猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)可导致断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)，它是猪圆环病毒家族中重要的成员，也是猪群中最常见的猪圆环病毒型[1-4]。

PCV2是环状、单股负链DNA 病毒，病毒基因组包含有11 个开放阅读框(Open reading frame，ORF)[5]。 ORF2主要编码Cap蛋白，Cap蛋白分子量大小约27 800，由233～234个氨基酸构成，该蛋白是PCV2唯一的结构蛋白，与猪圆环病毒2型的感染与免疫有着密切关系[6]。因此，Cap蛋白是研发PCV2疫苗和PCV2检测试剂的靶标蛋白[7-9]，但其体外表达的可溶性严重制约Cap蛋白的应用。

Fh8是肝片吸虫在感染早期分泌的蛋白，因其分子量为8 000，故命名为Fh8[10-12]。Fh8融合标签是高效的蛋白可溶性表达增强子，它的分子量小，相比现有的大融合标签具有先天优势。

上海市在2000年进行了水务体制改革，依托水务一体的体制优势，立足于水安全、水资源和水环境三位一体的发展思路，将取水、供水、用水、节水、排水、污水处理和河道治理纳入水资源的统一管理。作为加快实施最严格水资源管理制度的试点之一，上海市于2012年围绕“最严格水资源管理”启动了水资源管理系统建设，通过监控能力和信息平台两大建设任务，初步实现“现状能监、报表能传、统计能算、红线能显、考核有据、决策有助”，为上海市最严格水资源管理制度的实施和考核提供了重要支撑，为水资源科学规划、配置、调度提供重要决策依据，大大提升了水资源管理的规范化、科学化及现代化水平。

How to make clear and stable solutions of soaps at neutral pH and room temperature 5 7

1.7.1 疫苗的制备 测定经过纯化的重组蛋白浓度，用于疫苗制备。选取2个剂量的Cap 抗原10 μg和50 μg，与佐剂ISA 206分别进行乳化制备疫苗，添加免疫增强剂A(含有5 μg LTB和5 μg 沙门氏杆菌鞭毛蛋白)以提高免疫效果。配制疫苗和与动物分组情况见表 1。

为了验证多列车节能计算模型的准确性，本文以某地铁线路4站3区间进行仿真分析。其中,线路区间牵引变电所位置及各站停站时间如表1所示。

以PCV2基因组DNA为参照，获得ORF2基因，克隆到含有Fh8标签的大肠杆菌表达载体中，实现Cap蛋白的可溶性表达，免疫小鼠评估其免疫原性，为PCV2防控制剂的研发奠定基础。

（5）电机结构简单，抗冲击能力强：电动机转子无绕组和永磁体，机械强度高，能够长期耐受强冲击与强振动负载；

1 材料与方法

1.1 材料

PCV2b 基因型的强毒株，由江苏省农业科学院兽医研究所自行分离、鉴定、保存，病毒滴度为1 ml 106.25 TCID50。pCold-Fh8表达质粒，由江苏省农业科学院兽医研究所自行构建和保存。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)、T4 DNA连接酶、限制性内切酶，购买于 TaKaRa 公司。质粒提取试剂、胶回收试剂盒，购买于Axygen 公司。DH5α和BL21感受态细胞，购买于南京助研生物科技公司。猪抗PCV2多克隆抗体和HRP-羊抗猪IgG，分别购买于VRDM和 BETHYL公司。

1.2 获得优化的PCV2 ORF2基因片段

根据 GenBank已有PCV2 ORF2基因序列(登录号：KC153106.1)，参照大肠杆菌偏爱的密码子优化ORF2的稀有密码子，并在基因序列的5′端和3′端分别添加酶切位点，优化的 ORF2基因由南京金斯瑞生物技术有限公司合成，克隆入 pUC57载体，获得重组质粒 pUC57- ORF2。

人体终板作为椎间盘的一部分，在分散负荷方面起到重要作用，同时终板也是脊柱运动单位中最容易受到损伤的部位.对颈椎进行减压植骨融合后，植入的融合器会给临近的终板施加较大的载荷，导致出现不同程度的沉陷，使终板损伤，沉陷的程度跟融合器相接触的下终板抗压强度的应力分布有直接的关系.终板的抗压强度从C3-C7逐渐减小，并且除C3和C5外，其他椎体下终板强度高于上终板，同一终板下，越靠近终板中央，其抗压强度越小，外缘的抗压强度最大[7-10].因此，在设计融合器时把终板结构和抗压强度分布特点考虑进去，可以限制融合器的沉陷.

1.3 构建重组质粒

将上述重组质粒pUC57-ORF2和表达载体pCold-Fh8分别用XhoⅠ与 Eco R Ⅰ酶切。酶切产物经回收，再与pCold-Fh8连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布LB 平板(氨苄青霉素，100 μg/ml)，37 ℃过夜培养。次日，挑取单菌落接种含有氨苄青霉素的液体 LB，继续37 ℃过夜培养，双酶切鉴定质粒，阳性质粒命名为 pCold-Fh8-Cap。同时构建3个对照重组质粒pCold-Cap、pCold、pCold-Fh8。

1.4 构建重组菌和诱导表达

1.4.1 重组菌的构建 将上述重组质粒转化大肠杆菌BL21，涂布LB 平板(氨苄青霉素，100 μg/ml)。过夜培养，挑取单菌落，酶切鉴定，获得重组菌株pCold-Fh8-Cap/BL21、pCold-Cap/BL21、pCold /BL21和pCold-Fh8/BL21。

1.4.2 重组菌的诱导表达 上述的重组菌首先接种LB液体培养基，37 ℃振荡培养。次日，再以1%比例转接新鲜的LB液体培养基，37 ℃振荡培养 2～3 h后，加入终浓度为 0.1～0.5 mmol/L 的IPTG，16 ℃继续培养 18～24 h，收获细菌。

1.5 SDS-PAGE分析和Western blotting鉴定

1.5.1 SDS-PAGE分析 上述诱导培养物，各取1 ml，8 000 r/min离心10 min，收集菌体，用1/5体积的TE(pH为8.0)缓冲液重悬，SDS-PAGE分析表达情况。

2.5.1 血清PCV2特异性IgG抗体检测 连同对照小鼠，使用试剂盒检测各免疫小鼠的PCV2抗体水平，由图6可见，免疫小鼠血清OD450均值极显著(P<0.01)高于所有对照小鼠，免疫组G1(OD450=1.15)、G2(OD450=1.24)和G3(OD450=1.22)各组间平均OD450差异不显著(P>0.05)。对照组G4(OD450=0.13)和G5(OD450=0.14)血清均值低于试剂盒的质控阴性对照(OD450=0.30)。结果表明，可溶性表达的Cap蛋白具有良好的免疫原性。

她仰头静静看着我，脸色苍白而憔悴，唇边仍渗出血迹，手帕触碰到嘴角，她身体发出轻微颤抖。她一定需要温热的液体安定悲伤的中枢神经，我起身走到桌边，在玻璃杯里放了两朵胎菊，以沸水冲之，边垫上茶托移到她面前边说：“小心烫。”

1.6 蛋白质表达形式分析以及蛋白质纯化

1.6.1 蛋白质表达形式的分析 收集1 ml诱导后重组菌培养物，离心收集菌泥，用1/5 体积的TE(pH为8.0)缓冲液重悬，在冰水浴中超声裂解，1次2 s，间隔2 s，直到菌体全部破碎，离心分离菌体上清液和沉淀，上清液为可溶性蛋白，沉淀为包涵体。SDS-PAGE分别电泳上清液和沉淀，分析重组蛋白是否为可溶性表达。

1.6.2 重组蛋白的纯化 参照 His·BindTM Resin 亲和层析蛋白纯化步骤对菌体的上清液部分进行纯化，并对纯化蛋白进行SDS-PAGE分析。

1.7 重组Cap蛋白的免疫效力

5）家长评价。家长作为关注学校教学质量的重要群体，有较强的积极性和主动性帮助学校规范教师教学行为，搜集教学反馈意见，敦促教师提高业务素质，完善教学过程管理，进而提高教学质量。学校通过召开家长委员会及家长座谈会、发放家长问卷、开通信箱等形式，接受家长对学校教育教学质量、学生安全、学习环境建设等关系到学生学习成长的学校教学管理等方面的评价。

学校为展示自身风采，越来越重视宣传，需要一种更为直接的方式宣传自己。虚拟现实技术应用于学校，就是虚拟校园，能够全方位地展示学校的各种软硬件环境[1]。校内教学楼、宿舍楼、食堂及实验楼等公共设施众多，有了三维虚拟校园，新生在入学前就可以全面的了解校园的布局，交互式的查询，可以了解校园的所有信息，为尽快地适应学习生活提供方便；三维虚拟校园不只是对现实校园建筑形状、地理形态的仿真，而是对整个校园及其社会活动和经济活动在网络上的真实再现[2]。

1.7.2 免疫小鼠 参照文献[13]，将5～6周龄Balb/c雌性小鼠 60只，随机分成5组，标记为 G1～G5，每组12只，如表 1 中所示， G3组接种全病毒灭活疫苗，为南京天邦生物科技股份有限公司产品。所有疫苗皮下多点注射小鼠(试验数量为12只)。

表1 动物免疫情况

Table 1 The immunization of animal

  

组别免疫增强剂抗原佐剂G1AFh8⁃CapISA206G2AFh8⁃CapISA206G3-对照苗G4(对照1)APBSISA206G5(对照2)---

G1免疫剂量为10 μg,G2免疫剂量为50 μg,G3免疫剂量为0.2 ml。

1.7.3 PCV2 特异性抗体检测 使用圆环病毒2型抗体检测试剂盒(Synbiotics公司产品)测定小鼠血清OD450值，操作步骤参照说明书进行。所有小鼠分别于免疫前(0 d)和免疫后(28 d)采血，分离血清，保存待检。

1.7.4 PCV2 强毒攻击试验[14-15] 免疫后 28 d，所有小鼠腹腔注射PCV2b病毒(1 ml含 106.25TCID50)，每只0.1 ml，连续观察 21 d。PCR方法检测组织中PCV2 病毒，以分析免疫动物和非免疫动物病毒携带的差异，进而评价重组Cap疫苗的免疫效力。

2 结果与分析

2.1 重组表达质粒的鉴定

[2] SORDEN S D. Update on porcine circovirus and postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS) [J].Swine Health Prod, 2000, 8(3):133-136.

2.2 重组蛋白的 SDS-PAGE

经 SDS-PAGE 电泳分析，与对照菌pCold-Fh8/BL21和pCold I/BL21相比，重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21分别在35 000 (图 1)和27 000(图3)处明显多出1条蛋白质条带，说明重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和pCold-Cap/BL21在IPTG 诱导下成功获得表达，与预期结果相符。

  

1：pCold-Fh8/BL21 诱导前；2：pCold-Fh8/BL21 诱导后；3：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21 诱导前；4：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21诱导后；M：预染中分子量蛋白质标准。图1 SDS-PAGE鉴定重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21的表达Fig.1 Identification expression of recombinant bacteria pCold-Fh8-Cap/BL21 with SDS-PAGE analysis

2.3 重组蛋白的可溶性分析

诱导后的重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21和 pCold-Cap/BL21菌体，分别进行超声波破碎，SDS-PAGE 分析全菌裂解物、破碎后上清液以及破碎后沉淀。结果表明，重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21诱导表达靶蛋白大部分在上清液中，以可溶性形式存在(图 2)，而重组菌pCold-Cap/BL21目的蛋白以包涵体形式表达，存在于菌体沉淀中(图3)。

  

M：分子量蛋白质标准；1：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎全菌蛋白质；2：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎上清液； 3：重组菌 pCold-Fh8-Cap/BL21超声破碎沉淀。图2 重组蛋白fh8-Cap的可溶性分析Fig.2 The solubility of the recombinant protein fh8-Cap

  

M：蛋白质分子量标准；1：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎全菌蛋白质；2：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎上清液；3：重组菌 pCold-Cap/BL21超声破碎沉淀。图3 SDS-PAGE鉴定重组菌pCold-Cap/BL21的表达和可溶性分析Fig.3 Expression identification of recombinant bacteria pCold-Cap/BL21 with SDS-PAGE and the solubility of the recombinant protein

2.4 蛋白质纯化和Western blotting鉴定

2.4.1 蛋白质纯化 重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21超声裂解的菌体上清液经His·BindTM Resin 亲和层析柱纯化，获得高纯度可溶性重组蛋白，分子量为35 000(图4)，洗脱蛋白质的第3管浓度明显高于第1管和第2管。

2.4.2 Western blotting鉴定 对照菌pCold-Fh8/BL21和重组菌pCold-Fh8-Cap/BL21全菌裂解物，经 SDS-PAGE电泳后转膜，Western blotting 鉴定，在目的条带大小(35 000)位置出现1条明显的黑色印迹，而对照菌的泳道在相应位置则无反应条带(图5)，这说明表达产物可被猪PCV2 多克隆抗体特异性识别，具有较好的反应原性。

  

1～3：重组Cap蛋白第1～3管；M：预染中分子量蛋白质标准。图4 SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白Fig.4 The SDS-PAGE analysis of purified recombinant protein

  

1：重组菌 pColdⅠ-Fh8-Cap/BL21诱导后；2：pColdⅠ-Fh8/BL21 诱导后；M：预染中分子量蛋白质分子量标准。图5 Western blotting 鉴定重组蛋白Fig.5 Identification of the recombinant protein with Western blotting assay

2.5 免疫小鼠的免疫效力

1.5.2 Western blotting鉴定 常规方法进行半干式转印，然后将转印有Cap蛋白的转移膜放入含有5%脱脂乳的盒子中，过夜震摇孵育。次日，弃去脱脂乳，用TBST(Tris-HCl缓冲盐溶液，含有0.05% Tween 20) 溶液稀释PCV2阳性血清(1∶1 000)，室温孵育1 h，洗涤后，再用HRP-羊抗猪IgG(1∶10 000)，室温再孵育1 h，洗涤后，ECL显色分析。

  

OD450≥0.5 判为阳性。G1、G2、G3、G4、G5分别表示Cap疫苗10 μg组、Cap疫苗50 μg组、商品化疫苗组、单独佐剂组和未接种组。图6 PCV2抗体检测结果Fig.6 Detection of PCV2 specific antibody

2.5.2 攻毒小鼠的PCR检测 除G5外，所有小鼠均攻毒。于攻毒后21 d内，每周剖杀3只，取肺脏和肝脏进行检测，结果显示，G4小鼠，可以扩增出目的条带，702 bp，而G5小鼠PCR检测为阴性，说明小鼠作为PCV2攻毒模型成立。免疫组中(G1、G2和G3)，攻毒后7 d和14 d，PCR结果为阳性，第21 d，免疫组(G1、G2和G3)全部为阴性。结果表明，可溶性的重组Cap蛋白疫苗免疫后，有效阻止了PCV2在动物体内的复制(表2)。

表2 小鼠脏器PCR检测结果

Table 2 PCR detection for organs from the mice

  

监测期(d)G1G2G3G4G573/33/33/32/30/3143/32/33/33/30/3210/30/30/33/30/3

表中数据表示阳性数/总数。

3 讨 论

PCV2作为严重影响国内外养猪业发展的重要病原之一，它引起的PMWS 在世界范围内广泛流行[1]。该病毒主要侵害猪的免疫系统，并能够造成机体的免疫抑制，给国内外养猪业造成不可估量的经济损失。

Cap蛋白作为病毒唯一的结构蛋白，常被用于PCV2疫苗和诊断方法的研究[6]。昆虫细胞/杆状病毒表达系统生产的亚单位疫苗，已被广泛使用。假型杆状病毒载体疫苗、乳酸菌口服活载体疫苗、博德特氏菌载体疫苗和大肠杆菌载体疫苗正在研制中。其中大肠杆菌表达载体作为非常成熟的表达载体，拥有便于培养、生长速度快等特点，但病毒蛋白多为包涵体表达，将在一定程度上影响抗原的免疫原性等生物学特性，进而影响其广泛应用。

第二，理论自信是灵魂所在。灵魂在于高扬马克思主义旗帜。马克思主义源于那个时代又超越了那个时代，既是那个时代精神的精华又是整个人类精神的精华。中国革命、建设、改革等一切成就的取得归因于中国共产党人将马克思主义写在自己的旗帜上。习近平新时代中国特色社会主义思想，是马克思主义中国化时代化的最新理论成果，是21世纪的马克思主义，是指导中国实现建设社会主义强国目标的科学指南，因而是中国文明自信演进逻辑之灵魂所在。

Fh8肽段是肝片吸虫感染早期分泌的蛋白质，具有成为可溶性表达增强子的先天优势[11-12]。本研究构建PCV2 ORF2 和Fh8-ORF2融合基因，克隆到低温表达质粒中，均获成功表达，但只有Fh8-Cap为可溶性蛋白，解决了Cap的体外表达难题。

以小鼠为模型，评估Fh8-Cap蛋白的免疫原性[13-15]。重组蛋白免疫小鼠1次，第4周可诱导较高水平的IgG，OD450值可达1.0以上。不管低剂量(每只10 μg)还是较高剂量(每只50 μg)，均可诱导较高滴度抗体，并且剂量之间无显著差异，进一步表明Fh8-Cap具有良好的免疫原性，为研制新型亚单位疫苗和检测诊断技术奠定物质基础。

[4] 郭广富,曹军平,朱爱萍,等. 猪圆环病毒 2 型泰州株的分离鉴定[J]. 江苏农业科学,2016,44(4):294-295.

参考文献：

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构建的重组质粒pCold-Fh8-Cap、pCold-Cap、pCold-Fh8 和pCold经XhoⅠ与 Eco R Ⅰ双酶切，结果显示pCold-Fh8-Cap和pCold-Cap在紫外线下可见载体片段和 702 bp 左右目的条带，与预期片段相符，pCold-Fh8 和pCold只有载体片段。

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综上所述，本研究成功表达PCV2型Cap蛋白，借助Fh8融合标签，获得可溶性蛋白。相比对照小鼠，免疫小鼠产生高滴度抗体，并且脏器病毒载量明显降低。

[5] 代振江，王伟丞，曾智勇，等. 猪圆环病毒基因组结构与功能研究进展[J]. 畜牧与兽医，2016(3)：151-154.

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4）获得多项国家及行业荣誉称号。中海建滔、中海化学、惠州炼化、湖北大峪口分别荣获了国家发改委、工信部、中国石油和化学工业联合会颁发的甲醇、合成氨、原油加工和磷酸二铵“能效领跑者标杆企业”称号；有限公司湛江分公司等三家企业因节能工作突出分别获得全国总工会“全国五一劳动奖章”、“工人先锋号”等荣誉称号。

[9] 吴 洋，李庆伟，杨娜娜. 猪PCV2 ORF2蛋白ELISA检测方法的建立及猪场血清抗体检测分析[J]. 免疫学杂志，2015(1):71-73.

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两组围手术期指标结果见表1。前路组手术时间少于后路组，差异无统计学意义（P＞0.05）；同时，前路组术中出血显著少于后路组，差异有统计学意义（P＜0.05）；前路组术后住院天数小于后路组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

[12] COSTA S J, ALMEIDA A, CASTRO A, et al. Fusion tags for protein solubility, purification and immunogenicity in Escherichia coli: the novel Fh8 system [J]. Frontier in Microbiology, 2014,5(63):1-20.

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