丙酮酸乙酯(ethyl pyruvate，EP)又名α-酮基丙酸乙酯，是一种较稳定的丙酮酸衍生物，其分子结构式为CH3COCOOCH2CH3，其安全性较高，可用作食品香料的添加剂，并被广泛应用于食品、化妆品、化工、医药等领域[1]。随着药学工作者对EP的深入研究，发现EP具有抗炎、改善出血性休克、辐射损伤、抗肿瘤等药理作用[2-4]。EP能通过抑制肿瘤血管生成、抑制细胞的增殖、诱导其凋亡及阻滞其细胞周期等机制发挥抗肿瘤的效应[5-8]。本文将探讨EP在体内外抑制A549肺癌细胞增殖及探讨其诱导细胞凋亡的作用机制。

1 材料

1.1 主要仪器

涡旋振荡仪(美国Essenscien公司)；CR3i冷冻型多功能离心机、3111型CO2恒温细胞培养箱、微量可调式移液器(美国Thermo公司)；倒置荧光显微镜(德国莱卡公司)；SWCJ1FD型洁净工作台(苏州安泰空气技术有限公司)；贝克曼EPICSXL型流式细胞仪(美国Beckman公司)；BilTek酶标仪、垂直板蛋白电泳仪、电转仪(美国BIO-RAD公司)；独立送回风净化笼具(IVC)(苏州市苏杭实验动物设备厂)；恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；脱色摇床(海门市其林贝尔公司)；磁力搅拌器(杭州米欧公司)；AUY120型电子天平(日本岛津公司)。

1．“姦”读“奸”；2．“鱻”读“鲜”；3．“猋”读“标”；4．“麤”读“粗”5．“羴”读“山”；6．“毳”读“脆”；7．“蠱”读“古”；8．“赑”读“必”；9．“垚”读“尧”；10．“犇”读“奔”。

(1)目标价格提高2%，国产大豆产量增加0.86%，市场价格下降0.53%。在其他条件不变的情况下，若大豆目标价格提高100元/吨(约提高2%)，政策试点区的产量将提升1.96%，而由于供给增加导致市场价格下降，非试点区的大豆产量会随之下降0.23%。总体来看，国产大豆供给量增加了0.86%。由于国产大豆供给增加，国产大豆市场价格下降0.53%。

1.2 细胞株与主要试剂

人肺腺癌细胞株A549(中国科学院上海细胞生物学研究所)；EP(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；噻唑蓝(MTT)、苯甲磺酰氯(PMSF)(美国Sigma公司)；胎牛血清(FBS)、0.25%胰蛋白酶、DMEM培养基(美国Gibco公司)；蛋白裂解液、Hoechst33258、异硫氰酸荧光素(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(PI)细胞凋亡检测试剂盒、活性氧(ROS)检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)；兔抗人Bax一抗、兔抗人Bcl-2一抗(沈阳万类生物科技有限公司)；鼠抗人GAPDH一抗、兔抗羊二抗、鼠抗羊二抗(武汉三鹰生物技术有限公司)；BCA蛋白定量试剂盒、ECL发光液(美国Thermo公司)；PVDF膜(美国Millipore公司)；X线胶片(日本柯达公司)。

1.3 实验动物

将处于对数生长期的A549细胞用无血清的DMEM培养基制备成1×107个/mL单细胞悬液，以200 μL/只接种于BALB/c裸鼠皮下，2周后可观察到大小、形状均一的10 mm×10 mm×10 mm左右的肿瘤，解剖裸鼠取其肿瘤组织块剪至2 mm×2 mm×2 mm大小接种到35只裸鼠腋窝皮下。待肿瘤生长至5 mm×5 mm×5 mm后根据肿瘤体积进行随机区组分组，分别为Control组、顺铂(Cisplatin)iv组(5 μmol/kg)、EP iv组(100 μmol/kg)和EP ig组(100 μmol/kg)，每组8只，雌雄各半，各组动物按体质量0.1 mL/10 g剂量给药19 d，隔天测量肿瘤体积并称量体质量，于第20天解剖取其心、肝、脾、肺、肾及肿瘤，称重，计算肿瘤体积抑制率、肿瘤质量抑制率和脏器系数。肿瘤体积(V)=1/2×a×b2(a、b分别表示肿瘤的长与宽，单位为mm)；肿瘤体积抑制率=[1-(治疗组给药前肿瘤体积-治疗组给药后肿瘤体积)/(对照组给药前肿瘤体积-对照组给药后肿瘤体积)]×100%；肿瘤质量抑制率=[1-给药组平均肿瘤质量/模型组平均肿瘤质量]×100%；脏器系数=各组脏器平均质量/各组裸鼠平均体质量×100%。

2 方法

2.1 EP溶液的制备

在细胞实验中将EP用DMEM培养基稀释至所需浓度，在体内实验中将EP用生理盐水稀释至所需浓度，均用0.22 μm的微孔滤膜过滤除菌后4 ℃保存备用。

2.2 A549细胞培养

无论何种类型的图书馆都不应该局限于服务固定读者，它应该成为一种社会资源，更应该是社会服务机构，是读者群体的共享资源,人性化服务只有通过社会服务机构得以发挥并传承延续下去的。

细胞处理与药物孵育同“2.5”项方法。各组细胞培养至48 h时弃去培养基，用1 mL/皿的PBS洗涤3次，稍干燥后，加入40 μL的蛋白裂解液，在冰上用细胞刮轻轻刮下细胞并收集，放置冰上裂解20 min，每隔5 min用涡旋振荡仪涡旋一次使其充分裂解，4 ℃ 12 000 r/min离心20 min，取上清进行总蛋白定量，每条泳道的上样量为20 μg总蛋白，经10% SDS-PAGE电泳使蛋白分离，于4 ℃ 250 mA的条件下电转90 min将目的蛋白转移至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉室温下摇床上封闭2 h，用TBST洗膜3次，10 min/次，放入孵育盒中孵上对应的兔一抗Bax(1∶500)、兔一抗Bcl-2(1∶500)和鼠一抗GAPDH(1∶5 000)在4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次，10 min/次，放入孵育盒中孵上对应的羊抗兔二抗(1∶8 000)、羊抗鼠二抗(1∶8 000)，室温孵育2 h后用TBST洗膜4次，10 min/次，在暗室中加入ECL化学发光液用X光片曝光后显影及定影。扫描胶片，采用Image J软件分析胶片中蛋白条带的灰度值，相对蛋白表达丰度(%)=各组灰度面积/空白组灰度面积。实验重复3次。

2.3 EP体外抗A549细胞增殖的药效学试验(MTT法)

将处于对数生长期的A549细胞制备成5×104个/mL单细胞悬液以100 μL/孔接种于96孔培养板中，待24 h细胞贴壁后分别设置EP浓度为0.1、0.2、0.5、1、2、4、8、16、32、64 mmol/L的各组别，并按组别给予相应浓度的EP进行药物孵育，此外还设有只加培养基不含细胞的空白组和不加药物的对照组。各组细胞分别培养24、48、72 h后，避光加入MTT(5 mg/mL)10 μL/孔，继续培养4 h，用注射器吸净上清，每孔依次加入100 μL二甲基亚砜(DMSO)，于摇床上震摇10 min后用酶标仪测定570 nm波长处各孔的吸光度(A值)，细胞增殖抑制率=(对照组A值-加药组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100% 。每组设置5个复孔，实验独立重复3次。

2.4 EP体内对A549荷瘤裸鼠的抑瘤药效试验

SPF级BALB/c裸鼠38只，3～4周龄，雌雄各半，体质量18～22 g，生产许可证号SCXK(粤)2013-0002，购自广东省医学实验动物中心。

将A549细胞复苏后，用含有10%(φ)FBS血清的DMEM培养基培养生长，并放置于37 ℃、5% (φ)CO2及饱和湿度的培养箱中。隔天换液，4 d传代1次。

2.5 Hoechst33258染色观察细胞形态变化

细胞处理与药物孵育同“2.5”项方法，同时设置该试剂盒中提供的Rosup作为阳性对照组。各组细胞培养至6 h时弃去培养基，用1 mL/皿的PBS洗涤3次，用0.25%胰酶分别消化收集皿中细胞，PBS洗涤3次后，加入1 mL 10 μmol/L DCH-DA探针后放置细胞培养箱中孵育20 min，每隔5 min颠倒混匀一次确保探针和细胞充分接触，离心后用PBS洗涤3次，并用500 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测荧光强度来测定细胞的ROS水平。实验重复3次。

2.6 Annexin V-FITC/ PI双染法检测细胞凋亡率

将处于对数生长期的A549细胞制备成1×105个/mL单细胞悬液以3 mL/孔接种于35 mm细胞培养皿中，待24 h细胞贴壁后分别设置EP 浓度为0、5、10、20 mmol/L组，并给予相应浓度的EP进行药物孵育。各组细胞培养至48 h时弃去培养基，用1 mL/皿的PBS洗涤3次，用0.25%胰酶分别消化收集皿中细胞，PBS洗涤3次后，重悬于195 μL Annexin V-FITC结合液中，加入5 μL Annexin V-FITC混匀，再加5 μL PI再次充分混匀，室温下避光反应20 min，于流式细胞仪检测并采用FlowJo10.0软件进行分析计算细胞凋亡率(%)，以四象限的散点分布图表示，其中Q1、Q2、Q3、Q4分别为死细胞、晚期凋亡细胞、早期凋亡细胞及正常细胞的比例。实验重复3次。

2.7 流式细胞术检测细胞ROS的产生

将处于对数生长期的A549细胞制备成1×104 个/mL单细胞悬液以1 mL/孔接种于12孔培养板中，待24 h细胞贴壁后分别设置EP浓度为0、5、10、20 mmol/L组，并给予相应浓度的EP进行药物孵育。各组细胞培养至48 h时弃去培养基，用1 mL/孔的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，加入500 μL/孔4%(φ)多聚甲醛室温固定30 min，PBS洗涤3次，加入1 mL/孔 Hoechst33258(5 mg/L)室温避光孵育30 min，PBS洗涤3次，用倒置荧光显微镜在紫外波段下观察细胞给药后的形态变化并随机选择视野拍照记录。实验重复3次。

2.8 JC-1染色法检测细胞线粒体膜电位(ΔΨm)的变化

细胞处理与药物孵育同“2.5”项方法，同时设置该试剂盒中提供的CCCP作为阳性对照组。各组细胞培养至6 h时弃去培养基，用1 mL/皿的PBS洗涤3次，用0.25%胰酶分别消化收集皿中细胞，PBS洗涤3次后，重悬于500 μL的不含血清的DMEM培养基中，加入500 μL JC-1染色工作液(JC-1(200×)∶超纯水∶JC-1染色缓冲液(5×)=0.025∶4∶1,颠倒数次混匀并于细胞培养箱中孵育20 min，离心，用1 mL JC-1染色缓冲液(1×)洗涤细胞2次并用500 μL的JC-1染色缓冲液(1×)重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞的红绿荧光比来测定ΔΨm的变化。实验重复3次。

2.9 Western blot检测细胞凋亡相关蛋白表达水平的变化

一方面，以往继续教育供给主体少，继续教育资源建设者主要解决资源有无问题，侧重于资源数量的建设；另一方面，以往生产力发展水平稍低，用人单位对劳动者的职业技能和职业素养没有过多要求，基本能胜任工作岗位要求即可，但现阶段生产力得到迅速发展，劳动者既有的职业技能和职业素养逐渐难以胜任日益专业化、精细化的岗位技能要求。内外因素共同影响下，迫使继续教育供给者转变资源建设思路，从数量为重变质量优先。

2.10 统计方法

如图4，不同浓度的EP作用于A549细胞后均可不同程度诱导细胞内ROS的产生，并随着EP浓度的增加，ROS水平呈量-效关系，其中，EP 20 mmol/L组的ROS水平显著高于空白对照组的ROS水平(P<0.01)，同时，20 mmol/L的EP能明显地逆转抗氧化剂NAC的ROS清除作用(P<0.05)。

3 结果

3.1 EP对A549细胞增殖的影响

MTT结果如表1所示，不同浓度的EP处理A549细胞后与空白对照组相比，均受到了不同程度的生长抑制，EP干预24、48、72 h的IC50值分别为18.30、14.94、10.13 mmol/L(P<0.01)，且其抑制程度具有明显的浓度和时间依赖性。

 

表1 不同浓度的EP在不同时间作用于A549细胞的增殖抑制率

 

Table 1 Inhibition rate of different concentrations of EP on A549 cell proliferation at different times

  

组别 c/(mmol·L-1)增殖抑制率/%24h48h72h空白对照组-000EP组 0．11．53±1．661．83±0．25∗4．87±2．330．24．40±0．88∗9．10±3．31∗7．26±0．75∗∗0．56．41±2．22∗14．13±5．12∗7．17±1．32∗∗1．012．99±4．99∗19．06±2．51∗∗10．08±3．83∗2．028．79±5．57∗34．21±1．2714．18±1．20∗∗4．028．74±1．4733．37±3．01∗∗14．73±1．45∗∗8．033．70±9．7636．67±4．10∗∗18．68±0．52∗∗16．034．08±3．51∗37．64±1．1149．81±4．25∗32．079．78±1．05∗∗91．47±1．24∗∗98．62±0．45∗∗64．0104．58±0．93∗∗103．66±0．15∗∗103．56±0．52∗∗

与空白对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

3.2 EP对A549荷瘤裸鼠的抑瘤作用

图1A为A549荷瘤裸鼠肿瘤体积的增长趋势图，可见在给药第7天后，EP(iv)组能明显地抑制肿瘤的生长，于第19天其肿瘤体积抑制率(图1C)达到34.00%(P<0.05)，肿瘤质量抑制率(图1D)为20.57%(P<0.05)，但EP(ig)组的抑瘤率与模型组对比无明显差异。各给药组动物脏器系数与模型组相比(图1E)，阳性药顺铂iv组肝脏、脾脏及肾脏的脏器系数差异有统计学意义(P<0.01)，提示顺铂对荷瘤裸鼠的肝脏、脾脏与肾脏均有一定的毒性。同时，图1B可见裸鼠随着每日给予顺铂后日渐消瘦，体质量明显降低，而无论是EP(iv)组还是EP(ig)组的体质量和各脏器系数均与模型对照组相比差异无统计学意义，表明EP的安全性较高。

3.3 EP对A549细胞形态的影响

在倒置荧光显微镜下观察结果见图2。A549细胞出现皱缩，细胞核染色质凝集，因此跟染料结合越多，着色较深并呈现较亮的蓝色，形成凋亡小体，部分细胞核还出现破损成块，而空白对照组细胞形态均一，细胞核呈亮度均匀的淡蓝色荧光，且细胞密度较高。

  

A.荷瘤裸鼠肿瘤体积变化曲线； B.荷瘤裸鼠体质量变化曲线； C.荷瘤裸鼠肿瘤体积抑制率； D.荷瘤裸鼠肿瘤质量抑制率； E.荷瘤裸鼠脏器系数。与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图1 EP对A549荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响Figure 1 Effect of EP on tumor growth in nude mice

  

A.空白对照组； B. EP 5 mmol/L组； C. EP 10 mmol/L组； D. EP 20 mmol/L组。

 

图2 Hoechst33258染色观察EP对A549细胞形态学的变化(200×)Figure 2 Morphological changes of A549 cells after EP treatment by Hoechst 33258 staining (200×)

3.4 EP对A549细胞凋亡的影响

细胞凋亡率检测结果如表2、图3所示，A549细胞经EP处理48 h后明显可见其凋亡率随着EP浓度的升高而逐渐增加，其中10 mmol/L EP组的凋亡率与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.05)，20 mmol/L EP组的凋亡率明显增加，与空白对照组相比，差异有统计学意义(P<0.01)，EP对A549细胞的凋亡诱导作用具有浓度依赖性。

 

表2 不同浓度EP对A549细胞作用48 h的凋亡率

 

Table 2 Effect of different concentrations of EP on A549 cell apoptosis at 48

  

组别c/(mmol·L-1)正常细胞率(Q4)凋亡细胞率(Q2+Q3)空白对照组090．4±2．208．77±1．98EP组588．05±0．4510．11±0．451085．55±0．75∗13．14±1．04∗2058．25±6．25∗∗39．69±6．85∗∗

与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

3.5 EP对A549细胞ROS产生的影响

数据的处理采用SPSS22.0软件进行分析，所有实验数据均以表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

发芽指数可以衡量种子的发芽数，反映种子的发芽速度，还可以用来检测种子的活力。不同浓度的海水对厚萼凌霄种子发芽指数的影响数据见图3。

3.6 EP对A549细胞ΔΨm的影响

与空白对照组相比，EP处理后的A549细胞的红色荧光(FL2-H)/绿色荧光(FL1-H)强度显著下降(P<0.05)，即其红色荧光强度明显降低，而绿色荧光强度明显增加，表明EP能使A549细胞的ΔΨm显著降低(图5)。

3.常态化的家访，为留守儿童的家庭教育提供支持。留守儿童之所以问题多，很大程度上就是家庭教育的缺失。例如，我班的一个学生，父母在温州打工，他由奶奶进行监护。我一到他家就感觉到他的学习完全是由着自己来，他的奶奶完全无法干预。我一般保持一个月至少有一次到他的家里进行家访，找他谈心。这种方式既是对他的鼓励，也是一种督促，以弥补缺失的家庭教育。

3.7 EP对A549细胞凋亡相关信号分子蛋白表达水平的影响

如图6所示，经EP处理后，A549细胞的促凋亡蛋白Bax的表达水平随EP浓度的升高而逐渐增加(P<0.01)，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平随EP浓度的升高而逐渐减少(P<0.01)。

  

A.空白对照组； B. EP 5 mmol/L组； C. EP 10 mmol/L组； D. EP 20 mmol/L组。

 

图3 不同浓度的EP对A549细胞作用48 h凋亡率的影响

 

Figure 3 Effect of different concentrations of EP on A549 cell apoptosis at 48 h

  

1.空白对照组； 2. EP 5 mmol/L组； 3. EP 10 mmol/L组； 4. EP 20 mmol/L； 5. NAC 5 mmol/L组； 6. EP 20 mmol/L+NAC 5 mmol/L组； 7. Rosup 50 mg/L阳性对照组。与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图4 不同浓度的EP对A549细胞作用6 h后ROS水平的影响

 

Figure 4 ROS level of A549 cells after treatment with different concentrations of EP at 6 h

  

1.空白对照组； 2. EP 5 mmol/L组； 3. EP 10 mmol/L组； 4. EP 20 mmol/L； 5. CCCP 10 μmol/L组； 与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图5 不同浓度的EP对A549细胞作用6 h后线粒体膜电位水平的影响

 

Figure 5 Mitochondrial membrane potential level of A549 cells after treatment with different concentrations of EP at 6 h

  

A. Bax、Bcl-2蛋白的表达水平； B. Bax蛋白相对表达水平； C. Bcl-2蛋白相对表达水平。1.空白对照组； 2. EP 5 mmol/L组； 3. EP 10 mmol/L组； 4. EP 20 mmol/L。与空白对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图6 EP处理后A549细胞的Bax、Bcl-2的表达量

 

Figure 6 Expression of Bax and Bcl-2 in A549 cells after treatment with EP

4 讨论

近年来随着我国经济发展，人们生活方式的改变及生态环境的变化，肺癌的发病率和死亡率也日益增长，严重危害了人类的生命健康，所以研发一种高疗效、低毒性的抗肺癌药物仍然迫在眉睫。据文献报道，EP不但可用于抗急性胰腺炎[9]、抗缺血-再灌注急性损伤[10]及抗肝损伤[11]等疾病的治疗，随着研究的不断深入，近年来也发现其具有抗肝癌[12]、胃癌[13]、胆囊癌[14]等作用。

与细胞坏死不同，细胞凋亡是细胞在正常的生长过程中细胞自主地有规律地死亡。本实验旨在通过体内外实验探讨EP抑制A549细胞增殖作用及对其诱导细胞凋亡的作用机制进行研究，实验结果观察到EP能有效地抑制A549细胞的增殖并呈明显的浓度和时间依赖性，同时通过体内药效学实验证明，静脉注射EP能明显地抑制肿瘤体积的生长，但口服效果略欠佳，推测EP在体内吸收可能存在首过效应，其生物利用度较低，但其具体原因还有待深入研究。通过H33258染色实验观察到，一定浓度的EP可使细胞形态发生明显改变，表现出凋亡小体的显著特征，因此初步推测EP可诱导A549细胞发生凋亡。为了进一步验证，采用流式细胞术检测其凋亡率，证实了EP可通过诱导A549细胞凋亡来发挥抗肿瘤活性。为探讨其凋亡机制，通过检测细胞产生ROS的含量及线粒体膜电位的变化，结果表明EP能增加细胞内ROS的产生并降低线粒体膜电位来诱导A549细胞的凋亡，这与文献[15]报道的EP通过提高肿瘤细胞的HIF-1α蛋白水平，使线粒体三羧酸循环增强从而增加ROS的产生的结果一致。Bcl-2基因家族是控制肿瘤细胞凋亡的重要蛋白之一，尤其细胞内Bcl-2/Bax的比率直接决定了细胞的存亡，药物的作用旨在抑制肿瘤细胞生存基因的表达和激活死亡基因的表达，本实验通过Western blot检测出EP能降低Bcl-2蛋白的表达同时上调Bax蛋白，Bax通过自身形成同源二聚体从而诱导细胞凋亡。

综上所述，EP诱导A549细胞凋亡的机制可能与下调Bcl-2、上调Bax蛋白的表达有关，但由于抗肿瘤药物的作用机制具有多个靶点，且在治疗过程中肿瘤细胞可能会产生基因突变而耐药，所以对于EP抗肿瘤机制的阐明还需更全面更深入的研究。

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20世纪80年代，我第一次到美国，挺兴奋的，在太平洋上空要飞9个小时，我就边回忆边思考，突然悟出了一个道理：有小人磕你一下，你就长进一步；失败了，磕不过，也不要怨天尤人。