人参首乌(Renshen Shouwu,RSSW)胶囊是2015年版《中国药典》一部收录的中药成方制剂，主要有益气养血的功效，用于气血两虚所致的须发早白、健忘失眠、食欲不振、体疲乏力；神经衰弱见上述证候者[1]。其主要由红参和制首乌组成，现代中药研究发现其主要的药效成分为多种人参皂苷和二苯乙烯苷，具有抗氧化应激损伤、抗炎、调节代谢、抗衰老和抗肿瘤等药理活性[2-5]。本实验室前期研究发现，RSSW提取物对血管性痴呆大鼠的学习记忆和神经损伤具有保护作用[6]，制首乌提取物对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞损伤具有保护作用[7]，RSSW提取物可抑制缺氧复氧诱导的皮质神经元凋亡[8]，RSSW提取物对慢性帕金森病小鼠模型具有显著药效[9]，但RSSW提取物抗帕金森病的具体作用机制尚未明确。因此，本研究主要基于前期药效学的研究结果，从体内和体外两方面探究RSSW提取物的多巴胺能神经保护作用和机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与材料

1.1.1 实验试剂 RSSW提取物为本实验室标准化提取样品，提取工艺与主要成分指纹图谱分析参照前期研究[6]；多聚甲醛、蔗糖等购自天津致远化学试剂有限公司；Tissue-Tek O.C.T. compound 4583为美国樱花公司生产；胎牛血清、DMEM-F12培养基、0.25%胰蛋白酶、细胞培养抗生素(Penicillin Streptomycin)、磷酸缓冲液等购自Gibco®，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；MPP+ iodide、MTT、Edaravone、Triton X-100、Tween 20等购自西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司；兔Anti-Tyrosine Hydroxylase抗体和山羊Anti-Rabbit IgG H&L (HRP)购自艾博抗(上海)贸易有限公司；活性氧(ROS)检测试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒等购自碧云天生物技术公司。

1.1.2 主要仪器 YGQ-300L型组织冰冻切片机(孝感市亚光医用电子技术有限公司)；AXIO Observer A1荧光倒置显微镜(德国ZEISS公司);CO2培养箱(Thermo Scientific Heracell 150) 。

1.2 实验动物

SPF级12周龄雄性C57BL/6小鼠购自广东省实验动物中心，生产许可证号:SCXK(粤)2013-0002。

1.3 方法

1.3.1 小鼠脑酪氨酸羟化酶(TH)免疫组织化学染色 实验动物分为正常对照组、模型组、人参首乌提取物高、低剂量组和美多巴组。正常小鼠采用MPTP/p腹腔注射每周2次，给药5周建立慢性帕金森病小鼠模型[10]，使用不同剂量的RSSW提取物灌胃给药30 d，具体方法如前期报道[9]。实验前晚禁食，实验当天小鼠深度麻醉后，采用左心室灌注预冷的PBS(pH 7.4)冲洗循环系统的血液，后用预冷的4%(φ)多聚甲醛缓冲溶液灌注约5 min。在冰盒上快速分离脑组织，于4 ℃环境下4%多聚甲醛溶液中固定12 h，30%(ρ)蔗糖溶液中脱水过夜，O. C. T. compound包埋后速冻，冰冻切片机切10 μm冠状切片，组织切片样品用含0.25% Triton X-100 的PBS处理10 min，之后用PBS清洗4次，每次5 min，含1% 牛血清白蛋白(BSA)的PBS-T常温封闭30 min，PBS清洗4次，每次5 min，Anti-Tyrosine Hydroxylase抗体(1∶1 000) 4 ℃孵育过夜，PBS清洗4次，每次5 min，HRP-conjugated goat anti-rabbit IgG (1∶5 000)常温孵育1 h，PBS清洗4次，每次5 min，DAB显色，封片，显微镜下观察拍照，照片使用软件ImageJ软件量化神经元数量。

1.3.2 细胞培养 人神经母瘤细胞SH-SY5Y为本实验室细胞库冻存，将SH-SY5Y细胞接种于75 cm2培养瓶中，用含有10%(φ)胎牛血清和100 U/mL青霉素链霉素的DMEM-F12培养基，CO2培养箱设定为37 ℃和含有5% CO2湿润空气的条件维持培养。细胞接种后每24 h观察细胞生长状态，取状态良好的细胞进行实验。

1.3.3 MTT比色法检测细胞活力 取生长状态良好的SH-SY5Y细胞以4×104 cells/mL接种到96孔板，(1)培养24 h后，按照不同MPP+ 浓度(15.6～2 000 μmol/L)分别刺激细胞24 h和48 h；(2)以一定浓度梯度(1～250 mg/mL)的RSSW提取物处理细胞24 h，处理完成后弃去含药的培养液，PBS清洗，加入含有0.5 mg/mL MTT的无血清培养基继续培养4 h，移除培养基，加入150 μL DMSO后置于37 ℃摇床15 min，酶标仪检测波长为570 nm的吸光度(A)值，细胞活力= (处理孔A/对照孔A)×100%。

1.3.4 细胞内ROS检测 取生长状态良好的SH-SY5Y细胞以4×104 cells/mL 接种到24孔板，分别设置不同组别：空白对照组、MPP+诱导的模型组、人参首乌提取物高、中、低剂量组和依达拉奉阳性对照组，以不同浓度RSSW提取物预处理24 h，撤除含药的培养基，PBS清洗后加入含500 μmol/L MPP+的无血清培养基处理24 h。检测时移除培养基后加入含有DCFH-DA的无血清培养基，继续培养20 min，移除培养基，并用培养基洗涤3次，设置滤光片，在荧光显微镜下观察拍照，图像用ImageJ软件量化荧光强度。

1.3.5 统计学处理 实验数据用表示，采用SPSS 23软件进行统计学分析，各组数据之间的比较采用方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSSW提取物对帕金森病小鼠神经元TH活性的影响

TH是多巴胺合成的限速酶，可反映多巴胺能神经元的活性，因此本研究采用TH免疫染色的方法观察RSSW提取物对多巴胺能神经元的影响。实验结果如图1所示，与对照组相比，MPTP/p连续注射5周的小鼠TH阳性神经元数量明显减少(P<0.01)，而经过30 d的RSSW提取物或多巴胺补充剂美多芭给药治疗后，TH阳性神经元数量明显增多(P<0.01)。推测RSSW提取物可抑制帕金森病小鼠脑纹状体多巴胺能神经元的凋亡。

教学实践证明，电工电子技术课程的混合式教学把传统教学方式的优势和基于Moodle平台的线上教学的优势结合起来，既能发挥教师引导、启发、监控教学过程的主导作用，又可充分体现学生作为学习过程主体的主动性、积极性与创造性，从而取得最优化的教学效果。当然，混合式教学的重点不在于混合哪些事物，而在于如何混合。到底采取哪种方式进行混合式教学，才能获得最优的教学效果，值得教学工作者不断地探索和研究。■

从上面的计算得知，即使闭口间隙小于最小值，但通过磨合减小Rz峰值，使闭口间隙增大，达到最小允许值。这时柴油机一般情况下也不会出问题，但会显得很“娇气”。这是由于柴油机进气系统及燃烧过程中难免会有一些微小颗粒产生，闭口间隙难免受到其影响。所以在最小闭口间隙的基础上，其闭口间隙要修整增加0.10mm［7］，满足柴油机在各种恶劣环境下能正常使用，使起重设备更好地适应采区坡长、坡陡及粉尘大的工作环境。

2.2 不同浓度MPP+和RSSW提取物对SH-SY5Y细胞活力的影响

结果如图5所示，与对照组比较，MPP+处理的细胞荧光强度明显增强(P<0.01)；与模型组比较，RSSW提取物与抗氧化剂依达拉奉(Edaravone)给药预处理的细胞组荧光强度均明显降低。提示RSSW提取物可抑制MPP+诱导的细胞内ROS水平升高。

如图4所示，与空白对照组相比，未经过RSSW提取物预处理的细胞活力水平显著降低(P<0.01)，而与模型组相比，浓度为5、25 μg/mL的RSSW提取物预处理24 h的细胞活力显著提高(P<0.05,P<0.01)。提示RSSW提取物可显著改善MPP+诱导的细胞活力下降。

2.3 RSSW提取物预处理对MPP+诱导损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响

分别采用不同质量浓度(1、5、25、100、250 μg/mL)的RSSW处理SH-SY5Y细胞，24 h后用MTT比色法检测细胞活力水平，与对照组(100%)相比，RSSW处理对SH-SY5Y细胞活力有一定影响，细胞活力水平随RSSW浓度升高而降低，如图3。为此，选择细胞活力不低于80%水平作为实验给药浓度，即1 μg/mL、5 μg/mL、25 μg/mL。

2.4 RSSW提取物预处理对MPP+诱导的SH-SY5Y细胞内ROS的影响

与空白对照组相比，MPP+刺激组细胞活力显著下降，且具有一定浓度依赖性。如图2，经各种不同浓度MPP+处理细胞48 h后，细胞活力水平更低。

  

A.正常对照组； B.模型组； C.RSSW提取物低剂量组； D.人参首乌提取物高剂量组； E.美多芭组。

 

与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较： ##P<0.01。

 

图1 RSSW提取物对MPTP/p诱导的帕金森病小鼠脑TH活性的影响

 

Figure 1 Effect of RSSW on the loss of tyrosine hydroxylase positive neurons induced by MPTP/p (50×)

  

图2 MPP+不同浓度和作用时间对SH-SY5Y细胞活力的影响

 

Figure 2 Effect of different concentrations of MPP+ on SH- SY5Y cell viability at 24 h and 48 h (n=5)

  

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

 

图3 不同浓度RSSW处理24 h对SH-SY5Y细胞活力的影响

 

Figure 3 Effect of different concentrations of RSSW on SH-SY5Y cell viability at 24 h

  

与空白对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05,##P<0.01。

 

图4 RSSW提取物预处理对MPP+损伤的SH-SY5Y细胞活力的影响

 

Figure 4 Effect of RSSW pretreatment on the reduced cell viability of SH-SY5Y cells induced by MPP+

  

A. SH-SY5Y细胞对照组； B.模型组； C.依达拉奉预处理组； D、E、F.分别为1 μg/mL、5 μg/mL、25 μg/mL RSSW提取物预处理组。与对照组比较：**P<0.01；与模型组比较：#P<0.05，##P<0.01。

 

图5 RSSW提取物预处理对MPP+诱导的ROS增生的影响(100×)Figure 5 Effect of RSSW pretreatment on the ROS production of SH-SY5Y cells induced by MPP+ (100×)

3 讨论

本实验采用MTT比色法检测不同浓度MPP+作用不同时间对细胞活力的影响，发现MPP+诱导的细胞活力下降呈浓度和时间依赖性，这与之前的研究结果一致[3,16]，且当MPP+暴露浓度在500 μmol/L、暴露时间在24 h，细胞活力为对照组的(61.61±2.99)%，此时细胞处于显著损伤状态但又可能恢复的阶段。此外，本研究还检测了不同浓度的RSSW提取物预处理对细胞活力的影响，结果发现RSSW提取物在质量浓度为1～25 μg/mL并且作用时间在24 h范围内对细胞的活力影响较小(<20%)。综合实验结果，实验中选择1～25 μg/mL RSSW提取物预处理24 h，后在500 μmol/L MPP+暴露24 h的处理方案。

帕金森病是目前第2常见的神经退行性疾病，其主要的病理特征表现在黑质致密部多巴胺能神经元的大幅丢失、轴突营养不良、神经元路易小体的形成等[11-12]。帕金森病的发病原因尚未完全明确，现研究发现线粒体功能紊乱、氧化应激损伤和多巴胺-乙酰胆碱神经递质的平衡系统破化等发病机制均已被证实[11]。MPP+是MPTP在体内的代谢物，能够在细胞线粒体内聚集，造成线粒体功能紊乱，激活氧化应激系统[14]。本实验采用MPTP与丙磺舒联用，抑制MPTP在体内的排泄过程，建立了慢性帕金森病小鼠模型；使用MPP+处理人神经母瘤细胞SH-SY5Y，能较好的模拟帕金森病中神经元的损伤状态[15]。研究发现RSSW提取物能够抑制帕金森病多巴胺能神经元的丢失，进一步研究发现，RSSW提取物能够提高MPP+诱导的细胞模型的细胞活力水平，降低细胞ROS水平。

氧化应激损伤发生在几乎所有的神经退行性疾病之中，表现为细胞活性氧簇与抗氧化机制的失衡[17]，线粒体功能损伤造成的氧化应激是致使帕金森神经元损伤的主要病因之一，最终导致这些神经元凋亡或坏死[18]。ROS的产生导致细胞功能的急性损伤，是神经退行性疾病包括帕金森病发展的重要因素之一[19]。细胞内的MPP+阻断电子传递链中复合酶体Ⅰ，抑制ATP的合成进而造成ROS的过度产生，最终导致多巴胺能神经元的损伤或凋亡。依达拉奉是一种自由基清除剂，前期研究发现其能够通过阻断活性氧簇和过氧氮化物的形成保护MPTP损伤的多巴胺能神经元[20-21]，因而本实验采用依达拉奉抗ROS生成作为阳性对照组。本实验采用500 μmol/L的MPP+刺激细胞24 h，发现细胞内ROS的水平显著升高，而RSSW提取物或依达拉奉预处理均能显著抑制MPP+诱导的胞内ROS水平升高，且呈一定剂量依赖性。

矿区内V-04、V-38、VI-09、VI-11、VI-16、VI-17、VI-20、VI-218个矿体为前5年开采矿体。

本研究发现RSSW提取物可明显抑制小鼠MPTP诱导的帕金森病样多巴胺能神经元损失，并且进一步研究发现RSSW提取物可显著抑制MPP+诱导的ROS水平升高，并显著改善MPP+诱导的细胞活力下降，抑制氧化应激造成的损伤，但具体信号传导通路有待进一步研究。综合结果说明，RSSW提取物可能通过抗氧化途径改善多巴胺能神经元的细胞活力从而抵抗MPTP及其代谢产物的神经毒性对神经元损伤引起的细胞凋亡。

冯可儿的电话，总是可以这样滔滔不绝地打下去。冯可儿不说再见，对方可能会永远陶醉在冯可儿的声音里，不可自拔。高潮坐在一边，翘着二郎腿，望着墙上的挂钟，一支接一支地抽烟。终于，冯可儿的电话打完了。高潮起身走到冯可儿面前，说，老板，小高等着跑腿给你寄快件呢。

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