罗汉果[Siraitia grosvenorii (Swingle) C.Jeffrey]是单性、雌雄异株的葫芦科罗汉果属草质藤本植物，具有清热润肺、止咳祛痰、润肠通便等功效，是桂林兼具药食两用和经济效应的地方特色植物，主产于桂林的永福县和临桂县[1-2]。罗汉果需雌花、雄花成功授粉后才能坐果，从果实中提取的有效成分甜苷V是甜度高、热量低、安全无毒的天然甜味剂，是肥胖者和糖尿病患者理想的代用糖[3]。近年来，甜苷V作为新型食品甜味剂已被国内外市场广泛接受，需求量逐年增长，但由于成本较高，仅能在高端产品中使用，这成了制约罗汉果拓宽市场份额的主要问题。因此，为了提高产量，降低生产成本，促进甜苷V在全球商品中的广泛使用，产量高、甜苷V含量高、抗病性强等成为罗汉果品种培育的新目标。

种质资源为新品种培育提供材料来源，是开展种质创新必不可少的基础。本研究室一直重视且坚持开展罗汉果不同种质的收集、保存和选育，建立了罗汉果种质资源迁地保护圃，保存有航天、无籽、野生和栽培4类特异种质的优良品种(系)。其中，航天早熟突变体和低甜苷含量突变体均是在2014-2016年罗汉果航天种子选育过程中首次发现的，该早熟雌株不仅可使果实提早15～20 d成熟，并且甜苷含量接近常规果实，还可有效提高桂林地区罗汉果露地种植一年两熟的可操作性，增加采果批次，从而提高丰产的潜力。与常规果实相比，低甜苷含量突变体的果实虽然表现出过低的甜苷含量，但对研究甜苷Ⅴ代谢途径调控机理而言，是非常好的材料，对今后培育高甜苷罗汉果品种具有重要的科学意义。三倍体无籽罗汉果具备丰产性强，甜苷Ⅴ含量高，不含种子或少种子等优势，是非常值得关注的种质。罗汉果野生资源也是宝贵的育种材料，而且绝大多数野生罗汉果很难分辨雌雄，或需种植几年才会开花结实，所以可区分雌雄的野生种质对选育来说非常难得。本研究保存有已知雌雄的野生青皮果、红毛果、冬瓜果以及在罗汉果育种研究中新收集到的湖南永州、广西百色、柳州雅瑶乡等地的野生资源，这些都为杂交育种和品种改良研究提供了宝贵的新材料。

简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)分子标记技术操作简单、快速，在辅助育种方面具有可有效减少盲目性，缩短育种时间和周期的优点。为充分利用航天、无籽、野生和栽培等罗汉果种质，尽早选育出早熟、高产、高甜苷、高抗性或其他优良性状综合一体的罗汉果新品种，本研究拟利用ISSR技术对21份罗汉果特异种质资源进行遗传背景差异分析及杂交优势预测，构建罗汉果种质资源的DNA指纹图谱、UPGMA聚类图，以期为今后罗汉果种质资源的鉴定，新品种的培育以及知识产权保护等提供分子生物学依据。

对照组患者选择常规护理干预，观察组患者选择早期康复护理，具体内容主要为：（1）基础护理，密切观察患者生命体征的变化，维持肢体的功能位；（2）功能训练，根据患者具体病情选择针对性的体位，指导患者定期进行体位变化，2 h翻身一次，由被动运动逐渐变为主动运动。关节的锻炼时间为10 min，3～5次/d；（3）精细功能的锻炼，指导患者完成摩擦毛巾、手指板分离、键盘锻炼、写字等，加强患者的手指功能。

1 材料与方法

1.1 材料

采集罗汉果不同特异种质的新鲜叶片，用硅胶密封保存后带回实验室备用。试验材料具体来源如表1显示。

1.2 方法

ISSR分析结果中的遗传相似性系数为 0.656～0.896，而综合相关文献[12,14-16]，罗汉果的遗传相似性系数为0.511～1.000，表明本研究所选择的21份罗汉果材料之间虽然有亲缘关系较近的，但也存在较大的遗传变异，其中S18、S19、S16和S17等野生种质与桂林主产区的野生种质之间以及诱变培育的航天种质之间都产生了较大的遗传差异。所以，在聚类图中，S19、S18、S17各自聚为第二类、第四类和第五类，而S16和桂林地区的大部分野生种质聚于第一类。在第一类和第二类中，因诱变培育相同的S2与S3以及S4与S5，因地域和品种来源相同或相近的S10与S11，S13与S14，S15与S20，S7与S19先分别两两聚在一起，另外S1和S16也同样聚在一起，说明航天S1与另2个航天种质(S2和S3)产生了一定的遗传分化，而与S16的遗传相似性更大。说明聚类结果与罗汉果种质、人工选择、品种、地理分布等有一定的相关性，这与彭云涛等[10]和戴俊等[14]的研究结果是一致的。另外，在分析罗汉果不同种质的ISSR遗传差异时，发现19个引物的电泳图谱中的5个，可根据特征带的有或无，构建指纹图谱并直观地将21份材料区分开来。DNA指纹图谱可以为罗汉果提供一种快速、准确的鉴别方法，而且可将ISSR标记中特异条带割胶回收、克隆和测序，转化成特异性和稳定性更好的序列特征性扩增区域(SCAR)标记，该标记对植物种间和种内水平都有良好的鉴定效果[17]。

1.2.2 PCR-ISSR反应体系和反应程序 反应体系及反应程序参照周俊亚等[5]方法，反应体系中的ISSR引物为0.5 μmol/L，模板DNA约50 ng，其他按照TaKaRa公司EmeraldAmp© Max PCR Master Mix的说明书操作。在PCR仪(BIO-RAD公司产品)上进行扩增反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性1 min，52 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，40个循环；72 ℃延伸7 min。退火温度因引物的扩增效果不同而稍有调整，具体见表2。

1.2.3 电泳检测 PCR扩增产物采用2%的琼脂糖凝胶电泳，EB染色后在UVP凝胶成像系统中显影、拍照。

表1 罗汉果特异种质资源

Table 1 The special germplasm resources of Siraitia grosvenorii

  

编号 品种雌雄 采集地S1航天早熟突变体♀广西植物研究所种质圃S2航天甜苷突变体♀广西植物研究所种质圃S3航天优良雄株♂广西植物研究所种质圃S4无籽优良株系1♀广西植物研究所种质圃S5无籽优良株系2♀广西植物研究所种质圃S6野生红毛果♀桂林永福县龙江乡S7野生红毛果♂桂林永福县龙江乡S8野生青皮果♀桂林永福县龙江乡S9野生♂桂林永福县龙江乡S10野生爆棚果-桂林永福县龙江乡S11野生-桂林永福县保安乡S12野生-桂林兴安县猫儿山S13野生♂桂林兴安县猫儿山S14野生-桂林兴安县溶江镇S15野生-桂林临桂县茶洞乡S16野生冬瓜果♀柳州融安县雅瑶乡S17野生-柳州金秀县长垌乡平办屯S18野生♀湖南永州双牌县茶林镇S19野生-百色泮水乡S20栽培优良雌株♀广西植物研究所种质圃S21栽培优良雄株♂广西植物研究所种质圃

-:未知雌雄，即该品种罗汉果没有开花结果，故还不清楚是雄株还是雌株；♀：雌株；♂：雄株。

1.2.5 ISSR数据统计与分析 ISSR为显性标记，同一引物的扩增产物在相同的迁移位置上有扩增条带的记录为1，无扩增条带的记录为0，构建0和1的原始矩阵。利用Gen AlEx6.5软件[6-7]计算遗传相似性系数和遗传距离[8]，用NTSYSpc Version 2.10 e[9]软件构建UPGMA聚类图。

1.2.4 引物筛选 以21份罗汉果DNA为模板，对100条ISSR通用引物进行筛选，从中筛选出19条扩增重复性好、稳定、条带清晰且具有多态性的引物，引物名称和序列如表2显示。

2 结果与分析

2.1 DNA 检测

由琼脂糖凝胶电泳检测结果可知，总DNA条带亮度高、集中、清晰，21个DNA的λ260/280为2.00～2.17，λ260/230为1.77～2.04，DNA浓度为 1 083.0～4 003.3 ng/μl。可见，本试验提取的罗汉果总DNA具有较高的完整性，浓度高，质量好，可用于后续研究。

2.2 遗传差异分析

2.2.1 引物多态性分析 从100条ISSR引物中选出19条多态性理想的引物，各引物的扩增总条带数、多态性条带数和多态百分比如表2显示。19条引物共扩增出212个条带，其中155条具有多态性，多态性条带的百分比为73.11%。不同引物扩增出的条带数为 5～17条，多态性条带数为 3～16条，具有较高的多态百分比 42.86%～100.00%。其中引物889的扩增图谱如图1显示。

表2 19条简单序列重复区间扩增多态性(ISSR)引物扩增条带数与多态性比率

Table 2 Polymorphism rate and the number of bands amplified by 19 inter-simple sequence repeat (ISSR) primers

  

引物序列退火温度(℃)扩增总条带数多态性条带数多态性条带百分比(%)808(AG)8C5212866．67810(GA)8T528562．50811(GA)8C529555．56826(AC)8C525360．00830(TG)8G5210990．00834(AG)8YT5210660．00836(AG)8YA5010880．00840(GA)8YT50161168．75841(GA)8YC5010770．00842(GA)8YG5013969．23856(AC)8YA52171482．35859(TG)8RC50141392．86861(ACC)6527342．86868(GAA)6529777．78873(GACA)4521616100．00888BDB(CA)7529555．56889DBD(AC)75213969．23890VHV(GT)75212866．67891HVH(TG)75212975．00

罗汉果是异花授粉植物，通过选择优良的亲本杂交可使果实或子代获得理想的性状。杂种优势与遗传差异大小有较强的相关性，因而遗传距离可作为杂交亲本选配的一个重要参数，选择遗传距离较远且差异较大的亲本杂交，可能会获得较好的效果[11]。根据21份罗汉果材料中不同雌×雄的遗传距离，以及罗汉果杂交后代具有母性遗传的特征[12-13]，在S1、S4、S5、S6、S8、S16、S18、S20的8个雌株杂交组合中，优先关注遗传差异最大的前2个组合，即初步预测可获得杂交优势的19个组合有：S1×S7、S1×S13和S1×S9，S4×S9和S4×S7，S5×S9和S5×S7，S6×S7和S6×S13，S8×S7、S8×S13和S8×S9，S16×S7、S16×S13和S16×S9，S18×S21和S18×S3，S20×S9和S20×S7。另外，由于雌株S2是表现微甜苷含量的航天突变体，故从有利于研究甜苷V代谢调控机理的角度来看，S2×S3(遗传差异最小)是极有可能获得甜苷含量最低果实的杂交优势组合。

作者简介： 卜琰，女，湖南常德人，常德市安乡县教师进修学校专任教师，讲师，本科学历，研究方向：农村中小学教师培训。

据悉，云南电网荣获“中国最佳客户中心——卓越客户服务(中型客户中心)”奖项是南方电网 2018年唯一获此殊荣的企业。同时获此奖项的企业还有杭州市12345市场公开电话、天安人寿保险股份有限公司、广州12345政府服务热线、上海电信百事应信息有限公司。(巴晓华 何玲 孟维丽娅 )

图7所示为加热温度为460℃、500℃和540℃，保温时间为30min、35min、40min和45min条件下退火时薄壁铜管抗拉强度的变化曲线。

  

M：Marker；S1～S21见表1。图1 引物 889 对21份材料的ISSR扩增图谱Fig.1 ISSR profiles amplified from DNA of 21 individuals using primer 889

表3 ISSR 指纹图谱鉴别罗汉果特异种质的统计结果

Table 3 The identification results of special germplasm using ISSR fingerprinting

  

引物号特征条带位置(bp)特征带 可鉴别的种质编号841500无S7、S13750有S1、S5、S15、S20800有S4、S8、S9、S21850无S3、S4、S7、S10、S12、S13、S17、S18、S191200有S2、S3、S4、S5、S7、S9、S161300有S1、S3、S4、S5、S6、S15、S16、S20、S21856700有S3、S8、S9、S11、S14、S18、S191200有S1、S2、S4、S5、S9、S11、S15、S20、S211250有S9868350无S1、S5、S8、S16、S17、S18、S20480有S6、S8800有S8、S11、S15900无S5、S13、S181400无S4、S18、S21873350有S7、S14、S15400有S7、S14510有S3、S8、S14、S15、S17610有S6、S8、S10、S11、S13、S14、S15、S17、S18、S20700有S4、S12、S15、S16、S17、S18、S19、S20800有S2、S7、S9、S12、S13850有S2、S8、S12900有S1、S2、S3、S7、S10、S12、S13、S161180有S2、S8、S12、S181200有S1、S7、S181400无S7、S13、S17、S181550有S1、S2、S3、S17891480无S19710有S18750无S101000有S181450无S17、S18

21份材料的UPGMA聚类图(图2)显示，S15(野生，桂林临桂县茶洞乡)与S20(栽培优良雌株)最先聚在一起，具有最高的遗传相似性系数，可推测该栽培优良雌株由临桂县茶洞乡的野生种质选育或杂交而来。其次，具有较高相似性系数的是S1(航天早熟突变体♀)与S16(野生冬瓜果♀，柳州融安县雅瑶乡)、S10(野生爆棚果，桂林永福县龙江乡)与S11(野生，桂林永福县保安乡)、S2(航天甜苷突变体♀)与S3(航天优良雄株)。野生种质S10与S11以及航天种质S2与S3是由于区域相近或来源相同而聚在一起的，而同为航天诱变种质的S1与S2、S3的遗传相似性系数均低于其与S16，说明S1与S2、S3产生了一定的遗传突变和分化，同时也说明S1突变体在DNA或性状上与S16更接近。另外，2个种质聚在一起的还有由多倍体诱变选育出来的S4(无籽优良♀株系1)与S5(无籽优良♀株系2)、S13(野生♂，桂林兴安县猫儿山)与S14(野生，桂林兴安县溶江镇)、S7(野生红毛果♂，桂林永福县龙江乡)与S19(野生，百色泮水乡)。

2.2.3 遗传相似性系数、遗传距离及聚类分析 21份材料间的遗传相似性系数为 0.656～0.896，其中S7与S17间的遗传相似性系数最低(0.656)，遗传距离最高(0.422)，而S15与S20间的遗传相似性系数最高(0.896)，遗传距离最小(0.110)。

在相似性系数为0.795处，21份罗汉果特异种质可以分为5类，第一类为S1、S16、S6、S15、S20、S10、S11、S21、S4、S5、S8、S13、S14，第二类为S2、S3、S12、S7、S19，第三类为S9，第四类为S18，第五类为S17。整体上看，在桂林地区采集的大部分野生种质聚在第一类，只有S12、S7、S19聚在第二类，而S9、S18、S17则各自单独一支为第三类、第四类和第五类，与其他材料相距较远。新采集的野生种质柳州融安县雅瑶乡S16，由于紧邻桂林永福龙江乡，所以它也聚在第一类，而S19、S18、S17由于地理位置与桂林相距较远，所以基本上与桂林地区种质的遗传差异较大，但S19与桂林野生种质的相似性系数较大，极有可能是从桂林地区扩散出去的。本研究对罗汉果种质的遗传距离及地理分布的研究结果与前人的结果[10]一致，即野生种质间的遗传距离与地理距离有相关性。

从决策层反馈的信息来看，相关政策将进一步向水肥一体化方式倾斜，《国务院办公厅关于推进农业水价综合改革的意见》国办发〔2016〕2号文件，《关于扎实推进农业水价综合改革的通知》发改价格〔2017〕1080文件都在诠释引导农业水价改革力度，逐步引导控制农业用水总量。专家也认为，要解决化肥利用率低，以及水资源和土壤现状的矛盾，发展节水农业、实现水肥一体化是极佳的“三位一体”解决方案。不言而喻，减少化肥使用，水、肥资源高效利用正在成为科学普及的物化技术，推广水溶肥、水肥一体化技术成为必然趋势。

从雌雄株系的角度看，航天、无籽、栽培和野生种质的雌株大多都聚在第一类，只有S2和S18分别在第二类和第四类。雄株S21和S13聚在第一类，雄株S3和S7聚在第二类，雄株S9在第三类。

  

图2 21个样本间基于遗传相似性系数的UPGMA聚类图Fig.2 UPGMA dendrogram for 21 individuals based on genetic similarity coefficients

2.3 杂交优势亲本的预测

2.2.2 DNA指纹图谱构建 为了更好地在分子水平上了解罗汉果各特异种质的品种(系)特性和差异，以便为今后在新品种申请、保护等方面提供理论和技术指导，本研究在19个ISSR多态性引物扩增图谱中，选择841、856、868、873和891共5个引物构建可区分21个种质的DNA指纹图谱。特征条带是进行种质或类型鉴别的重要指标，21个种质的特征带位置具体如表3显示。

结合上述20个杂交优势组合的亲本预测结果和聚类图可看出，由于雌株大多数在聚类图的第一类，所以在第二类、第三类的雄株S3、S7、S9是较好的雄性亲本材料，因此在罗汉果品种的选育上应先考虑这3个雄株的杂交果实和子代。另外，遗传距离较远的或单独聚为一类的野生种质S12、S19、S17，在开花可区分雌雄后也是非常值得关注的优良育种材料。

3 讨 论

种质资源是育种原始创新的物质基础，随着罗汉果产品在国内外销售量的快速增长，当前主栽品种已无法完全满足市场需求。为了获得适应市场的新品种，并有效提高育种效率，在已收集的罗汉果不同特异种质资源的基础上，利用分子生物学手段开展遗传差异及其杂交优势的亲本预测是非常有必要并具有重要意义的。

1.2.1 DNA的提取和质量检测 采用改良CTAB(2×)法[4]提取罗汉果干燥叶片的总DNA，保存于-20 ℃的冰箱中备用。用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性，Nano Drop TM/ND-2000C仪检测DNA浓度和纯度。

对于雌雄异株的植株来说，其遗传距离及聚类图可应用于杂交优势的选择上，并取得了良好效果，如桑树[18]、杨树[19]、银杏[20]等。因此，利用ISSR的遗传距离及聚类图对航天早熟突变体、航天甜苷突变体、无籽优良品系和野生品种等开展杂交优势亲本的预测是可行的。在杂交组配时，遗传距离最高的亲本之间可能会获得理想的杂交优势，但遗传距离太高不一定是最好的组合，因为遗传距离过高会降低亲本之间的同源性，可能导致杂交方向偏向远缘，使其利用价值受到影响。同样，遗传距离也不能过低，过低则使得亲本间趋于同源，可能减弱或达不到利用杂种优势的效果。罗汉果杂交后代从母本继承的遗传物质较多，具有母性遗传倾向[12-13]，即在罗汉果杂交选育中母本具有的优良性状显得尤为重要。所以，在对除了S2以外的8个母本进行杂交优势亲本预测时，重点关注了遗传距离最远的前2个组合，这些亲本的组合有望获得具有优势的果实或子代。同时值得注意的是，航天甜苷突变体S2的微甜苷含量表现，S2与雄株杂交后均会获得低甜苷的果实，S2与遗传距离最近的S3杂交极有可能获得比与其他雄株杂交甜苷含量更低的果实，这对甜苷V代谢调控机理的研究是有利的。可见，杂交优势亲本的预测对于迫切需要选育新品种的罗汉果产业来说是非常有帮助的。

ICME-14申办委员会向ICMI提交“Final Bid”，它是原标书的修改和补充，吸收了答辩会和考察过程形成的意见，对中国和上海承诺的事项做了更明确的表述．“Final Bid”是协议书的附件，具有法律效应，与ICMI EC讨论并形成“ICME-14，Shanghai，2020”协议书．

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色素沉着绒毛结节性滑膜炎（PVNS）的发病率较低，属于临床比较少见的滑膜增生性病变，多发于膝关节，其他关节也可诱发此病。发病初期症状不明显，随着病情进展，逐渐引发发病部位疼痛感，如治疗不及时，将会引发关节部位反复出血，降低患者生活质量[1]。此次研究将我院于2015年1月—2017年12月收治的24例PVNS影像学诊断资料作为研究对象，分析其影像学表现特征。

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他离过婚，法院将两个孩子都判给了他。现在的妻子是小他十来岁的黄花大闺女，按当时的计划生育政策，他不能再生育了，可是女方非常想有一个自己的孩子，做一个体面完整的女人，也是她父母的心愿，如果不生孩子他无法稳定娇妻的情绪，更担心的是缺少维系婚姻的纽带。一旦超生不仅面临巨额罚款，厂长也会被撸掉。倒是刘镇长给他吃了颗定心丸，只要他能全力为海绵制品厂年创产值一千万，利税一百万，刘镇长愿意为他生孩子的事去做工作。刘镇长的良苦用心是为了能稳住乡镇企业的人才。毕竟事在人为，那时，产值可比生殖重要得多。

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应用型高校创新人才培养还有很长的路要走，需要国家、社会各界、企业和学校的共同努力。高校只有紧紧围绕经济发展和社会服务的需要来培养人才,才能增强学生的就业能力,才能解决创新人才培养与用工单位需求的矛盾。适应社会需要是学校生存之道，是学校发展的必由之路。

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线上线下翻转课堂教学中，线下课堂的教师如果由在线开放课程的主讲教师来担任，教学效果会有所保证；如果由其他非主讲教师来担任，课堂教学效果则会因人而异。因此，开展线上线下双师课堂模式“1+1”模式或者“1+N”模式，可有效提升在线开放课程的教学质量和效果。采用该教学模式，可以让所有学习者直接获得主讲教师的授课与指导，这对于师资比较贫瘠的院校，师生会更加受益，因此该方式对于教育资源公平化也有帮助。线下辅导教师在观摩和辅助名师的教学过程中，可以学到名师的教学理念与教学方法；而辅导教师的经验和反馈，对主讲教师持续优化课程也提供了参考。