竭红跌打凝胶贴膏是我室在传统名方“竭红跌打”方(标准编号:WS3—B—2814—97)的基础上开发的新型中药复方制剂，主要由血竭、当归尾、苏木、没药、安息香等十味中药材组成，用于跌伤、筋骨损伤、积瘀肿痛的治疗。为保证本品疗效,有效控制其质量,本文建立了方中当归尾、苏木、没药、安息香等药材的薄层鉴别方法，同时采用HPLC法对该制剂中的血竭素进行定量测定，以期建立该制剂的质量标准，为竭红跌打凝胶贴膏的临床应用和进一步开发奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器

戴安高效液相色谱仪(Ultimate 3000色谱泵，Ultimate 3000PAD检测器)；BA110S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)；KQ-100超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；ZF-90暗箱式紫外投射仪(上海顾村电光仪器厂)；硅胶G薄层板(自制)。

③后续检查。后续检查一般由水库管理人员或专业技术人员进行。根据详细检查提出的意见以及震损水库险情特点及其发展情况，定期进行巡视检查与监测，包括临时增设的监测设施，观测与记录大坝损伤的特征、位置和程度以及情况变化的速率。相关内容也应同时观测，如库水、尾水水位，天气状况，涌泉或渗漏等，以了解险情发展，判别是否产生新的险情，检查评估应急处置效果等。每次余震后应加强检查，以评估余震对大坝的影响。

1.2 试药

血竭素高氯酸盐对照品(批号：110811-201105)、当归尾对照药材(批号：121054-201306)、安息香对照药材(批号：121186-201101)均购于中国食品药品检定研究院；没药对照药材(批号：121250-200503)、苏木对照药材(批号：121067-200503)均购于中国药品生物制品检定研究所；竭红跌打凝胶贴膏(规格:25 g/贴，本教研室自制，批号：20151115、20151118、20151123)；甲醇(色谱纯)；H3PO4(分析纯)；水(超纯水)。

2 薄层色谱鉴别

2.1 当归尾的鉴别[1-2]

取竭红跌打凝胶贴膏2 g，除去盖衬，剪碎，加乙醚10 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率45 kHz) 10 min，滤过，作为供试品溶液。取按竭红跌打凝胶贴膏处方配制的缺当归尾单味药材的样品1贴，同法制备阴性样品溶液。取当归尾对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液，避光，放置过夜，滤过，作为对照药材溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点样于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(体积比17∶3)为展开剂，展开，取出晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照药材相应的位置上，显蓝色荧光斑点，而阴性无干扰，见图1。

  

1.竭红跌打凝胶贴膏； 2.当归尾对照药材； 3.缺当归尾阴性样品。

 

图1 当归尾的TLC鉴别图Figure 1 The TLC of Cauda angelica

2.2 苏木的鉴别[3]

精密量取血竭素高氯酸盐对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5 mL，分别置于5 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为9.85、19.69、29.54、39.44、49.23 μg/mL的系列对照品溶液。按上述“3.1”项色谱条件下进行测定。以对照品质量浓度对峰面积进行线性回归，得回归方程为Y=0.166 4x+0.005 8，r=0.999 9。结果表明主成分血竭素在9.85～49.23 μg/mL质量浓度范围内呈良好的线性关系。

  

1.竭红跌打凝胶贴膏； 2.苏木对照药材； 3.缺苏木阴性样品。

 

图2 苏木的TLC鉴别图Figure 2 The TLC of Sappan lignum

2.3 没药的鉴别

取竭红跌打凝胶贴膏2 g，除去盖衬，剪碎，加石油醚(60～90 ℃)10 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率45 kHz) 10 min，滤过，作为供试品溶液。取按竭红铁打凝胶贴膏处方配制的缺没药单味药材的样品1贴，同法制备阴性样品溶液。取没药对照药材0.1 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述3种溶液各10 μL，分别点于同一硅胶G板上，以甲苯-丙酮(体积比20∶1)为展开剂，展开，取出晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃烘干，置紫外光灯(365 nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照药材相应的位置上，显黄绿色荧光斑点，而阴性无干扰，见图3。

色谱条件: 色谱柱:Kormasi C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相:乙腈-0.05 mol/L NaH2PO3溶液(体积比50∶50);流速:1.0 mL/min；检测波长:440 nm;柱温：40 ℃。理论塔板数按血竭素峰计算应不低于4 000。

精密吸取配制好的同个一供试品(批号：20151115)溶液，每隔一定时间(0、2、4、6、8、10 h)，重复进样10 μL，依照“3.1”项下色谱条件测定峰面积，结果RSD值为1.47%(n=6)，表明样品供试品溶液在10 h内稳定性良好。

  

1.竭红跌打凝胶贴膏； 2.没药对照药材； 3.缺没药阴性样品。

 

图3 没药的TLC鉴别图Figure 3 The TLC of Myrrha

2.4 安息香的鉴别

分别取同一批样品(批号：20151115)6份，照“3.2.2”项下供试品溶液的制备方法操作，依照“3.1”项下色谱条件进行测定，结果测得该批号凝胶贴膏中血竭素平均含量为0.19 mg/g，RSD为4.34%，表明方法重复性较好。

  

1.竭红跌打凝胶贴膏； 2.安息香对照药材； 3.缺安息香阴性样品。

 

图4 安息香的TLC鉴别图Figure 4 The TLC of Benzoinum

3 HPLC法测定竭红跌打凝胶贴膏中的血竭素

3.1 色谱条件与系统适用性试验

炎性因子:患者于治疗前、治疗后,抽取晨间空腹外周静脉血,检测IL-6(白介素-6)、IL-8(白介素-8)、TNF-α(肿瘤坏死因子-α)水平。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液 精密称取血竭素高氯酸盐对照品33.9 mg，置50 mL棕色量瓶中，加质量分数3%磷酸甲醇溶液并稀释至刻度，摇匀，精密量取2 mL,置10 mL棕色量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得每1 mL中含血竭素98.46 μg的对照品溶液(以血竭素计算,换算关系为血竭素质量=血竭素高氯酸盐质量/1.377)。

3.2.2 供试品溶液 揭去竭红跌打凝胶贴膏覆膜和背衬材料，取膏体约10 g，精密称定，加甲醇适量，研匀，转移至50 mL棕色量瓶中，超声处理(300 W，45 kHz)10 min，用3%的磷酸甲醇溶液定容至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性样品溶液 取不加血竭的缺味制剂，按“3.2.2”项下方法制成阴性样品溶液。

3.3 专属性试验

分别称取己知血竭素质量分数的竭红跌打凝胶贴膏(批号：201501115)6份，每份约5 g，精密称定。按照“3.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密添加血竭素高氯酸盐(按血竭素计算)适量，依照“3.1”项下色谱条件测定样品中血竭素的质量分数，计算回收率，所得平均加样回收率为98.1%，RSD为2.35%(n=6)，结果表明方法回收率较高，见表1。

（1）教师在“小记者”访问“孟母”之前，提醒学生注意当时的情境。（2）请学生想象自己是一位编辑，为这段“访问”写一个标题。标题要符合“小记者”和“孟母”的谈话内容，更要用字简单。（3）将标题写在纸上。（4）全班学生评学生所写的新闻标题。

  

A.对照品; B.供试品; C.阴性样品； 1.血竭素。

 

图5 竭红跌打凝胶贴膏血竭素色谱图

 

Figure 5 Chromatograms of dracorhodin in Jiehong Dieda Gel paste

3.4 线性范围的考察

取竭红跌打凝胶贴膏2 g，除去盖衬，剪碎，加甲醇10 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率45 kHz)处理10 min，滤过，作为供试品溶液。取按竭红跌打凝胶贴膏处方配制的缺苏木单味药材的样品1贴，同法制备阴性样品溶液。取苏木对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各6 μL、对照药材溶液4 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-丙酮-甲酸(体积比8∶4∶1)为展开剂，展开，取出晾干，12 h后置紫外光灯(254 nm)下检视。供试品色谱图中，在与对照药材相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，而阴性无干扰，见图2。

徐云天3岁那年，时年27岁的徐河成立包工队，只好把儿子丢给年迈的爷爷。邻居李婶见孩子可怜，经常将徐云天接到家中，而徐云天也喜欢呆在李婶家，因为她家有“小姨”廉小花。时年24岁的廉小花原籍唐山市，李婶是她的表舅妈，廉小花全家迁入秦皇岛市后，她常来串亲戚。第一次听说小云天的身世，善良的廉小花把3岁多的小云天搂在怀里，唏嘘不已。此后，她每次来，都会给小云天买些衣服食品。渐渐地，小云天特别依恋她，几天不见，就会焦躁不安。

3.5 精密度试验

精密吸取质量浓度为29.54 μg/mL对照品溶液，连续进样5次，依照“3.1”项下色谱条件测定峰面积，结果计算RDS值为0.87%(n=5)，表明仪器的精密度良好。

3.6 稳定性试验

实验诊断是临床诊疗中的一个基本环节，其工作质量要靠临床医护人员和检验人员共同努力来保证，故广大医护人员有必要了解临床实验工作程序，并与检验人员一起加强检验与临床的交流与合作，共同建立完善的临床实验室全面质量保证管理体系。本研究通过发现与分析送检急诊血液标本质量的问题，旨在与临床医护人员一起做好实验结果的质量保证，共同努力为临床诊疗提供及时、准确、可靠、有价值的诊断依据。

3.7 重复性试验

取竭红跌打凝胶贴膏2 g，除去盖衬，剪碎，加乙醚10 mL，密塞，超声处理(功率300 W，频率45 kHz) 10 min，滤过，作为供试品溶液。取按竭红跌打凝胶贴膏处方配制的缺安息香单味药材的样品1贴，同法制备阴性样品溶液。取安息香对照药材0.4 g，同法制成对照药材溶液。吸取供试品溶液和阴性对照溶液各10 μL、对照药材溶液5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(体积比7∶3)为展开剂，展开，取出晾干，喷以质量分数10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃烘至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，而阴性无干扰，见图4。

3.8 加样回收率测定

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液、阴性样品溶液各10μL，注入液相色谱仪，依照“3.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，结果见图1。由图1可见，血竭素峰与其他色谱峰之间完全分离，阴性样品无干扰。

 

表1 竭红跌打凝胶贴膏中血竭素加样回收率试验

 

Table 1 Recovery results of dracorhodin in Jiehong Dieda Gel(n=6)

  

取样量/g样品中的量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%5．04620．95880．98461．9635102．04．94820．94020．98461．901597．65．03510．95670．98461．896495．44．93340．93730．98461．887396．55．02980．95570．98461．920898．05．08550．96620．98461．942699．2平均回收率=98．1%；RSD=2．35%

3.9 竭红跌打凝胶贴膏中血竭素的测定

取竭红跌打凝胶贴膏，按“3.2.2”项下方法制备3份平行供试品溶液，按“3.1”项下色谱条件测定，结果测得3批供试品中血竭素的平均质量分数分别为0.22、0.19、0.23 mg/g。

4 讨论

本文建立了竭红跌打凝胶贴膏方中当归尾、没药、苏木、安息香的TLC鉴别方法，该方法特征斑点明显、分离清晰，可用作竭红跌打凝胶贴膏当归尾、没药、苏木、安息香的专属性鉴别。

血竭为“竭红跌打”方中君药，具有活血散瘀、消肿生肌、止痛、止血的功效[4-5]，也有采用相对廉价的龙血竭替代血竭的研究报道[6]，虽然两者药理作用相似[7]，但实际是2种截然不同的药材，且龙血竭至今未被《中国药典》收录。血竭的主要有效成分为血竭素[8]，本研究采用高效液相色谱法对血竭素进行测定。据文献报道,血竭存在对热不稳定性[9],因此，本文选用了无加热的超声提取法，并比较了不同超声处理时间对提取结果的影响,结果表明超声处理10 min,血竭素即可提取完全。

本文只对竭红跌打凝胶贴膏主要活性成分之一血竭素进行了测定,并把它作为质量控制的关键指标。今后还将对其他成分的测定方法进行研究,不断提高制剂的质量控制标准,为临床安全用药提供有力的科学依据。

参考文献:

[1] 罗建明,李智勇.归附调经颗粒的质量标准研究[J].中药材,2011,34(8):1295-1298.

[2] 李乔,肖斌,张春玲,等.沈阳红药气雾剂的质量标准[J].现代药物与临床，2011,26(4):302-306.

[3] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[M]．北京：中国医药科技出版社，2015：164.

[4] 向金莲,程睿,张路晗.血竭的活血和止血作用研究[J].华西药学杂志,2000,15(6):430 -434.

[5] 马建建，宋艳，贾敏，等.血竭总黄酮对血小板聚集、血栓形成及心肌缺血的影响[J].中草药,2002,33(11):1008-1010.

[6] 白才堂，吕竹芬，邬威尧，等. HPLC法测定竭红跌打贴膏剂中龙血素A和B的含量[J].中国药师，2010，13(10):1465-1466.

[7] 石聪,于浩飞,胡炜彦,等.进口血竭与国内血竭的研究对比[J].现代生物医学进展,2011,23(11):4790-4792.

[8] 陈军霞,邱碧菡,潘林梅,等.血竭的现代研究[J].现代中药研究与实践，2011,25(3)：81-84.

[9] 徐淑卿,沙明,孟宪生.血竭的稳定性研究[J].中成药，2005,27(5):598-599.