目前，恶性肿瘤在世界范围内已成为严重威胁人类健康的常见病、多发病，我国癌症的发病率和死亡率在逐年上升。据2017年公布的癌症统计资料显示，新发病人数429万左右，因癌症死亡人数近281万[1]。手术、放疗、化疗是现代医学公认的肿瘤治疗三大手段，这些方法虽然能使部分病灶暂时予以控制，但是在杀伤肿瘤细胞的同时，也损伤了人体某些功能，降低患者生活质量，并为肿瘤的复发或转移留下了潜在的危险因素。因此，目前比较公认的另一种肿瘤治疗方法是中医药综合治疗，尤其是在放、化疗的同时辅以中医中药的补肾健脾、扶正固(培)本等被认为是一种基础疗法，临床实践表明中医药综合治疗明显调整机体免疫功能和改善症状，成为中医药治疗肿瘤的重要特色[2-3]。本医院在大样本证候调查聚类分析的基础上，提出前列腺癌总的病因病机特点为本虚标实、以虚为主，虚证以气阴两虚或脾肾两虚为多见，其中激素难治性前列腺癌的病机主要为肾阳亏虚，阴精耗竭[4]。因此，临床以补肾法为基本治则治疗前列腺癌取得了良好疗效，本研究主要探讨补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞的增殖和凋亡的影响。

1 材料与仪器

1.1 药品和试剂

补肾抑瘤汤由淫羊藿、补骨脂、女贞子、关黄柏等组成，中药饮片均为康美药业有限公司产品，将各药饮片浸泡1 h，常规水煎煮并浓缩为2.8 g生药/mL的水煎液。DMEM培养基、胎牛血清为Gibco公司产品;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)试剂为Sigma 公司产品。

1.2 主要仪器

2406-2型CO2培养箱(SHELLAB公司)；680型酶标仪(Bio-Rad公司)；3-30K低温离心机(Sigma公司)；FACScalibur流式细胞仪(BD公司)。

1.3 实验动物

雄性SPF级SD大鼠，由广州中医药大学实验动物中心提供，体质量180～220 g，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0034。

2 方法

2.1 含药血清制备及分组

30只大鼠，按体质量随机分为空白对照组(15只)、补肾抑瘤汤组(15只)。每天相同时间灌予中药1次(10 mL/kg)，连续7 d，空白组予以等体积的蒸馏水。末次给药前大鼠禁食不禁水12 h，末次给药后1 h乙醚麻醉，眼眶取血，分离血清，每组混合成一管，56 ℃灭活抗体30 min，0.22 μm滤器除菌，获得空白对照血清和补肾抑瘤汤含药血清，-80 ℃冰箱保存。

2.2 细胞培养及细胞形态观察

上述试验显示，BT对各级哮喘均可发挥良好的治疗效果，但在试验设计方面存在共同的不足之处，即均未设置假手术组，未能完全排除支气管镜的安慰剂作用。

2.3 MTT法检测细胞增殖

在含有相同数量PC-3细胞的96孔培养板，分别加入不同体积的含药血清和空白血清，使各组血清终浓度分别为2.5%，5%，10%，15%。实验结果表明，含药血清处理36～48 h后，A值明显低于空白血清组，提示补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞增殖有明显抑制作用。结果见图3。

在研究各种工艺参数影响的基础上，根据实际应用及统计分析确定每个因素的最高与最低水平，进行4因素的响应面设计，共27组，每组试验均重复3次。试验结果进行二次响应面回归建模，并预测最佳工艺参数。

2.4 细胞周期及凋亡检测

将对数生长期的PC-3细胞接种于培养皿，24 h后加不同浓度的补肾抑瘤汤含药血清，空白对照组加入等浓度的空白血清，继续培养细胞。分别在36 h、48 h收集各组细胞，70%(φ)乙醇固定过夜，PBS清洗后重悬于含有50 μg/mL PI和10 mg/mL RNAase的PBS，37 ℃避光孵育20 min，采用流式细胞仪测定各样品的细胞周期及凋亡率。

当救护队的五个女兵像春风飘进战场，一下吹走了男兵心中的荒凉时，在战场，她们就是一群圣洁的天使，是一朵朵绚丽的鲜花，谁敢对她们有一丝一毫的非分之想啊？

3 结果

3.1 补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞形态的影响

不同浓度补肾抑瘤汤含药血清处理PC-3细胞36 h后，G0/G1期细胞比例无明显变化，而G2/M期细胞比例出现浓度依赖性增加，S期细胞比例逐渐降低，10%和15%含药血清与空白血清组比较差异均有统计学意义，表明存在G2/M期阻滞。此外，36 h各浓度含药血清组凋亡细胞比例均显著高于空白血清组(P<0.05)，48 h的细胞凋亡率10%和15%含药血清与空白血清组比较均有统计学意义(P<0.05)。结果见表1和表2。

3.2 补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞增殖的影响

将对数生长期的PC-3细胞用DMEM培养液调成1×105个/mL的细胞浓度，接种于96孔板，24 h后药物组加入不同浓度的补肾抑瘤汤含药血清，空白对照组加入等浓度的空白血清，每组设5个平行孔，将培养板置于培养箱中继续培养36～48 h，在额定时间每孔加入MTT 20 μL，继续培养4 h，吸去上清液，加入DMSO后摇匀10 min，采用酶标仪测定490 nm的吸光度(A)值，以A值比较各组细胞增殖情况。

将PC-3细胞接种于DMEM完全培养基中(含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和链霉素)，置于37 ℃、5%(φ)CO2条件下的CO2培养箱常规培养，2～3 d更换1次培养基，待细胞长到80%～90%时以0.25%胰蛋白酶消化、传代。每天在倒置显微镜下观察细胞的生长状况，拍照记录细胞形态变化。

  

图1 补肾抑瘤汤含药血清作用于PC-3细胞36 h的各组细胞照片(400×)Figure 1 Morphology of PC-3 cells treated with BSD medicated serum at 36 h (400×)

  

图2 补肾抑瘤汤含药血清作用于PC-3细胞48 h的各组细胞照片(400×)Figure 2 Morphology of PC-3 cells treated with BSD medicated serum at 48h (400×)

  

Con.空白血清； BSD.含药血清；与相应浓度的空白血清组比较:*P<0.05，** P<0.01。

 

图3 补肾抑瘤汤含药血清作用36 h和48 h对PC-3细胞增殖的影响

 

Figure 3 Effect of BSD medicated serum on PC-3 cell proliferation at 36 h and 48 h

3.3 补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞周期和凋亡的影响

PC-3细胞贴壁生长，正常情况下呈梭形、多角形，细胞排列致密，生长状态良好。经各浓度含药血清处理36 h、48 h后，PC-3细胞发生了形态学变化：细胞数减少，细胞体积不同程度缩小，有的细胞核固缩碎裂成数个圆形颗粒， 尤以5%、10%、15%含药血清比较明显，提示补肾抑瘤汤对PC-3细胞生长具有一定抑制作用。结果见图1、图2。

4 讨论

细胞过度增殖是恶性肿瘤的生物学特性之一，因此，应用以细胞毒为主的抗肿瘤药进行化学治疗仍然是肿瘤综合治疗的重要手段。但是抗肿瘤药物对肿瘤细胞的选择性低，在损伤肿瘤细胞的同时，对正常的组织细胞也有一定程度的损伤[5]。大量研究资料证实，中医药能延长肿瘤患者生存时间、改善生活质量、减轻放化疗毒副作用[2-3]；除了调节机体免疫功能，中药本身也可以通过直接细胞毒作用、促进肿瘤细胞凋亡、逆转肿瘤多药耐药性等途径抑制肿瘤[6]。

正因张全文在这些问题上的严肃指教，本性调皮、爱玩的张伦对待涉及到原则性的问题时也颇为谨慎，知当有为、有不为。

 

表1 补肾抑瘤汤含药血清作用36 h后对PC-3细胞周期各时相的影响

 

Table 1 Effect of BSD medicated serum on PC-3 cell cycle at 36

  

组别血清浓度/%G0/G1SG2/M空白血清563．13±6．0519．59±3．3515．97±3．491054．88±3．1125．55±2．5417．70±4．571557．51±5．1919．40±1．6118．92±4．34补肾抑瘤血清561．13±6．1716．19±4．3318．23±4．191051．19±0．1720．18±1．52∗27．07±0．49∗1552．85±1．9113．93±2．59∗31．57±0．10∗∗

与相应浓度的空白血清组比较:*P<0.05，**P<0.01。

 

表2 补肾抑瘤汤含药血清对PC-3细胞凋亡的影响

 

Table 2 Effect of BSD medicated serum on PC-3 cell

  

组别血清浓度/%36h48h空白血清55．10±0．103．96±0．18105．15±0．054．48±0．14155．05±0．053．67±0．16补肾抑瘤血清57．40±0．30∗4．39±0．131010．25±0．85∗8．17±0．75∗1516．85±0．65∗9．96±0．71∗

与相应浓度的空白血清组比较：*P<0.05。

前列腺癌是欧美男性中发病率第1位的恶性肿瘤[7]，近年来在我国发病率呈快速上升的趋势。患者初期对雄激素剥夺治疗有反应，但最终形成去势抵抗性前列腺癌并且预后不良。内分泌治疗失败后，细胞毒性的化疗一度被证明是唯一的可以延长前列腺癌患者生存期的治疗方案,随着人们对该病认识的不断加深，许多可以延长患者生存期的药物或治疗手段陆续被应用于临床[8-9]。中医认为，前列腺癌的发生发展包括内因和外因两方面，内因主要为肾气亏虚，外因多为痰、湿、瘀、毒等兼夹，内因和外因相互作用，导致机体功能失调，瘀血痰湿聚积下焦，形成癌肿。故前列腺癌总的病机特点为本虚标实，以虚为主，虚证又以肾虚为首。本院通过大样本证候调查聚类分析表明，激素难治性前列腺癌的病机主要为肾阳亏虚，阴精耗竭[4]。临床研究表明，中医补肾方药能明显改善前列腺癌患者的生存质量、减少骨转移事件。本实验结果表明，经补肾抑瘤汤含药血清处理36 h、48 h后，PC-3细胞可发生不同程度的形态学变化，细胞增殖明显受到抑制；不同浓度补肾抑瘤汤含药血清诱导PC-3细胞36 h后，G2/M期细胞比例出现浓度依赖性增加，S期细胞比例逐渐降低，10%和15%含药血清与空白血清组比较均有统计学意义；36 h各浓度含药血清组凋亡细胞比例均显著高于空白血清组(P<0.05)。上述结果提示补肾抑瘤汤含药血清使前列腺癌PC-3细胞周期受阻于G2/M期,从而抑制肿瘤细胞增殖，同时该方可能通过激活某种途径促进肿瘤细胞的凋亡。细胞凋亡是由多因素、多分子参与的复杂过程，且与自噬之间存在着复杂的交互调控关系，凋亡失调也是肿瘤发生侵袭转移的基本前提[10]。最新研究发现肿瘤细胞存在自噬异常现象，促进肿瘤细胞自噬性死亡可能促进抗肿瘤作用的发挥[6，11]，这为今后中药抗肿瘤治疗研究提供了新的线索和方向。

参考文献:

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[6] 张甘霖，杨国旺，于明薇，等.自噬——中医药抗肿瘤研究的新方向[J]. 中华中医药杂志，2014，29(2):507-510.

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