骨髓干细胞在特定的机体环境下能分化发展成血管内皮细胞，并可分泌血管生长因子，参与组织损伤的修复和血管的再生；另外骨髓干细胞采集方便、取自自身，因此没有排斥反应，也避免了伦理学纠纷而具有特殊的优势[1-3]。糖尿病是一组以慢性血糖水平增高为特征的代谢性疾病，是我国常见病、多发病，与非糖尿病人群相比较，其缺血性疾病患病率极高且发病年龄轻、病情进展快[4，5]。目前，骨髓干细胞在糖尿病患者中治疗性血管新生的研究得到了广泛的开展，然而大部分研究结果显示该项治疗在合并有糖尿病状态下疗效欠佳，并认为与高血糖毒性有必然的联系[6，7]。我们认为高血糖可促进骨髓干细胞的衰老加速，从而导致该项治疗疗效降低，然而目前相关研究甚少。因此，我们对高血糖状态下骨髓干细胞衰老是否加速进行了探讨，现报告如下。

当面临种种“现代性困境”时，人们需要基于现实、回首过去，通过经典文献置身于古人的理解角度、视域和方法，寻找发展的起点和动力。为此，我们要深入挖掘和弘扬中外优秀文化中重民主、讲诚义、崇正直、尚和合、求大同的时代价值，并进行系统规划组织。在各种印刷文献日渐增多时，人们为了便于管理和使用，采取了各种分类序化文献的方法。在数字网络技术高速发展的时代，人们对知识信息的组织管理单元得以进一步细化，在各种信息平台、信息共享中心、信息论坛普遍堀起的时候，我们对经典文献中“核心价值”的挖掘和体系组织更方便快捷。

1　材料与方法

1.1　材料　6-8周龄雄性BALB/c小鼠，体质量（20.5±1.34）g，均在无病理条件下自由进食进水。链脲佐 菌 素　（STZ）、DAPI 购 自 Sigma 公 司 ；FITC-conjugated　rat　anti-mouse　CD117　(c-Kit)monoclonal antibody购自美国 BD Pharmingen公司；anti-FITC microbeads购自德国Miltenyi Biotech公司，抗γ-H2AX抗体 (Polyclonal Rabbit anti-γ-H2AX购自abcam公司（美国）；抗P16INK4a抗体(Polyclonal Rabbit anti-P16INK4a)购自Santa Cruz公司（美国)；抗 β-actin抗体(Polyclonal rabbit antiβ-actin)购自 Cell Signaling 公司（美国）；二抗 Goat anti-Rabbit IgG-HRP购自KPL公司（美国）；强生血糖仪（美国）；MiniMACS Separator(德国)；NIKON倒置荧光显微镜（日本）；蛋白电泳仪（美国），垂直电泳槽（美国）；转移电泳槽（美国）；精密电子天平(德国)；低温高速离心机（德国）。

1.2　方法

1.2.1　STZ糖尿病小鼠模型的制备及分组 6-8周龄的 BALB/c雄性小鼠腹腔注射 STZ（60mg/kg，pH4.4，无菌柠檬酸缓冲液稀释，每天腹腔注射1次，连续5d），注射结束后第3d测随机血糖，高于15mmol/L认为糖尿病模型制备成功。正常对照组：6-8周龄的BALB/c雄性小鼠腹腔注射无菌柠檬酸缓冲液稀释，每天腹腔注射1次，连续5d。制模成功8周后，用于以下实验分组。

2.2　高血糖对骨髓干细胞γ-H2AX表达量的影响通过荧光共聚焦显微镜观察两组骨髓干细胞DSB标志物γ-H2AX（绿色荧光）表达情况，我们发现与正常对照组相比，糖尿病组骨髓干细胞γ-H2AX表达更为明显，两组差异具有统计学意义 （P=0.0006，n=3）。 （见图 1）

缺血性疾病的发病率呈逐年上升趋势，传统疗法主要为药物缓解和手术再通，但对于严重缺血性疾病疗效欠佳[8，9]。近年来，骨髓干细胞移植治疗重症缺血性疾病作为一种新疗法成为关注的焦点[1-3]。骨髓干细胞是一种具有高度自我更新、强分化潜能及多重分化活性的细胞[10，11]，其细胞标志物包括CD117及 CD34[12，13]。众多国内外研究表明，移植到缺血区的骨髓干细胞，可通过归巢、聚集并融入缺血组织附近，分化发展成血管内皮细胞及分泌血管生长因子，移植细胞的存活率与治疗效果密切相关[14，15]。

在《初级会计实务》这本教材中，应收利息和股利推荐，直接计入交易性金融资产成本中，而在《中级会计实务》这本教材中，应收利息和股利，则应单独核算，不计入交易性金融资产成本中。这两本会计教材是会计工作者的“圣经”指导，并且会根据，时事和社会经济的变化，不断的进行改进和修订，可以说是国内会计工作，最具有权威和时效的会计教材，但是，在两本教材中，竟然会出现明显的应收利息和股利核算工作的差异，这对于会计工作者在进行交易性金融资产成本核算时，造成困惑，也会影响企业核算交易资产成本，造成交易性金融资产核算工作的不准确性。

2.3　高血糖对骨髓干细胞γ-H2AX以及p16蛋白表达的影响　通过Western blot分析两组骨髓干细胞DSB标志物γ-H2AX以及衰老相关蛋白p16蛋白表达情况，我们发现与正常对照组相比、糖尿病组骨髓干细胞γ-H2AX以及p16蛋白表达明显增强。（见图2）

1.2.5　统计学处理　采用SPSS 13.0统计软件，数据以（x±s）表示，组间比较采用 t检验。 P≤0.05 为有统计学差异。

2.1　两组体重及血糖情况　造模前两组小鼠体重[正常对照组（19.91±0.84）g，糖尿病组（20.21±0.97）g]；血糖[正常对照组（7.68±0.67）mmol/L，糖尿病组（7.60±0.92）mmol/L]，差异无统计学意义。造模成功8周后，正常对照组及糖尿病组体重分别为（28.14±0.83）g、（21.13±0.79）g，血糖分别为（7.85±0.66）mmol/L、（21.28±1.46）mmol/L， 糖尿病组与正常对照组相比多饮、多尿症状较重，体重明显低下(P＜0.001)，糖尿病组血糖水平明显高于正常对照组(P＜0.001)。

2　结果

励志教育是我国高等教育的重要组成部分，不论是在思想观念层面还是实践层面，高校教育工作者都要以各具个性、富有特色的方式灵活开展励志教育，对大学生的当下处境和现实使命进行清晰解读和前瞻性引领，让大学生最大限度地发挥自身潜能。具体而言，大学励志教育对学生能起到思想信念指引、育人文化涵养和学业目标导向等功能。

1.2.2　骨髓CD117+干细胞的分离　分别测量两组的体质量及血糖后，将小鼠麻醉，腹主动脉脱血后，在无菌的条件下取股骨及胫骨，用phosphatebuffered saline（PBS）冲洗骨髓腔，收集细胞悬液，使用比重离心液去除红细胞后，使用免疫磁珠分离法（MACS）分离出 CD117+细胞。

  

图1　A：荧光共聚焦显微镜下观察高血糖对骨髓干细胞γ-H2AX表达量的影响（10倍分辨率，细胞核显示蓝色荧光，γ-H2AX显示绿色荧光）B：两组骨髓干细胞荧光染色后，γ-H2AX阳性细胞百分比定量结果（STZ：糖尿病组；WT：对照组）；*P＜0.001

国内的一项多中心调查研究显示，超过90%的妊娠期高血压疾病患者对于疾病的整体认识匮乏，而80%以上的患者除疾病带来的身体上的痛苦之外，还承受着疾病造成的心理负担[10]。有学者指出，除了妊娠期高血压疾病的规范治疗和护理之外，孕妇自身对于疾病的认识和健康行为也是促进良好预后的关键[11]。近年来，随着围产期保健意识的不断提高，临床上开始注重对妊娠期高血压疾病患者的认知和行为进行干预，通过提高患者对自身疾病的自我认知，促进健康行为，提高治疗依从性，实现医生-护士-患者-家属共同参与疾病的治疗和预防[12]。

1.2.4　Western blot检测γ-H2AX以及p16蛋白表达 取MACS分离得到的CD117+细胞，调整待测细胞的浓度为1×106-107个/ml，提取蛋白质，进行Western blot分析，检测γ-H2AX蛋白表达以及衰老相关蛋白p16表达的变化，内参β-actin蛋白的含量作为参照计算蛋白的相对表达量。

3　讨论

  

图2　Western blot检测高血糖对骨髓干细胞γ-H2AX以及p16蛋白表达的影响

1.2.3　共聚焦检测骨髓干细胞γ-H2AX表达　将MACS分离得到的CD117+细胞，调整待测细胞的浓度为 1×105个/ml，按照试剂盒(Cell Biolabs，DNA Double Strand Break Assay)步骤标准操作，具体如下：接种在多聚赖氨酸包被的24孔培养板上，每孔接种1ml。体外培养12h之后，使用PBS清洗3次后，接着细胞用多聚甲醛固定，加入抗小鼠γ-H2AX抗体室温下反应 1h，PBS清洗 3次后与FITC标识的二抗反应，之后再用DAPI对细胞核进行染色，荧光显微镜下观察结果。

糖尿病发病率呈逐年上升趋势，糖尿病患者合并缺血性疾病的发病率增高，常规药物及手术治疗效果欠理想[16]。近年来，自体骨髓干细胞移植治疗得到一定的应用，但不少研究结果表明其疗效欠佳，Govaert等的研究及Jiménez-Quevedo等的研究[17，18]均证实糖尿病合并缺血性心脏病患者给予骨髓干细胞移植后，心脏功能无改善，然而疗效欠佳的原因至今未明。

众所周知，细胞衰老是指可增殖细胞在信号通路的调控下，不可逆地脱离细胞周期后进入的一种相对稳定的状态，细胞衰老涉及DNA的损伤与修复、线粒体的能量代谢以及一系列基因的调控等[19]。高血糖可引起机体氧化应激，而氧化应激可进一步促进细胞的衰老[20，21]。因此本研究通过建立STZ诱导的糖尿病小鼠模型，探讨了高血糖状态是否促进CD117+骨髓干细胞DNA受损、从而加速细胞衰老。本研究考虑到高血糖状态的长期影响效果，我们在糖尿病模型建模成功8周后，才收集了骨髓干细胞进行分析。我们发现糖尿病组与正常对照组相比，DNA双链断裂(DSB)损伤标志物γ-H2AX表达明显增强。我们进一步采用Western blot检测γ-H2AX以及衰老相关蛋白p16表达情况，结果也提示与正常对照组相比，糖尿病组骨髓干细胞γ-H2AX以及p16蛋白表达水平增强。以上结果表明高血糖状态可促进骨髓干细胞的衰老。众多研究表明高血糖引起的氧化应激可破坏DNA的结构而引发DNA损伤应答、或者直接调控衰老相关的信号通路，促进细胞衰老的发生[22]。

师生对话的实际应用对教师有了更高要求，教师需要对传统的教学方式进行彻底的改革与创新，并从实际出发合理调整策略，找到适合学生语文学习的有效方法。在对话的过程中，促进小学语文教学的多样化发展，不断提升学生的课堂主体地位。

该研究首次分析了高血糖状态对骨髓干细胞衰老的影响，具有一定的新意，但也存在一定的不足点：首先，未能在机制上进一步论证所得结果；其次，本研究所得的结果是体外分析结果，而机体体内微环境远远比体外复杂。以上不足有待今后的研究中去解决，包括给予糖尿病小鼠抗氧化应激治疗后分析骨髓干细胞衰老状况。

综上所述，我们证实了高血糖状态可促进骨髓干细胞的衰老，为骨髓干细胞移植在糖尿病合并缺血性疾病患者方面的应用提供了一定基础理论依据。

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