysfunction predisposes to necrotizing enterocolitis in preterm pigs[J].Gastroenterology,2006，130（06）：1776-1792.

[8]郑晓辉，周伟，荣箫，等.早产大鼠坏死性小肠结肠炎三种常用模型的建立及评价[J].中华围产医学杂志，2010，13（5）：408-412.

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[10]TAYMAN C,AYDEMIR S,YAKUT I,et al.TNF-α blockade efficiently reduced severe intestinal damage in necrotizing enterocolitis[J].Journal of Investigative Surgery the Official Journal of the Academy of Surgical Research，2016，29（04）：209-217.

[11]高晓燕，李思涛，肖昕.坏死性小肠结肠炎诱导新生大鼠全身炎症反应综合征动物模型的建立[J].实用儿科临床杂志，2012，27（11）：873-875.