H9N2亚型禽流感病毒(AIVs)，属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属中的A型流感病毒。H9N2 AIVs于1966年首次分离于北美洲的火鸡中[1]，目前在欧亚、北非一些国家的家禽中广泛流行。中国自1992年在鸡群中首次发现H9N2 AIVs后，该病毒在家禽中迅速扩散，目前已发展为流行性病毒，是危害家禽养殖业的主要传染性病原之一 [2-5]。近年来，对于H9N2亚型禽流感病毒的研究主要集中在病毒的分离鉴定,遗传进化分析，与H5亚型和H7亚型禽流感病毒的遗传进化关系，跨物种传播风险评估等方面，并取得了一定的进展。但关于H9N2 AIVs对于家禽致病机理方面的研究却很少。

(3)基础置于基岩上，其附近有溶沟、竖向溶蚀裂隙、漏斗等，有可能是基础下岩层沿倾向于上述临空面的软弱结构面滑动。

H9N2 AIVs HA蛋白的裂解位点仅有1个或者2个不连续的碱性氨基酸，是一种低致病性的禽流感病毒，H9N2 AIVs感染只能引起鸡的轻微呼吸道症状[6]。但是，H9N2 AIVs感染能够导致大肠杆菌、鸡毒支原体和鸡传染性支气管炎病毒等病原的继发感染，从而引起明显的鸡呼吸道症状或者死亡[7]；H9N2 AIVs感染可以加重一些弱毒活疫苗的临床副反应[8]，值得注意的是，H9N2 AIVs感染还可导致鸡群的疫苗免疫失败。以上现象均说明H9N2 AIVs感染可以诱发鸡的免疫抑制，但是目前对于H9N2 AIVs的免疫抑制机制还不清楚。因此，本研究通过评估H9N2 AIVs感染对于鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗免疫应答的影响，探索H9N2 AIVs的免疫抑制机制，为鸡群中H9N2 AIVs有效防控措施的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

H9N2亚型禽流感病毒1204株由江苏省农业科学院兽医研究所分离并保存。SPF种蛋购自北京梅里亚公司，孵化后养至21日龄用于试验。

1.2 仪器和试剂

淋巴细胞刺激抗原为纯化的鸡新城疫病毒(NDV)和传染性支气管炎病毒(IBV)，由本试验室保存。鸡新城疫病和传染性支气管炎血凝抑制抗原由本试验室保存。鸡外周血淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司，鼠抗鸡CD3-FITC荧光抗体、鼠抗鸡CD4-FITC荧光抗体、鼠抗鸡CD8a-FITC荧光抗体为Southern Biotech公司产品，鸡IL-4和IFN-γELISA试剂盒购自上海酶联生物科技有限公司,检测淋巴细胞增殖活性的CCK-8试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.3 SPF鸡的感染与免疫

重复样分析合格率：采集重复样151件，占样品总数的2.34%，各元素分析合格率在85.43%～96.69%之间，均≥85%，符合规范要求。

1.4 血清中血凝抑制抗体的测定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通过翅静脉采血，分离血清，用β微量法测定血清中抗NDV和IBV的血凝抑制(Haemagglutination inhibition, HI)抗体，计算每组HI抗体滴度的平均值。

1.5 鸡外周血T淋巴细胞亚群的流式测定

[2] 陈伯伦,张泽纪,陈伟斌. 禽流感研究: I 鸡A 型流感病毒分离与血清学初步鉴定[J].中国兽医杂志, 1994，22(10):3-5.

本文运用DEA和Malmquist指数方法，测算了我国省级行政区域及三大地区 （东、中、西部）高技术产业技术创新效率，可以有针对性地采取措施，提升高技术产业的整体创新能力。结论如下：

1.6 鸡外周血T淋巴细胞抗原特异性刺激指数的测定

经淋巴细胞分离液分离得到淋巴细胞，并用尼龙毛柱过滤法对T淋巴细胞进行分离。将T淋巴细胞的浓度用RPMI 1640培养基调整为1 ml 2×106，加入96孔板，每孔100 μl，然后在相应的孔中加入含NDV、IBV或者刀豆蛋白A (Concanavalin A, ConA)刺激物的RPMI 1640培养基100 μl，3种刺激物的终含量分别为每孔1×107EID50、1×106EID50和2 μg。同时设含有淋巴细胞但只加入RPMI 1640培养基的空白对照孔，以及无淋巴细胞只加培养液的本底对照孔。将96孔板置于37 ℃、5%CO2的培养箱中培养72 h，然后每孔加入20 μl CCK-8溶液，继续孵育3.5 h，最后在酶标仪上读取D450值。不同刺激物对T细胞的刺激指数( Stimulation index, SI)计算公式为: SI = (刺激物D450值-本底对照D450值)/(空白对照D450值-本底对照D450值)。

1.7 鸡血清中细胞因子的测定

疫苗免疫后第7 d、14 d、21 d，通过翅静脉采血，分离血清，分别用鸡IL-4和IFN-γ ELISA检测试剂盒对血清中的IL-4和IFN-γ进行检测。试验操作按试剂盒说明书进行。

3.城乡差距仍然是影响基本公共服务均等化供给的主要阻碍性因素。城乡差距影响均等化指数的系数为正，说明城乡差距使得公共服务均等化程度降低。

1.8 统计分析

数据采用SPSS13.0统计分析软件进行One-Way ANOVA分析。

2 结 果

2.1 H9N2 AIVs感染对鸡新城疫和传染性支气管炎HI抗体的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行NDV和IBV血清HI抗体的测定。NDV HI抗体的测定结果(图1)显示，对照组在疫苗免疫后第7 d其NDV的HI抗体滴度为4.3,第14 d和21 d达到较高水平，分别为6.3和6.6。感染组在疫苗免疫后第7 d的NDV HI抗体滴度为3.3，第14 d和21 d的抗体滴度分别为5.6和6.3，抗体水平均低于对照组，但差异不显著。IBV HI抗体的测定结果(图1)显示，对照组在疫苗免疫后第7 d其IBV的HI抗体滴度为3.3，第14 d和21 d达到较高水平，分别为4.3和4.6。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d的抗体滴度均低于对照组，但差异不显著。

将对照组与感染组于疫苗免疫后第21 d分别进行外周血T淋巴细胞的分离，分别以ConA、NDV和IBV为刺激物，用CCK-8试剂盒对T淋巴细胞刺激指数(SI)进行测定。结果(图 3)显示，当以有丝分裂原ConA为刺激物时对照组的SI值为1.95，而感染组的SI值为1.80，但对照组与感染组之间差异并不显著。当以NDV或者IBV为免疫刺激物时，对照组的SI值分别为1.9和1.83，而感染组的SI值分别为1.57和1.6，显著低于对照组。

  

图1 鸡血清中鸡新城疫病毒(A)和传染性支气管炎病毒(B)HI抗体的效价Fig.1 HI antibody titers to newcastle disease virus(A) and infectious bronchitis virus(B) vaccine in chicken serum

2.2 H9N2 AIVs感染对鸡外周血中CD4+T淋巴细胞比率和CD8+T淋巴细胞比率的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行外周血淋巴细胞的分离，并用流式细胞仪进行T淋巴细胞的分型测定。对于CD4+T淋巴细胞的测定结果(图2)显示，对照组在免疫后7 d外周血中CD4+ T淋巴细胞的比率为31.19%，第14 d升至33.84%，第21 d达到高峰，CD4+ T淋巴细胞的比率为37.83%。感染组虽然在疫苗免疫后CD4+ T淋巴细胞比率的变化趋势与对照组相似，但感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d的CD4+ T淋巴细胞比率均低于对照组，其中在免疫后第7 d和14 d的差异达到显著水平(P<0.05)。而对于CD8+T淋巴细胞的测定结果(图2)显示，对照组在免疫后7 d外周血中CD8+ T淋巴细胞的比率为17.14%，第14 d升至19.75%，第21 d达到高峰，CD8+ T淋巴细胞的比率为20.92%。感染组在疫苗免疫后第7 d的CD8+ T淋巴细胞比率为17.97%，略高于对照组，而在免疫后第14 d其CD8+ T淋巴细胞比率出现轻微下降，并且显著低于对照组(P < 0.05)，免疫后第21 d感染组的CD8+ T淋巴细胞比率虽然升至18.77%，但仍然显著低于对照组(P<0.05)。

  

*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图2 鸡外周血中T淋巴细胞的亚型比率分析Fig.2 Assay of proportion of T lymphocyte sub-populations in peripheral blood of chicken

2.3 H9N2 AIVs感染对鸡外周血T淋巴细胞增殖活性的影响

突变年后即1981-2014年F（n，k）计算结果见表2。绘制目标函数 F（n，k）～k 和非负斜率 β（k）～k曲线如图3所示。由图3可知使β（k）最大的k值为k=3，则k=3为最优分类数，对应表2，当k=3时，汛期分期结果为1-3，4-12，13-17，即前汛期是从6月15日至6月30日，主要汛期为7月1日至8月15日，后汛期8月16日至9月10日。

将21日龄的SPF鸡分为2组，每组6只。病毒感染组通过滴鼻途径感染H9N2 AIVs，感染剂量为每只1×106.0EID50，对照组同时通过滴鼻途径接种PBS。病毒感染组和对照组均在接种后5 d，通过滴鼻途径进行鸡新城疫和传染性支气管炎二联活疫苗的免疫。以上试验均在负压条件下的隔离器内进行。

  

ConA：刀豆蛋白A；NDV：鸡新城疫病毒；IBV：鸡传染性支气管炎病毒。*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图3 鸡外周血中T淋巴细胞刺激指数分析Fig.3 Assay of stimulation index of T lymphocytes in peripheral blood of chicken

2.4 H9N2 AIVs感染对血清中IL-4和IFN-γ应答水平的影响

将对照组与感染组于疫苗免疫后第7 d、14 d和21 d分别进行血清中细胞因子IL-4和IFN-γ含量的测定。对于IL-4的测定结果(图4)显示，对照组在免疫后7 d血清中IL-4含量为217 pg/ml，第14 d和21 d分别为282 pg/ml和299 pg/ml。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IL-4含量均低于对照组，但其差异并不显著。IFN-γ的测定结果(图4)显示，对照组在免疫后第7 d和14 d血清中IFN-γ含量分别12.39 pg/ml和13.1 pg/ml，第21 d达到高峰，IFN-γ含量为14.41 pg/ml。感染组在免疫后第7 d、14 d和21 d血清中IFN-γ含量分别为11.02 pg/ml、11.59 pg/ml和13.23 pg/ml，显著低于对照组(P<0.05)。

吃完饭大家都散了，甲洛洛想想西西突然变红的脸，心里暖暖的，看到西西那浅绿的瓷碗里还剩小半碗饭，他便端起碗，一小口一小口地品味：她的胸脯肯定很大，那么厚的衣服都挺得起来，还有那屁股，软软的、滑滑的……哎！多么笨的女人，错过了多少美好的事！

  

*表示与对照组相比差异达显著水平(P<0.05)。图4 鸡血清中细胞因子IL-4和IFN-γ水平Fig.4 Assay of cytokines IL-4 and IFN-γ levels in chicken serum

3 讨 论

H9N2 AIVs感染的一个主要危害是引起鸡的免疫抑制，进而导致鸡群的疫苗免疫失败或者继发感染，但是目前对于H9N2 AIVs的免疫抑制机理仍不清楚。因此，本研究通过分析H9N2 AIVs感染对于鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒活疫苗免疫效果的影响，对该病毒感染鸡的免疫抑制机理进行了初步研究。

体液免疫应答和细胞免疫应答是适应性免疫应答的2个主要方面，也是评价疫苗免疫效果的2个主要指标。对于体液免疫应答的研究结果显示，H9N2 AIVs感染鸡后可以降低鸡血清中针对鸡新城疫病毒和传染性支气管炎病毒的抗体应答，但与对照组相比其差异并不显著。尽管如此，我们认为H9N2 AIVs感染对于疫苗体液免疫应答的影响仍然不应该被忽视。因为在集约化的高密度养殖中，氨气浓度过大和温度变化等环境因素可能会加重H9N2 AIVs感染对于鸡体免疫机能的损害[9-12]，进而促进H9N2 AIVs感染对于疫苗体液免疫应答的抑制作用，造成鸡群的疫苗免疫失败。

由于以前家禽免疫学知识和相关试剂的缺乏，对于家禽疫苗免疫效果的评价主要以体液免疫应答为主，而对于疫苗免疫所产生的细胞免疫应答被人们所忽视。但是，随着技术的发展和研究的不断深入，对于细胞免疫应答在疫苗免疫应答中的作用有了更加深入的认识，特别是目前鸡的相关免疫学试剂已经逐步健全，因此细胞免疫应答已经成为除抗体应答外另一个评价疫苗免疫效果的重要指标[13-14]。而本研究对于鸡外周血T淋巴细胞亚型测定和抗原特异性刺激指数的测定结果显示，H9N2 AIVs感染降低了鸡疫苗免疫后的CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞应答反应。

为了进一步研究H9N2 AIVs感染对于疫苗免疫应答的影响，本研究对血清中的IL-4和IFN-γ水平进行了测定。IL-4是一种Th2型细胞因子，可以诱导辅助性T细胞(Th)向Th2方向分化，并且还可以促进B细胞的增殖和抗体分泌，对体液免疫应答具有促进作用[15-17]，其含量是评价体液免疫应答水平的主要指标。本研究结果显示，H9N2 AIVs感染可降低鸡在疫苗免疫后血清中的IL-4水平，说明H9N2 AIVs感染确实在一定程度上降低了鸡的体液免疫应答能力。IFN-γ是一种Th1型细胞因子，能够活化巨噬细胞，可增加多种细胞表面MHC I类和II类分子的表达，并且可以抑制病毒的复制[18-20]，其含量是评价细胞免疫应答水平的主要指标。本研究中，H9N2 AIVs感染明显降低了鸡在新城疫病毒和传染性支气管炎病毒疫苗免疫后血清中的IFN-γ水平，说明H9N2 AIVs感染可显著降低鸡对这些疫苗的细胞免疫应答能力。

病毒感染动物后可以通过多种方式抑制机体的免疫功能。对于H5N1和H7N9亚型禽流感病毒和1918西班牙H1N1大流感病毒的研究发现，病毒感染可引起人、动物血液或者组织中的“炎性因子风暴”，导致体内的免疫应答失衡和免疫器官损伤，造成免疫抑制[21-25]。Smed-Sorensen等对H1N1亚型人季节性流感病毒的研究结果显示，H1N1病毒能够感染树突状细胞，并且使树突状细胞的抗原提呈能力下降[26]。Kodihalli等对H6N1亚型禽流感病毒的研究结果显示，病毒能够感染肺巨噬细胞，抑制巨噬细胞的吞噬功能和杀灭病原微生物[27]。而对H9N2亚型禽流感病毒的研究结果显示，病毒感染可以使鸡脾脏、胸腺、法氏囊中的细胞凋亡率升高，引起法氏囊部分滤泡髓质区内淋巴细胞的轻度减少，但外周血淋巴细胞的数量并未受到病毒感染的影响[28-29]。本研究结果显示H9N2 AIVs感染可以降低鸡的体液免疫应答和细胞免疫应答能力，并且对于细胞免疫应答的抑制作用更加显著，但这是否与病毒感染引起的细胞凋亡或者树突状细胞和巨噬细胞的免疫功能调整、变化相关还需要进一步研究。

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无菌采集鸡外周EDTA抗凝血，按照鸡淋巴细胞分离试剂盒的程序进行鸡外周血淋巴细胞的分离。将分离的淋巴细胞用PBS洗2遍，并将细胞浓度调整至1 ml 1×106，每200 μl细胞加入鼠抗CD3、CD4和CD8荧光抗体各2 μl进行染色，室温孵育40 min后用PBS洗2遍，最后将细胞用含1%小牛血清的PBS定容至200 μl。24 h内上机测定CD3+CD4+和CD3+CD8+淋巴细胞的比率。

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a)如果Label[j]>0且medarray[Label(j)]<1，则表示该标号的块连通域首次被扫描到，则Label_index=Label_index+1；medarray[Label(j)]=Label_index；Label[j]=Label_index。

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有的鱼塘自开挖后，年年养殖而不改善，势必减弱鱼塘使用功能。有的堤岸或池塘年久失修，可能会出现严重毁损或决堤的危险，必须加固改良。每年底等鱼类全部起塘后，应及时将塘水全部排干，将池底的淤泥挖起来，堆放在鱼塘的四周斜坡上面，加宽铺厚塘埂，还可把堆放不下的淤泥运到农田、菜地里作肥料。由于鱼塘清淤工作量大，人力清淤的效率较低，可使用现代机械清淤，同时配合采用泥浆泵、变压水泵清淤效果更好。

这给了周淑英极大的鼓舞和信心，在随后的岁月里，她不仅在染色上进步飞快，而且在绘画和剪刻工艺上也日臻成熟。周永明发现了女儿的剪纸天赋，就谆谆告诉女儿，学习剪纸，是需要坚韧毅力的，要有锲而不舍的精神，女孩子学习这门技艺，需要付出更多的辛劳。周淑英悟懂了父亲的愿望，她为了学习剪纸，把这门传统工艺发扬光大，做出了巨大的努力和牺牲。为了开拓眼界，增加理论及鉴赏素养，她到中央美院艺术系学习；为了参加世界妇女大会，周淑英用了几个昼夜特意创作了56朵盛开的牡丹，寓意五十六个民族在党中央的领导下，团结一心，共创辉煌；为了专心创作，更是为了学习到父亲周永明剪纸艺术的精髓，周淑英直到45岁才结婚……

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施工完成1～2个月后，对高速K53+200—K54+200路段进行聚丙烯纤维微表处施工质量检测，每隔200m对渗水系数、路面构造深度与摆值进行抽检，其检测结果如表5所示。

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要说呢，哪个工地经得住一查呐？你爸的工地上也的确存在许多漏洞，小记者不依不饶，扬言要给你爸曝光。你爸哪见得了这个啊，直接叫几个工人把他们揍了一顿，撵出去了。那不是还有些拍你爸马屁的人吗？你爸那时候是纳税大户，是地方上的财神爷，有人跟报社领导扯上了关系，反而让那个记者挨了处分。

在中国，宠物狗最迟在唐代出现，小型观赏犬已经成了贵妇圈的宠物，描绘唐朝贵妇生活的周昉《簪花仕女图》便画了两只小巧玲珑的宠物犬。这种小型观赏犬叫作“拂菻狗”，唐初从高昌传入，“高六寸，长尺余，性甚慧，能曳马衔烛，云本出拂菻国。中国有拂菻狗，自此始也”。又称“猧儿”，极其名贵，只有宫廷贵妇才养得起。

以上这两种同课异构，就是考虑了文本的文体特征和内容特点。类似于这样的同课异构还可以应用于诗歌篇目的教学，可以进行讲读与朗诵异构；散文篇目教学，可以进行讲读与写作异构等。