猪细小病毒病 (Porcine parvovirus disease)和猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease) 均能引起猪的繁殖障碍，是危害世界养猪业的重大疫病，分别是由猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和猪圆环病毒 2 型(Porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的。这2种疾病广泛存在于世界各地种猪场，多表现为混合感染或继发感染，给养猪业带来了巨大的经济损失[1]。目前，疫苗接种是有效防控PCV2和PPV的主要措施。国内PCV2和PPV商品疫苗多为全病毒灭活疫苗。但全病毒灭活疫苗主要激发机体产生体液免疫，抗体产生的时间比较长，需要抗原量较高；另外灭活疫苗诱导细胞免疫反应能力较弱，使用免疫增强佐剂是提高现有疫苗保护效力的有效途径之一。

图2为武汉某地铁盾构隧道整体道床与左线隧道间离缝分布统计情况。由图2可知，道床与管片间离缝主要出现在3号联络通道及8号线、机场线下穿位置附近，均位于淤泥质土层。离缝分布无明显特征规律，沿纵向间断分布并非连续通长，离缝长度为14～42 m，宽度大小不等，一般为1～3 mm左右，最大深度可达到400 mm。

免疫增强佐剂可调节或增强机体的细胞及体液免疫能力，临床上常与各种疫苗配合使用，可促进机体对抗原的特异性免疫应答，增强免疫效果。免疫增强佐剂的作用机理主要有增强机体单核-巨噬细胞的吞噬功能，促进淋巴细胞增殖及产生细胞因子，提高抗原的免疫原性和稳定性等，使动物对病原微生物的抵抗力提高，防止或改善动物受到的免疫抑制，对传染性疾病、特别是病毒性传染病的防控有积极作用[2]。常用的免疫增强佐剂有CpG、Poly I: C、脂多糖(Lipolysaccharide，LPS)、咪喹莫特、胞壁酰二肽、左旋咪唑等[3-6]。

本实验室(江苏省农业科学院国家兽用生物制品工程技术研究中心)筛选获得具有良好免疫增强作用的复方免疫增强佐剂VA5，对禽用和猪用疫苗均具有显著的免疫促进作用。本研究用复方免疫增强佐剂 VA5与猪细小病毒和猪圆环病毒二联灭活疫苗混合，检测其对这2种疫苗的增强效果。

1 材料与方法

1.1 材料

猪圆环病毒PCV2-DBN-SX07 ( GenBank No．: FJ660968 )、猪细小病毒PPV-JS(微生物保藏号是：CGMCC NO.6605)为本实验室分离并储存。

1.2 病毒增殖

利用PK-15 细胞增殖PCV2病毒，使病毒含量达到每1 ml 1×107TCID50；用ST细胞增殖猪细小病毒，病毒含量达到每1 ml 1×107.5TCID50，HA效价为1∶512。

（五）病虫害防治。芦笋的主要病虫害有茎枯病、褐斑病、根腐病、蓟马、飞虱等。物理防治采用蓝光灯或蓝板诱杀飞虱；农业防治要施足优质有机肥，合理密植，清洁田园。

1.3 PPV-PCV2二联疫苗的制备

将PCV2与PPV用甲醛灭活，经灭活检验合格后，分别制备成猪细小病毒油乳剂灭活疫苗、猪圆环病毒油乳剂灭活疫苗，然后将猪细小病毒油乳剂灭活疫苗和猪圆环病毒油乳剂灭活疫苗1∶1混合，即为PPV-PCV2二联疫苗。参照文献[7]方法将VA5免疫增强佐剂配成油乳剂疫苗伴侣，将疫苗伴侣与PPV-PCV2疫苗按体积比1∶9混合，配制成含免疫增强佐剂的猪细小病毒和猪圆环病毒(二联)油乳剂灭活疫苗，即PPV-PCV2-VA5。

1.4 动物试验

1.4.1 BALB/c小鼠试验 将125只 5 周龄BALB/c小鼠随机分为5组，每组25只，分别为PPV-PCV2 0.30 ml免疫组、PPV-PCV2 0.15 ml免疫组、PPV-PCV2-VA5 0.30 ml伴侣疫苗免疫组、PPV-PCV2-VA5 0.15 ml伴侣疫苗免疫组和空白对照组。肌肉注射，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每组剖杀3只小鼠，分离淋巴细胞，用于淋巴细胞增值试验；免疫后14 d、21 d和28 d眼球采血，分离血清，用于PCV2 ELISA抗体和中和抗体检测；免疫28 d后用PCV2-DBN-SX07株(病毒滴度1 ml 1×106 TCID50)攻毒，每只小鼠腹腔注射0.25 ml，每组10只，攻毒后21 d，无菌采集小鼠脾脏，每只小鼠称取脾脏0.1 g，提取组织DNA，利用荧光定量PCR技术，检测PCV2病毒载量。

TND理论提倡邻里社区的最佳规模是半径400m，这样可以保证邻里中心到边界的距离在居民5min步行范围内。目前，工业园区的邻里中心分布已经成形，针对其服务半径不能覆盖所有社区的问题，可以考虑建设多层级的邻里中心，在覆盖盲区或边缘地带建立可以满足基本需求的小型综合服务体，并在城市层面上形成多层级的邻里中心模式。

1.5.2 PCV2中和抗体检测 将分离小鼠血清 56 ℃水浴灭活 30 min，12 000 r/min离心15 min除菌，然后连续倍比稀释至1∶1 024，再与200 TCID50的PCV-DBN-SX07株病毒液 1∶1混匀，放入37 ℃培养箱反应1 h，每个稀释度作4个重复。反应完成后加入铺满单层PK细胞的96孔细胞板中，每孔加入100 μl混合液，并补加100 μl细胞培养液，放入37 ℃、5%CO2培养箱培养。同时设阴性血清、阳性血清、病毒和正常细胞对照，4 d后进行间接免疫荧光检测。

[2] 王思芦.动物免疫增强剂的研究进展[J].中国畜牧兽医，2013，40(5):195-199.

1.5 抗体检测

1.5.1 PCV2间接 ELISA抗体检测 将原核表达的 PCV2 Cap 蛋白用包被液稀释至5 μg/ml，以1孔100 μl包被酶标板，4 ℃包被过夜，洗涤，拍干后加入300 μl 5%的脱脂奶封闭 1 h，洗涤，然后1孔加入100 μl待检血清(待检血清 1∶100 稀释后 2 倍系列稀释至第 8 孔)，并设阴性对照和阳性对照，37 ℃反应1 h，洗涤，然后加入 1∶10 000 稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠二抗，1孔100 μl，37 ℃反应1 h，洗涤，拍干后加入底物 TMB，1孔100 μl，37 ℃避光显色 15 min，最后加 2 mol/L 硫酸终止反应，1孔50 μl，10 min 内在酶标仪上读取 450 nm 波长的 OD 值。结果判定：待检血清OD450值大于 0.3 者判为阳性，以OD450值大于 0.3时的血清最大稀释倍数作为该血清的 ELISA 抗体效价；稀释的待检血清 OD450值与同稀释度下阴性血清OD450的比值(P/N)≥2.1 为阳性，以P/N值不低于 2.1时的血清最大稀释度作为该血清的 ELISA 抗体效价。

在选择耕作方法时，综合考虑当季作物的效应及其对土壤肥力的影响。例如，免耕法具有提高播种质量、保持土壤水分、减少土壤侵蚀、降低生产成本等优点。但是采用免耕法，肥料只能施于土壤表层，肥料的利用率低，特别是有机肥料增肥土壤的作用大大降低。多点生产实践证明，不管什么类型的土壤，长期免耕必然造成土壤耕层变浅，影响作物根系下扎，不利于作物抗倒伏。要推广科学施肥技术，优化肥料运筹，改进施肥方法，发挥养分协同作用，提高肥料利用率，提升农作物产量。

两次关键性任务在初次完成时，要达到80分，低于此分数的学生要在拿到分数一周内找老师咨询修改意见，并在最多五个工作日内提交修改稿。如果依然没达到80分的成绩，就要重做此项作业，并在期末考试前一周提交。这是最后的补救机会，还达不到标准将导致该门课程不合格。

1.5.3 猪细小病毒血凝抑制抗体(HI) 检测 将分离的100 μl血清 56 ℃水浴灭活 30 min 后，加入300 μl 25%白陶土悬液，混匀，置室温下反应30 min，以10 000 r/min 离心 10 min，吸取上清，加入 100 μl 20% 的豚鼠红细胞泥，振荡混匀后37 ℃反应1 h，以4 000 r/min离心 10 min，收集上清即为1∶4稀释的待检豚鼠血清。向96孔微量反应板各孔中加入25 μl磷酸缓冲盐溶液(PBS)，红细胞对照孔中加50 μl PBS。第1孔中加入经处理的待检血清25 μl，混匀，取出25 μl加至第2孔，依次类推，直至第10孔，弃去25 μl，此时待检血清的稀释度分别为1∶8、1∶16、……、1∶4 096。除红细胞对照孔外，每孔中再加入4单位(HI=22)抗原工作液25 μl，此时第11孔即为病毒对照孔，振荡混匀，置于37 ℃中反应1 h，每孔中加入0.5%豚鼠红细胞悬液25 μl，振荡混匀，置室温下(25 ℃)反应2 h，观察结果。结果判定：能抑制50%红细胞凝集的血清最高稀释倍数为被检血清HI抗体效价。

[8] 王永帅，唐 波，张雪花，等. PCV2与PPV体外混合感染猪肺泡巨噬细胞对细胞因子的影响[J].江苏农业学报，2014， 30(4): 772-778.

1.6 淋巴细胞增殖试验

在免疫后第 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每组分别取小鼠或豚鼠3只剖杀，无菌分离脾脏淋巴细胞，用1640完全培养基(含10%FBS)将淋巴细胞悬液稀释为 1 ml 5×106个，然后以每孔100 μl加入96孔细胞板。每只小鼠或豚鼠脾淋巴细胞重复6孔，分2组(每组3孔)，一组每孔加入25 μg/ml的植物血凝素(PHA)刺激，另一组加入1640完全培养基(用作阴性对照)进行刺激。于37 ℃孵育 72 h后，每孔加入20 μl浓度为5 mg/ml的MTT，孵育4 h 后，吸弃上清液，加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，待结晶完全溶解后测定每孔OD570值。计算刺激指数(SI)，SI=A1/A0，式中A1为PCV2或PPV刺激孔的OD570平均值，A0为1640完全培养基处理孔的OD570平均值。刺激指数与免疫效力呈正相关性，即刺激指数值越高表示免疫效力越好。

1.7 Real-time PCR定量检测PPV和PCV2

称取相同质量的小鼠脾脏，按照DNA提取试剂盒(TaKaRa公司产品)说明书提取病毒DNA，Real-time PCR相关引物及反应体系参照王永帅等[8]的方法。PCV2上、下游引物序列分别为5′-ATAACCCAGCCCTTCTCCTACC-3′、5′-GGCCTACGTGGTCTACATTTCC-3′；PPV上、下游引物序列分别为5′-CAACTACGCAGCAACTCCAAT-3′、5′-CAAAGCAGGCTCTTATGTCG-3′。Realtime-PCR反应体系：SYBR Premix ExTaqTM (TliRNaseH Plus)10.0 μl，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μl，PCV2/PPV DNA 1.0 μl，加超纯水补足20.0 μl。反应在罗氏荧光定量PCR仪上进行，反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，共40个循环。同时设置超纯水阴性对照。用阳性质粒模版(本实验室保存)进行实时定量PCR并绘制标准曲线，根据标准曲线方程计算样品中PCV2和PPV核酸拷贝数。

1.8 数据分析

应用SPSS 软件对数据进行统计分析，采用Duncan’s多重分析比较各组差异。

2 结 果

2.1 小鼠免疫后猪圆环病毒ELISA抗体水平

PCV2间接 ELISA抗体检测结果显示，首免后14 d，免疫组均产生了PCV2 ELISA 抗体，从14 d到28 d抗体水平逐渐增加。含免疫增强剂的PPV-PCV-VA5 0.30 ml、PPV-PCV-VA5 0.15 ml组抗体水平明显高于不加免疫增强剂的PPV-PCV 0.30 ml、PPV-PCV 0.15 ml组，差异显著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.15 ml组抗体水平与PPV-PCV 0.30 ml组抗体水平相当(图1)。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图1 免疫后各试验组小鼠 PCV2 ELISA 抗体水平Fig.1 PCV2 ELISA antibody level of each group post-immunization in BALB/c mice

2.2 小鼠免疫后猪圆环病毒中和抗体水平

对采集的小鼠血清进行PCV2中和抗体检测，结果表明PPV-PCV 0.30 ml、PPV-PCV-VA5 0.15 ml、PPV-PCV-VA5 0.30 ml免疫组在第14 d时均检测到中和抗体，中和抗体效价较低，PPV-PCV 0.15 ml组未检测到中和抗体。含免疫增强佐剂的免疫组中和抗体水平明显高于不含免疫增强佐剂的免疫组，差异显著；免疫后28 d PPV-PCV-VA5 0.30 ml组中和效价远远高于其余免疫组(图2)。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图2 免疫后各试验组小鼠PCV2中和抗体水平Fig.2 PCV2 neutralizing antibody level of each group post-immunization in BALB/c mice

2.3 豚鼠免疫后猪细小病毒血凝抑制(HI) 抗体效价

在免疫后 1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，每组分别取小鼠4只剖杀，无菌分离脾脏淋巴细胞，用PHA和1640完全培养基进行刺激，以计算刺激指数评价各免疫组小鼠脾脏淋巴细胞的增殖能力。免疫后3 d，各免疫组均出现不同程度的淋巴增值反应，随着时间的增加，刺激指数逐渐升高，且含VA5免疫增强佐剂的疫苗组淋巴细胞转化活性高于不含VA5免疫增强佐剂的疫苗组，特别是在7 d、9 d增加更加明显，差异显著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.15 ml组淋巴细胞转化活性稍高于PPV-PCV 0.30 ml组，但差异不显著(P>0.05)(图5)。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图3 免疫后各试验组豚鼠PPV HI抗体水平Fig.3 PPV HI antibody level of each group post-immunization in guinea pig

2.4 豚鼠免疫后猪细小病毒中和抗体效价

免疫后14 d各免疫组均产生中和抗体，含免疫增强佐剂的免疫组中和抗体水平明显高于不含免疫增强佐剂的免疫组，且差异显著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml组中和抗体水平稍高于PPV-PCV 0.50 ml组，差异不显著(P>0.05)；免疫后14 d、21 d和28 d PPV-PCV-VA5 0.50 ml组抗体水平一直最高，均明显高于其余免疫组(图4)。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图4 免疫后各试验组豚鼠PPV 中和抗体水平Fig.4 PPV neutralizing antibody level of each group post-immunization in guinea pig

2.5 免疫增强佐剂对免疫小鼠和豚鼠淋巴细胞转化活性的影响

分别在豚鼠免疫后14 d、21 d和28 d采血，分离血清检测PPV HI 抗体效价。检测结果(图3)显示，免疫后14 d PPV-PCV 0.50 ml组、PPV-PCV-VA5 0.50 ml组、PPV-PCV-VA5 0.25 ml组抗体效价高于1∶64(兽药申报标准)，PPV-PCV 0.25 ml组在第21 d PPV HI 抗体效价刚刚达到1∶64；含免疫增强剂的PPV-PCV-VA5 0.50 ml组抗体水平远远高于PPV-PCV 0.50 ml组，差异显著(P<0.05)，同样含免疫增强剂的PPV-PCV-VA5 0.25 ml组抗体水平远远高于PPV-PCV 0.25 ml组，差异显著(P<0.05)，其抗体水平与PPV-PCV 0.5 ml组抗体水平相当。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图5 VA5免疫增强佐剂对免疫小鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响Fig.5 Effect of immunopotentiator VA5 on spleen lymphocyte proliferation from mice immunized with vaccine

在免疫豚鼠脾脏细胞增殖试验中，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d，对照组均未测到淋巴细胞增殖反应；免疫组在免疫后3 d、5 d、7 d、9 d均检测到淋巴细胞增殖反应，含VA5 免疫增强佐剂的疫苗组淋巴细胞转化活性高于不含VA5 免疫增强佐剂的疫苗组，差异显著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml组淋巴细胞转化活性与PPV-PCV 0.50 ml组相当(图6)。

  

同一时间不同字母表示差异显著(P<0.05)。图6 VA5免疫增强佐剂对免疫豚鼠脾脏淋巴细胞增殖能力的影响Fig.6 Effect of immunopotentiator VA5 on spleen lymphocyte proliferation from guinea pig immunized with vaccine

2.6 VA5佐剂对免疫小鼠和豚鼠的免疫增强作用

攻毒后21 d，采集小鼠脾脏，提取脾脏组织DNA，利用荧光定量PCR技术检测PCV2病毒载量。结果(图7)显示，免疫组PCV2病毒载量明显低于对照组；相同免疫剂量条件下，含有免疫增强佐剂VA5的免疫组PCV2病毒载量明显低于不含免疫增强佐剂的免疫组，差异显著(P<0.05)。

“让别人觉得舒服，是最好的修养。”这句话放在任何年代都不过时，生活中有许多人却总想靠踩别人去赢得自己的自尊。有位朋友的儿子进了外企，薪水不菲，每逢亲友聚会，他就会大谈如今物价高，月薪万儿八千的人活得生不如死。接着便掰着手指头，津津有味地计算他儿子扣除五险一金、所得税，还有多少多少。在座的月薪大多不过四五千，都在“生不如死”之列，当然越听越心烦。可那位老兄浑然不觉，依旧不停地“嘚嘚”，可想而知多招人厌。

  

1：PPV-PCV 0.15 ml组；2：PPV-PCV-VA5 0.15 ml组；3：PPV-PCV 0.30 ml组；4：PPV-PCV-VA5 0.30 ml组；5：对照。不同字母表示试验组之间差异显著(P<0.05)。图7 免疫增强佐剂VA5对免疫小鼠攻毒后脾脏PCV2病毒含量的影响Fig.7 Effect of immunopotentiator VA5 on virus content in mice spleen after challenge with PCV2

攻毒后21 d，对照组豚鼠脾脏中 PPV病毒载量均显著高于免疫组(P<0.05)。相同免疫剂量条件下，含有免疫增强佐剂VA5的免疫组PPV病毒载量明显低于不含免疫增强佐剂的免疫组，差异显著(P<0.05)；PPV-PCV-VA5 0.25 ml组与PPV-PCV 0.50 ml组病毒载量相当(图8)。

  

1：PPV-PCV 0.25 ml组；2：PPV-PCV-VA5 0.25 ml组；3：PPV-PCV 0.50 ml组；4：PPV-PCV-VA5 0.50 ml组；5：对照。不同字母表示试验组之间差异显著(P<0.05)。图8 免疫增强佐剂VA5对免疫豚鼠攻毒后脾脏PPV病毒含量的影响Fig.8 Effect of immunopotentiator VA5 on virus content in guinea pig spleen after challenge with PPV

3 讨 论

VA5高效免疫增强佐剂中的聚肌胞(PolyI:C)、左旋咪唑、咪喹莫特等均为与动物相关模式识别受体结合的配体。PolyI:C是人工合成的多聚次黄嘌呤核苷酸和多聚胞嘧啶核苷酸配对后的双链产物，是一种高效干扰素诱生剂，能与巨噬细胞、树突状细胞表面的TLR3受体结合并激活细胞，增强机体的免疫应答[9]。左旋咪唑具有增强细胞功能，诱导T淋巴细胞成熟，增强外周 T 巨噬细胞和中性粒细胞的活性，还具有增加体液免疫和先天性免疫的作用[10-11]。本实验室多年研究结果证明VA5免疫复方增强佐剂在禽用疫苗上具有良好的免疫增强作用，能提高禽流感疫苗对鸡的免疫效力，有效延长抗体持续期，提高鸡新法二联苗、新流二联苗对鸡的免疫效力[12-15]。

BALB/c 小鼠和豚鼠是兽药典中现有疫苗效力检验所用动物，猪圆环病毒效力检测所用动物为小鼠，猪细小病毒效力检测所用动物为豚鼠。因此，本研究将VA5佐剂以伴侣形式与猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗混合制备成含有VA5佐剂的猪细小病毒、猪圆环病毒疫苗，免疫动物BALB/c小鼠和豚鼠并攻毒。

已有文献报道，VA5佐剂能提升猪细小-乙脑二联灭活疫苗抗体效价[16]。本研究结果显示，VA5佐剂能明显提高猪圆环病毒ELISA抗体和中和抗体效价，同样显著提高猪细小病毒HI抗体和中和抗体效价。抗体效果的提高更有利于动物机体对抗病毒的入侵，增加保护效果。淋巴细胞增殖试验结果表明VA5能提高免疫小鼠和豚鼠的淋巴细胞转化活性，淋巴细胞转化率在免疫后第5 d急剧升高，说明VA5不仅提高了细胞免疫水平，而且缩短了细胞免疫产生的时间，使疫苗更快更好地对机体产生保护作用，这与唐应华等[17]在禽流感疫苗中结果一致。免疫攻毒保护试验结果表明，含有VA5佐剂的免疫组PCV2或PPV病毒载量明显低于不含VA5的免疫组。病毒载量的降低，更直观地表明含有VA5免疫增强剂的疫苗可以有效地抑制病毒在机体内增殖、复制，从而达到保护动物机体的作用。在疫苗免疫剂量减少一半的情况下，含有VA5免疫增强佐剂的疫苗抗体效价稍高于或相当于常规疫苗抗体效价，这样不仅可以降低疫苗生产成本，更可减少动物机体对疫苗的应激反应，增加动物的生产性能，这一结果与Peipei等[18]的研究结果一致。综上所述，VA5免疫增强佐剂的添加不仅能够提高动物机体的体液免疫应答和细胞免疫应答水平，增强对机体的免疫保护作用，而且还可以减少抗原量，降低成本，具有良好的应用前景。

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1.4.2 豚鼠试验 将100只350 g 左右的豚鼠随机分为5组，每组20只，分别为PPV-PCV2 0.50 ml免疫组、PPV-PCV2 0.25 ml免疫组、PPV-PCV2-VA5 0.50 ml伴侣疫苗免疫组、PPV-PCV2-VA5 0.25 ml伴侣疫苗免疫组和空白对照组。肌肉注射，免疫后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d每组剖杀3只，分离淋巴细胞，用于淋巴细胞增值试验；免疫后14 d、21 d和28 d采血分离血清，检测 PPV HI 抗体和中和效价；免疫后28 d用PPV-JS株攻毒，攻毒剂量为1 ml(病毒滴度1 ml 1×107.0TCID50)，攻毒方式为腹腔注射，每组5只，攻毒后21 d，无菌采集豚鼠脾脏，研磨，每只称取脾脏0.1 g，提取脾脏组织DNA，利用荧光定量PCR技术，检测PPV病毒载量。

[3] KAWAI T，AKIRA S．The roles of TLRs，RLRs and NLRs in pathogen recognition[J]．IntImmunol，2009，21(4):317-337．

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研究所选取患者在入院后均接受常规吸氧以及镇静治疗,然后给予其中40例硝普钠,治疗方法为静脉滴注,治疗刚开始时用量为0.5ug/kg,每隔一分钟增加用量0.5ug/kg,达到3ug/kg时稳定用量。剩余的40例患者给予酚妥拉明,治疗方法为静脉滴注,治疗刚开始时用量为0.1mg/kg,每隔十分钟增加用量0.1mg/kg,达到2mg/kg时稳定用量。

[7] 唐应华．一种复方免疫增强剂，禽用疫苗及其制备方法：201210235427.0[P].2012-10-24.

1.5.4 猪细小病毒中和抗体检测 将分离的豚鼠血清56 ℃水浴灭活30 min，12 000 r/min离心15 min除菌，连续倍比稀释至1∶1 024后与200 TCID50的PPV JS株病毒液1∶1混匀，放入37 ℃培养箱反应60 min，每个稀释度作4个重复。反应完成后加入铺满单层ST细胞的96孔细胞板中，每孔加入100 μl混合液，并补加100 μl细胞培养液，放入37 ℃、5% CO2培养箱中培养。同时设阴性血清、阳性血清、病毒和正常细胞作对照，逐日观察并记录结果，观察5～7 d。

四是要学习和实践马克思主义关于人民民主的思想。学习这一思想的现实意义在于增强社会主义民主政治建设的自觉性，增强对社会主义民主政治理论的自信。

[9] ANNA M L，STEFAN K D，CLAUDIA M，et al．Key differences in TLR3/poly I:C signaling and cytokine induction by human primary cells: a phenomenon absent from murine cellsystems[J]．Blood，2007，110(9):3245-3252.

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Zheng等[12]提出可以利用式(7)拟合波后应力与冲击速度的关系获得动态材料参数。原则上，在实验中只需要将速度历史曲线和冲击端应力的历史曲线，分别通过高速摄影和应变仪等方法记录下来，即可得到波后应力与冲击速度的关系。但是，在实际操作中，由于波后应力的震荡较大，由此确定的材料参数具有较大的离散性，故而本文提出如下的修正方案。

[12] 唐应华，陆吉虎，吴培培，等．免疫增强剂提高禽流感疫苗效力的研究[J]．江苏农业学报，2014，30(2):344-348．

[13] TANG Y H，LU J H，WU P P，et al． Inactivated vaccine with adjuvants consisting of pattern recognition receptor agonists confers protection against avian influenza viruses in chickens[J]．Vet Microbiol，2014，172(1/2):120-128．

（5）强化考核奖惩机制。项目部的各项考核奖惩制度，应本着“奖惩结合，有功必奖，有过必罚”的原则，与班组及员工岗位职责挂钩。对班组的考核，是以工程施工的各项工序为基础，结合项目的各项管理要求，及时进行检查考核；对员工的考核，以班组为主进行，项目部也可直接对个人进行奖惩。奖励以现金为主，荣誉为辅，以充分调动员工的积极性，如我们对组织进行QC小组进行攻关活动的班组及提出“微创新”的个人均进行了较高的奖励；惩罚以督促改进为主，经济处罚为辅，对情形严重的必须及时清退。

[14] 陆吉虎，吴培培，张雪花，等. 免疫增强剂提高禽用二联苗免疫效力的研究[J].中国农业科技导报，2016，18(1):58-65.

[15] 陆吉虎，吴培培，张雪花，等． 免疫增强剂提高H9亚型禽流感灭活疫苗在SPF鸡体中细胞因子的免疫应答[J]．江苏农业学报， 2016,32(2):408-413.

[16] 唐 波，张道华，唐应华，等. 免疫增强剂提升猪用灭活疫苗免疫效力的研究[J]. 中国兽药杂志，2016, 50(6):5 - 9.

[17] 唐应华，陆吉虎，吴培培，等．免疫增强剂对禽流感疫苗免疫持续期、安全性和鸡淋巴细胞转化的影响[J]．江苏农业学报，2014，30(4):821-825．

[18] PEIPEI W，JIHU L， LEI F， et al．Antigen-sparing and enhanced efficacy of multivalent vaccines adjuvanted with immunopotentiators in chickens[J]. Frontiers in Microbiology，2017，8:927.

第三，帮助宗教界在经济上实现自养。领导宗教界独立自主自办宗教，实现自治、自传，其中很重要的一点就是培养宗教界能够不依赖于西方帝国主义的津贴，在经济上实现自力更生，自我发展。

(3)因为抛物线始终经过点A(-1，0)，且对称轴x=1，所以由对称性可知，抛物线也一定经过(3，0)，且抛物线的解析式可以写成y=ax2-2ax-3a．接着我们分类探求：