喜树碱(camptothecin，CPT)是从珙桐科植物喜树中分离提取的生物碱，能够遏制癌细胞DNA拓扑异构酶活性，具有显著的抗癌活性[1]。但喜树碱水溶性差，内酯环结构不稳定，在生理条件下容易开环失活，半衰期短[2-3]；缺乏选择性杀死肿瘤细胞的能力，产生严重的毒副反应[4]。因此，提高喜树碱水溶性、体内稳定性、进入肿瘤细胞的靶向性，是提高喜树碱药物疗效的有效途径。

据文献[5-11]报道，在喜树碱内酯环的邻位(20位)引入大基团，可保护内酯环，延长体内半衰期，如Greenwald等[5]合成了一系列喜树碱的20位羟基酯化的喜树碱-PEG40000二酯，临床I期实验表明其体内半衰期可达到77 h。聚乙二醇(PEG)作为抗肿瘤药物载体，可使给药系统获得优良的体内药动学性质，如改善药物的溶解性，体内长循环效应，及EPR效应[6]。但是，PEG的引入也可导致药物不易被肿瘤细胞吞噬。研究发现很多肿瘤细胞表面有高表达的叶酸受体(FR)，用叶酸(FA)修饰给药系统，通过受体介导的方式进入肿瘤细胞，可提高主动靶向性。此外，富勒醇具有抑制肿瘤生长和抑制肿瘤转移的优点，用量小，毒性低[12]，具有优良的水溶性。本文尝试将FA修饰在PEG大分子上，且引入富勒醇，组成的喜树碱给药系统可以起到双重抗肿瘤的目的。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Avance 500核磁共振波谱仪(瑞士Bruker 公司)；Tensor 27傅里叶变换红外光谱仪(KBr 压片，德国Bruker公司)；TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；U3000高效液相色谱仪(紫外检测器为SPD-10A型，美国戴安公司)；BS110S系列电子天平(北京赛多利斯天平有限公司)。

1.2 试剂

喜树碱(CPT，天津一方科技有限公司，批号：10042017)；四臂氨基聚乙二醇(PEG-NH2，5K，宁波旋光医药有限公司，批号：20150821)；富勒醇(C60-OH，苏州恒球科技有限公司)；二甲氨基吡啶(DMAP)、叶酸、N-羟基琥珀酰亚胺( NHS)、二环己基碳二亚胺( DCC)、二甲基亚砜(DMSO)、丁二酸酐、NaOH、乙二胺、己二胺、三氯甲烷、二氯甲烷、甲醇、异丙醇、氨水，以上试剂均为分析纯，购自中国国药上海化学试剂公司。DMSO使用前做无水处理。

2 方法

2.1 合成路线

FA-PEG- CPT的合成路线如图1，FA-PEG-C60-C2H4-CPT的合成路线如图2。

  

图1 FA-PEG-CPT的合成路线Figure 1 The synthesis of FA-PEG-CPT

  

图2 FA-PEG-C60-C2H4-CPT的合成路线Figure 2 The synthesis of FA-PEG-C60-C2H4-CPT

2.2 20-(S)-O-琥珀酰羟基喜树(CPT-COOH)的合成

将10 mg NaOH溶于5 mL水中，用此碱性溶液溶解125 mg(0.025 mmol)四臂氨基聚乙二醇盐酸盐(PEG-NH2HCl)，将345 mg(0.3 mmol)富勒醇(C60-OH)用10 mL水溶解，混合2种溶液，50 ℃搅拌反应1周。在此混合溶液中再加入乙二胺3.5 mL，继续在50 ℃搅拌反应，1周后透析(截留分子质量3 500)。透析液冻干，得到棕色固体，收率90%。

2.3 CPT-NHS的合成

将100 mg(0.01 mmol) PEG-(C60-C2H4-NH2)4先溶解在10 mL水中，再加入DMSO 10 mL，形成混合溶剂的溶液。投入CPT-NHS溶液(含0.056 mol/L CPT-NHS)0.5 mL，室温搅拌反应过夜。投入0.5 mL FA-NHS溶液(含0.056 mol/L FA-NHS)，室温搅拌反应过夜。反应液抽滤，得黏稠状滤渣，该滤渣用甲醇洗2遍。取出滤渣，加入少量三氯甲烷，加热，冷却后抽滤。滤渣再用甲醇洗，得棕褐色固体，干燥后得127 mg。该固体用TLC检测，无游离的FA和CPT即可，否则继续用甲醇和三氯甲烷洗。

2.4 FA-NHS的合成

将叶酸1.0 g(2.23 mmol)投入50 mL圆底烧瓶中，加干燥DMSO 40 mL，超声至完全溶解。然后再加入NHS 0.28 g(2.48 mmol)、DCC 0.56 g(2.48 mmol)，充入N2保护，避光，在室温下搅拌反应过夜。抽滤除去不溶物，得到橙红色溶液，备用。

2.5 FA-PEG-CPT的合成

将200 mg(0.04 mmol)四臂氨基聚乙二醇(PEG-NH2)用2 mL二氯甲烷溶解，投入FA-NHS反应液(含0.056 mol/L FA-NHS)1 mL，室温搅拌反应过夜，TLC检测(展开剂为异丙醇-氨水-水，体积比 9∶1∶2)。再投入CPT-NHS溶液(含0.056 mol/L CPT-NHS)1 mL，室温搅拌反应过夜，TLC检测(展开剂为三氯甲烷-甲醇，体积比9∶1)。减压蒸除二氯甲烷，加乙醚，析出固体，抽滤。滤渣用DMSO溶解，装于透析袋中，用50%DMSO水溶液透析，再用重蒸水透析，最后冻干。

2.6 PEG-(C60-C2H4-NH2)4的合成

将200 mg(0.575 mmol)喜树碱、140 mg(1.15 mmol)DMAP、574 mg(5.75 mmol)丁二酸酐投入20 mL三氯甲烷中，加热至55 ℃溶解，避光搅拌反应5 d，TLC检测(展开剂为三氯甲烷-甲醇，体积比9∶1)，冷却后析晶，抽滤，甲醇重结晶，干燥后得浅黄色固体，收率85%。

2.7 PEG-(C60-C6H12-NH2)4的合成

操作过程同“2.6”项，试剂乙二胺换成己二胺水溶液(690 mg己二胺溶于7 mL水中)，最后得到棕色固体，收率92%。

2.8 FA-PEG-C60-C2H4-CPT的合成

将170 mg(0.38 mmol)CPT-COOH溶解于8.5 mL干燥DMSO中，加入48 mg(0.42 mmol) NHS、87 mg (0.42 mmol) DCC，TLC检测(展开剂为三氯甲烷-甲醇，体积比9∶1)，避光室温搅拌反应过夜，抽滤，反应液备用。

2.9 FA-PEG-C60-C6H12-CPT的合成

方法同FA-PEG-C60-C2H4-CPT的合成。

2.10 载药量的测定[13]

2.10.1 色谱条件 色谱柱：ODS C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相：甲醇-水(体积比60∶40)；流速：1.0 mL/min；检测波长：370 nm；进样量：20 μL。

2.10.2 标准曲线的绘制 取CPT 5 mg，精密称定，置100 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，配制成50 mg/L的储备液。吸取该储备液0.002、0.008、0.02、0.03、0.06、0.1、0.4、1.0、4.0 mL置10 mL容量瓶中，以甲醇稀释定容，配制成质量浓度为0.01、0.04、0.1、0.15、0.3、0.5、2.0、5.0、20.0 mg/L的CPT系列溶液，进样，记录色谱图。以峰面积为纵坐标，CPT质量浓度为横坐标，进行线性回归，得回归方程：y=0.082 2x+0.013 8(r=0.999 7)，表明CPT的峰面积与质量浓度在0.25～20 mg/L范围内具有良好的线性关系。

2.10.3 载药量检测 精密称取复合物约10 mg，置于容量瓶中，加0.1 mol/L的NaOH溶液10 mL，超声2 h至喜树碱游离。用甲醇定容至100 mL。滤膜过滤后，用HPLC测喜树碱浓度。计算喜树碱的质量，与称取量之比即为喜树碱的质量分数。

3 结果与讨论

3.1 红外光谱分析

产物FA-PEG-C60-C6H12-CPT的核磁氢谱分析情况同FA-PEG-C60-C2H4-CPT。

从FA-PEG-CPT的红外图谱(图3E)可见，该产物在2 000～1 100 cm-1区段的特征峰有1 650、 1 607、1 510、1 454、1 352、1 252、1 102，其中1 650宽峰、1 352峰、1 252峰和1 102宽峰属于PEG的特征峰，1 607是FA特征峰，1 510、1 454是CPT-COOH结构中苯环的特征峰；同时可见，在CPT-COOH结构中，1 748羧基峰在产物FA-PEG-CPT的红外图谱中没有出现，说明羧基官能团已经发生反应。

产物FA-PEG- C60-C2H4-CPT的红外图谱(图3G)在2 000～1 100 cm-1区段的特征峰有1 694、1 605、1 512、1 450、1 384、1 348、1 100，其中1 384和1 100峰是载体PEG-(C60-C2H4-NH2)4的特征峰，1 694、1 605峰是FA特征峰，1 512和1 450峰是CPT-COOH结构中苯环的特征峰。

中间产物PEG-(C60-C2H4-NH2)4的红外图谱(图3F)在2 000～1 100 cm-1区段的特征峰有1 596、1 384、1 355、1 251、1 101，其中1 596和1 384峰是C60特征峰，1 355、1 251和1 101峰则是PEG的特征峰。

当主电源接入24 V时，高于23 V的标准工作电压，此时E1使能，控制G1产生下拉电流，Q1导通，此时V1=Vs>V2，G2产生上拉电流，Q2、Q3截止，避免产生逆向电流；当主电源接入电压低于21 V时，E2使能，控制G2产生下拉电流，Q2、Q3导通，此时V2=Vs>V1，G1产生上拉电流，Q1截止，避免产生逆向电流.

比较产物与原料的核磁氢谱共振峰，可见产物FA-PEG-CPT包含了喜树碱、叶酸和聚乙二醇结构，其中δ 8.70(s)、8.23-8.12(m)、7.87(t)、7.72(t)、5.49(s)、5.31(s)、2.42(t)、2.15(m)、1.86(m)属于CPT-COOH质子峰；δ 8.64(s)、8.23-8.12(m)、7.65(d)、6.94(m)、6.65(d)、4.48(d)、4.38-4.30(m)、2.33(t)、1.95(m)属于FA质子峰；δ 3.69-3.12(m)属于PEG质子峰。以上结果进一步佐证了红外图谱的结果。

从图3(a)、(b)可以看出ADRC和PID系统在6s已经稳定，在6s时给系统加入阶跃干扰，仿真结果如图4(c)、(d)所示：(c)是对摆杆角度的抗扰控制曲线，可以看出改进型ADRC在0.2s就对阶跃干扰作出响应，调节时间只需要1.35s；(d)是双闭环PID的抗扰曲线，对误差的响应时间为0.6s，调节时间则需要3.65s；从(c)、(d)中还可以看出改进型ADRC加入干扰调整稳定后对摆杆角度和小车位置都能达到目标位置，而双闭环PID系统小车位置稳定后存在+0.015m的误差，不能精确回到目标位置。改进型ADRC比双闭环PID对一级直线倒立摆的控制有更好的抗干扰能力。

  

A. C60-OH; B. CPT-COOH; C.FA; D.PEG; E.FA-PEG-CPT; F.PEG-(C60-C2H4-NH2)4; G.FA-PEG-C60-C2H4-CPT。

 

图3 各喜树碱复合物的红外光谱图Figure 3 IR spectra of camptothecin-polymer compounds

3.2 核磁共振氢谱分析

各喜树碱复合物的核磁共振氢谱图见表1。

大多数孩子拿现金有困难，但摸索着在家里找点废品却不是大问题。不过，对于什么是不要的废品，孩子们和大人们的想法有时候并不一致——尤其是在被打糖的香甜诱惑迷昏了头脑的情况下。每次来了卖打糖的人，孩子们都是一阵鸡飞狗跳地到处找废铜烂铁凑着换糖吃，生怕动作慢了，卖打糖的人就走掉了。

我们的群众路线，不是满足于那个热热闹闹，主要的是要做经常的、细致的工作，做人的工作。这是一点一滴的工作，这样的工作积累起来，才有我们伟大的成绩。所以，我们要搞得深入一些。我们党的历史，我们党的传统，有热闹的形式，但是归根到底，我们是实事求是地做深入的工作。……最容易的工作是开大会，发个一般号召，敲锣打鼓，搞得热热闹闹，那个工作究竟见多少效？

产物FA-PEG-C60-C2H4-CPT核磁氢谱共振峰有：δ 8.68(s)、8.17-8.12(m)、7.82(m)、7.72-7.64(m)、1.89(m)属于CPT-COOH的质子峰；δ 8.65(s)、7.72-7.64(m)、6.96(m)、 6.71-6.59(m)、4.48(d)、4.33(m)、2.32(t)、2.03(m)属于FA的质子峰；δ 3.64-3.17(m)属于PEG的质子峰，可见产物包含了喜树碱、叶酸和聚乙二醇结构。富勒醇的核磁共振氢谱在 δ 3.26(s)和1.07(d)附近有弱峰。虽然在图中未能得到很好显示，但是从红外图谱中可看到已包含在产物的结构中。

各喜树碱复合物的红外光谱图见图3。

3.3 差示热分析

各喜树碱复合物的差示热分析图见图4。

川崎机器人（天津）有限公司主要负责川崎重工生产的机器人在中国境内的销售、售后服务以及技术咨询等工作，并从顾客的角度开发和提供高性能产品。目前主要业务包括各种工业机器人的销售以及安全调试、维修、点检和紧急修理等售后服务工作，同时为客户储备了大量备品备件，并为客户提供机器人基础知识以及安全操作、维修等服务。

可见，产物FA-PEG-CPT(E)在58 ℃有1个较大吸热峰，与FA(图4A)、PEG(图4B)的CPT-COOH(图4C)图谱有明显差别：FA在148 ℃有1个较大吸热峰，201、269 ℃有弱吸热峰；PEG在41 ℃有1个尖锐吸热峰；CPT-COOH在263、271 ℃有2个吸热峰。产物FA-PEG-C60-C2H4-CPT(图4F)在70 ℃有1个大的吸热峰，产物FA-PEG-C60-C6H12-CPT(图4G)在62 ℃有大吸热峰，与以上3种原料不相同，也不同于原料C60-OH(图4D)的峰。以上结果表明3种产物与原料非同一物质，也非原料的混合物，而是形成了共价键。

3.4 3个复合物中喜树碱的质量分数测定

FA-PEG-CPT、FA-PEG-C60-C2H4-CPT、FA-PEG-C60-C6H12-CPT 3个复合物中喜树碱的质量分数分别为7.2%、5.6%、6.5%。从结果看，FA-PEG-CPT、FA-PEG-C60-C2H4-CPT、FA-PEG-C60-C6H12-CPT中平均每个PEG高分子分别接了1.2、1.6、1.9个喜树碱分子，表明载药系统中富勒醇的引入可增加反应位点和水溶性，但是喜树碱为难溶性药物，含量的提高伴随着载药系统溶解度的下降，所以在合成过程中需要注意控制喜树碱的投料量，以及叶酸的投料量，不能只考虑载药量的提高。

 

表1 各喜树碱复合物的核磁共振氢谱(溶剂为氘代DMSO)Table 1 1H NMR spectra of camptothecin-polymer compounds(in DMSO-d6)

  

化合物1H⁃NMRCPT⁃COOH8．70(s，1H，Ar⁃H)，8．17(dd，2H，Ar⁃H)，7．87(t，1H，Ar⁃H)，7．72(t，1H，Ar⁃H)，7．36(s，1H，Ar⁃H)，5．44(s，2H，CH2)，5．29(s，2H，CH2)，2．42(t，2H，CH2)，2．15(t，2H，CH2)，1．88(m，3H，CH3)FA8．65(s)，8．15(d)，7．64(d)，6．95(t)，6．66(d)，4．50(d)，4．33(m)，2．32(t)，2．03(m)，1．91(m)PEG3．80(t)，3．69⁃3．53(m)，3．42(m)，3．13(t)C60⁃OH3．26(s)，1．07(d)弱峰FA⁃PEG⁃CPT8．70(s)，8．64(s)，8．23⁃8．12(m)，7．97(t)，7．87(t)，7．72(t)，7．65(d)，7．61(t)，7．14(d)，6．94(m)，6．65(d)，6．55(d)，5．62(m)，5．49(s)，5．31(s)，4．58(m)，4．48(d)，4．38⁃4．30(m)，3．69⁃3．12(m)，2．42(t)，2．33(t)，2．15(m)，1．95(m)，1．86(m)，1．23(d)，1．05(d)，0．92(t)FA⁃PEG⁃C60⁃C2H4⁃CPT8．68(s)，8．65(s)，8．17⁃8．12(m)，7．82(m)，7．72⁃7．64(m)，7．43(d)，6．96(m)，6．71⁃6．59(m)，4．56(m)，4．48(d)，4．33(m)，3．64⁃3．17(m)，3．07(s)，2．80(s)，2．32(t)，2．03(m)，1．89(m)FA⁃PEG⁃C60⁃C6H12CPT8．68(s)，8．65(s)，8．17⁃8．11(m)，7．82(m)，7．72⁃7．64(m)，7．43(d)，6．96(m)，6．74⁃6．60(m)，4．56(m)，4．48(d)，4．33(m)，3．64⁃3．17(m，PEG)，3．04(s)，2．80(s)，2．33(t)，2．03(m)，1．89(m)

  

A.FA； B.PEG； C.CPT-COOH； D.C60-OH； E.FA-PEG-CPT；F.FA-PEG-C60-C2H4-CPT； G.FA-PEG-C60-C6H12-CPT。

 

图4 各喜树碱复合物的差示热分析(DSC)图Figure 4 DSC spectra of camptothecin-polymer compounds

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关于“自恃燃烧”，燃烧是很普遍的现象，是人类进步的里程碑，也是人们日常生活普遍和离不开的现象。人们在日常生活、生产、科研中有着深刻的认知。化学中认为：燃烧是燃料在高温条件下，发生发光、发热的化学反应，生成新物质。

当胃肠道有严重狭窄性病变时，由于普通胃镜镜身直径的限制，往往造成检查无法完整顺利的完成。我院在引进超细鼻胃镜前，在部分狭窄性病变中使用支气管镜代替胃镜[6]，但由于支气管镜本身缺乏注气注水功能，需在活检管道开口处外接吸氧管，使用便捷性较差，且支气管镜的镜身比胃肠镜短，有不能达到消化道远端的可能，影响检查的完整性，具有局限性。超细鼻胃镜的引进既能够解决临床问题又操作简便，解决了消化道狭窄病变诊疗中的很多难题。