铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)是一种名贵的中草药，又名铁皮枫斗、黑节草等，为兰科石斛属多年生附生草本植物的全草。其独特的生长环境和保健功效，使之有“救命仙草”的美誉[1]，是我国传统滋阴名贵中药材之一，含有多糖类、挥发性成分及其衍生物等功能性成分[2]。铁皮石斛多糖为铁皮石斛的主要生物活性成分，铁皮石斛的多糖质量分数越高，质越重，质量更优，其生理活性越强[3]。

中医在用铁皮石斛时，常要求以铁皮石斛鲜品入药，现代药理研究表明，鲜药与干品的药理作用有差异，且在一些疾病治疗中鲜品胜于干品[4]。临床使用发现，铁皮石斛鲜用对治疗慢性胃病有良好的效果，鲜用榨汁后的效果更为显著[5]。

中药材有效成分的溶出与其粉碎程度具有密切的关系，随着破壁率的提高可以改善有效成分的溶出，提高中药材的利用价值，改善产品的质量[6]。本试验以薄壁细胞为特征指标，建立铁皮石斛破壁率的测定方法，并研究其干品粉末和鲜品榨汁的破壁率与多糖溶出量的关系，为粉体的制备、提高中药材的利用率和铁皮石斛的鲜用提供一定的理论依据。

随着煤矿巷道掘进机械化的发展，巷道的掘进功率不断增大，随之产生的岩石粉尘与煤炭飞尘也随之增大，大量的呼吸性粉尘以及小粒径粉尘随风流扩散，导致巷道内粉尘浓度居高不下。粉尘所具有的某些物理化学性质对工作人员的健康以及采掘工作的安全与效率都埋下了隐患。一方面大量的煤尘具有爆炸性，我国煤矿的开采条件差导致了煤尘爆炸危险普遍存在，倘若爆炸发生，将造成严重的人员财产损失。另一方面，矿井粉尘中含有大量的呼吸性粉尘(粒径<5 μm)可长时间悬浮于空气中且难以沉降，煤矿工人长期暴露在这样的工作环境导致肺部沉积大量小粒径粉尘，严重威胁工作人员的身体健康[1-2]。

1 仪器与试药

1.1 仪器

DFT-200粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；JYL-Y92破壁料理机(九阳股份有限公司)；DV130OPTEC奥特光学显微镜(重庆奥特光学仪器有限公司)；TGL-20B高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；CP225D电子天平(德国Sartorius，十万分之一)；BS224S电子天平(德国Sartorius，万分之一)； UV-1800紫外-可见分光光度仪(日本岛津公司)；GZX-9246电热恒温鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)。

精密吸取供试品50 μL，装片，确保不溢出，置奥特光学显微镜下观察，结果见图1。可见，铁皮石斛最细粉可见晶纤维、薄壁细胞、表皮细胞、导管、棕色块、淀粉粒等，其中薄壁细胞未完全打碎，容易计数，并且分散较为均匀。故以铁皮石斛最细粉中完整的薄壁细胞为指标计数，计数时以显微镜下的1个视野为1个计数单位，每个样品浓度取25个视野，取平均值作为计数结果。以称样量为横坐标，1个计数单位完整的薄壁细胞个数为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程y=2.891 2x-0.042 1(r=0.995 6)，表明铁皮石斛最细粉的称样量在.050～0.350 g范围内与完整薄壁细胞个数线性关系良好，可用来作为显微特征计数。

1.2 试剂及药材

将铁皮石斛鲜条洗净，切段，放入破壁机中，加入4倍量水匀浆，控制温度在20 ℃以下，35 000 r/min超声10 min，收集鲜铁皮石斛浆液，过200目纱网即为鲜铁皮石斛汁，以下简称鲜汁。

精密量取“3.1”项下对照品储备液0.2、0.4、0.6、0.7、1.0 mL于10 mL具塞试管中，各加水补至1.0 mL，其余步骤按“3.2”项自“精密加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法操作，得回归方程Y=0.008 3X+0.063 7(r=0.999 5)，表明多糖质量在18.12～90.6 μg之间与吸光度具有良好的线性关系。

2 铁皮石斛破壁率的测定

2.1 样品制备

企业基建项目财务管理工作的进展是需要有完善的监督机制加以控制，以保证财务管理工作的正常进展。但是在实际的企业的管理工作中，很多企业基建项目财务管理工作都没有相关的完善的监督机制，而且监督机制往往都是在表明上进行的，没有深入的进行监督。这样的情况对于企业的财务管理是没有任何作用的，甚至会对财务管理产生副作用，导致一些腐败现象的发生。不完善的监督机制致使企业财务管理中存在的问题不能被及时发现，进而影响企业的经济效益。

铁皮石斛购于云南芒市(批号：20161219)，经广东药科大学何伟教授鉴定为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo的新鲜茎。将部分鲜铁皮石斛60 ℃烘干7 d，得到铁皮石斛干品。鲜品水分为82.42%，干品为3.17%。

2.2 铁皮石斛最细粉细胞计数及其标准曲线绘制

取铁皮石斛最细粉，精密称定0.050 5、0.099 9、0.151 0、0.200 8、0.250 4、0.300 1、0.349 8 g，分别置于25 mL量瓶中，加体积分数60%乙醇2 mL至完全分散，迅速加蒸馏水定容至刻度并混匀。

矿区内圈出Ⅰ号、Ⅱ号铅锌矿体，赋存于硅化强烈的阿克沙克组灰岩中，矿体呈透镜状，其长轴方向与围岩走向平行，产状与围岩基本一致(图5)，局部有穿层现象，同时在铅锌矿体中亦可见灰岩的残留体。

重庆及各子课题组的专家及教师近百次到美国、英国、新加坡、爱尔兰及中国港澳台地区做专题报告，或执教创新教学示范课，推广创新学习研究成果。尤其是创新学习实验学校教师在新加坡和中国港澳台地区执教的现场课，得到了高度的评价。几位农村学校成长的教师在新加坡上的一节小学数学与中学语文创新学习课，得到南洋理工大学教授的高度评价，“让我们重新认识了中国老师的课”。

  

A.表皮细胞; B.薄壁细胞。

 

图1 铁皮石斛特征细胞图Figure 1 Characteristic cell map of D. officinale(200×)

2. 3 铁皮石斛最细粉细胞计数方法学考察

2.3.1 精密度试验 精密称取铁皮石斛最细粉0.200 2 g，按“2.2”项下方法，定容至刻度后，取样，制片，于显微镜下观察，分别观察6次25个视野，结果每次平均完整细胞个数分别为0.520、0.560、0.520、0.560、0.520、0.520，RSD值为3.9%，表明方法精密度较好。

2.3.2 稳定性试验 精密称取铁皮石斛最细粉0.200 4 g，按“2.2”项下方法，定容至刻度后，分别于0、3、6、9、12 h 取样，制片，于显微镜下观察，结果每次平均完整细胞个数分别为0.440、0.440、0.440、0.480、0.480，RSD值为7.5%，表明本测定方法在12 h内较为稳定。

2.3.3 重复性试验 取同一铁皮石斛最细粉6 份，按“2.2”项下方法，定容至刻度后，取样，制片，于显微镜下观察，结果每次平均完整细胞个数分别为0.560、0.520、0.480、0.480、0.480、0.520，RSD值为6.4%，表明方法重复性较好。

2.4 铁皮石斛细胞破壁率的检测

取铁皮石斛粗粉、50目粉、最细粉、极细粉与微粉，精密称取约0.2 g，取铁皮石斛鲜汁，精密称取约5.5 g(相当于鲜药材1.1 g)，均按“2.2”项下方法，定容至刻度后，室温下取样，制片，于显微镜下观察，分别观察25个视野，结果见图2。可见，粗粉中可见大量未破壁的薄壁细胞；50目粉、最细粉和极细粉偶见单个完整的薄壁细胞；微粉和鲜汁未见完整的薄壁细胞。根据完整薄壁细胞个数、混悬液体积、称样量，按公式(1)计算铁皮石斛粗粉、50目粉、最细粉、极细粉和微粉和鲜汁的显微特征个数，结果见表1。

M=XV/V′W

(1)

式中：M为铁皮石斛粉末或鲜汁显微特征个数；X为每个盖玻片下的完整细胞个数；V为铁皮石斛混悬液总体积(mL)；V′为盖玻片下混悬液体积(mL)；W为铁皮石斛称样量(g)。

取铁皮石斛干品，粉碎，参照文献[7-11]将粉末分为以下等级：粗粉，能全部通过二号筛，但混有能通过四号筛不超过40%的粉末；50目粉，全部通过三号筛的粉末；最细粉，能全部通过六号筛，并含能通过七号筛不少于95%的粉末；极细粉，能全部通过八号筛，并含能通过九号筛不少于95%的粉末；微粉，能全部通过细胞筛(300目)的粉末。

564 Effect of optimal timing of internal fixation on postoperative complications in multiple rib fracture patients

再根据铁皮石斛粗粉、50目粉、最细粉、极细粉、微粉和鲜汁的显微特征个数，按公式(2)计算细胞破壁率，结果见表1。

Y=(A细-Ax)/A细×100%

(2)

分别取“3.1”项下的对照品溶液和供试品溶液各1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，按“3.2”项自“精密加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法操作，供试品溶液不加显色剂为阴性对照；以水代供试品，自“精密加入5%苯酚”起依法操作，制备空白溶液，用紫外可见分光光度计进行波长扫描，记录可见光扫描图，见图3。可见，对照品溶液和铁皮石斛干品供试液、铁皮石斛鲜品供试液紫外扫描吸收近乎相同，阴性对照样品无干扰，表明方法专属性较好。

  

A.粗粉; B.50目粉; C.最细粉; D.极细粉; E.微粉; F.鲜汁。

 

图2 铁皮石斛干粉及鲜汁薄壁细胞图

 

Figure 2 Parenchyma cells in dried powder and fresh juice of D. officinale(200×)

 

表1 铁皮石斛薄壁细胞个数计算的相关参数

 

Table 1 Related parameters for the calculation of the number of podocytes in D. officinale(n=25)

  

样品W/gX/个(x±s)M/g-1Y/%粗粉0．20051．28±1．463200-166．6750目粉0．20030．64±1．231600-33．13最细粉0．20000．480±1．0212000极细粉0．20020．160±0．6140066．67微粉0．200200100鲜汁5．500400100

3 铁皮石斛多糖溶出量的测定

3.1 溶液的制备

3.1.1 对照品溶液的制备 取无水D-葡萄糖对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含90.6 μg的溶液，作为储备液。取上述储备液5 mL于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，作为对照品溶液。

3.1.2 铁皮石斛干品供试液的制备 取铁皮石斛干品粉末(过三号筛)约0.3 g，精密称定，加水200 mL，加热回流2 h，冷却，转移至250 mL量瓶中，用少量水洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水到刻度，摇匀，滤过，精密称取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀加80%(体积分数，下同)乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水到刻度，摇匀，即得。

3.1.3 铁皮石斛鲜品供试液的制备 取鲜汁约7.5 g(相当于鲜药材1.5 g)，精密称定，加水200 mL，加热回流2 h，冷却，转移至250 mL量瓶中，用少量水洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加水到刻度，摇匀，滤过，精密称取续滤液2 mL，置15 mL离心管中，精密加入无水乙醇10 mL，摇匀，冷藏1 h，取出，4 000 r/min离心20 min，弃去上清液，沉淀加80%乙醇洗涤2次，每次8 mL，离心，弃去上清液，沉淀加水溶解，转移至25 mL量瓶中，放冷，加水到刻度，摇匀，即得。

3.2 测定方法[10]

分别取“3.1”项下供试品溶液各1.0 mL，分别置于10 mL具塞试管中，精密加入5%(质量分数，下同)苯酚溶液1.0 mL，用漩涡混合器混匀，再迅速精密加入浓硫酸5.0 mL，用漩涡混合器充分混匀，置沸水中水浴加热20 min，取出，冰水浴冷却5 min。以水替代供试品，自“精密加入5%苯酚”起依法操作，制备空白溶液，在488 nm波长处测定吸光度。

3.3 专属性试验

式中：Y为细胞破壁率；A细为铁皮石斛最细粉显微特征个数；Ax为铁皮石斛粉末和鲜汁的显微特征数。

目前，学界对上述变化已有了深刻认识，并据此认为大学英语教学应与中小学英语教学重新分工，将EGP(通用英语)的教学任务全部交给中小学，而大学英语教学应该用ESP(专业英语)取代当前的EGP[2]。理由主要有以下几点：首先，中小学英语教学的容量已足以承担EGP教学任务，大学英语无须再做重复劳动，浪费教学资源；其次，大学英语教学应更加专业，以与学生的专业学习相匹配，为学生将来在职场工作或进行专业研究打好基础；最后，相对于EGP，ESP与学生的专业学习更加相关，更符合学生的知识需求，因而，更能调动学生的学习兴趣。

  

1.铁皮石斛干品供试液； 2.铁皮石斛鲜品供试液； 3.对照品溶液； 4.阴性对照液。

 

图3 铁皮石斛多糖测定专属性扫描图

 

Figure 3 Specialty scan of polysaccharide determination of D.officinale

3.4 标准曲线的绘制

D-无水葡萄糖(批号：110833-201506，质量分数99.9%，中国食品药品检定研究院)；浓硫酸、95%(φ)乙醇、苯酚、无水乙醇均为分析纯。

3.5 铁皮石斛各粉体与鲜汁溶出量的测定

取鲜汁6份，各约7.5 g(相当于鲜铁皮石斛1.5 g)，精密称定；取铁皮石斛干品粗粉、50目粉、最细粉、极细粉与微粉每种各6份，约0.3 g，精密称定；上述各加水200 mL，分别加热回流15、30、45、60、90、120 min，放冷，按“3.1”项方法，自“转移至250 mL量瓶中”起，依法制得样品；分别取上述制得的样品各1 mL，按“3.2”项自“精密加入5%苯酚溶液1.0 mL”起，依法操作，代入标准曲线，以干燥品计算得出供试品多糖的溶出量，结果见图4。可见，5种不同粉末和鲜汁的多糖的溶出量不同，随着破壁率的提高，多糖的溶出量增加，溶出的速率也在上升，呈现较强的正相关性；鲜汁的溶出程度明显高于干粉，可能是由于鲜铁皮石斛干燥后，多糖溶解溶出难度加大所致。

  

图4 铁皮石斛多糖溶出量曲线

 

Figure 4 Dissolution curve of polysaccharide from D. officinale

4 讨论

4.1 显微装片方法和显微特征指标考察

本试验在铁皮石斛破壁率的测定中，参照文献[6,8]对分散溶剂和显微特征的指标分别进行了考察，发现用60%乙醇分散，分散程度高，迅速用蒸馏水定容后，装片效果好，显微观察较为清晰。装片时，加入60%乙醇2 mL，观察铁皮石斛粉末完全分散后，需即刻加入蒸馏水定容，否则会出现细胞和其他结构缩小的情况，不利于观察。参照文献[8-9]，吸取供试品30 μL装片，盖玻片有空隙，经考察精密吸取供试品50 μL装片，装片时能够做到无气泡，且确保不溢出。

试验过程中发现，薄壁细胞较大，为完整的不规则圆形，细胞壁较薄，分布均匀，且并未完全破碎，容易观察且有代表性，故选择铁皮石斛粉末中完整的薄壁细胞为显微计数中的指标物。参照文献[6-10]，并结合本试验最细粉显微视野中还存在个别未破壁的薄壁细胞利于观察的结果，选择最细粉为参比物，以参比物得到的破壁率为0，当破壁率低于参比物时则为负值。

4.2 铁皮石斛多糖溶出量分析

本试验采用硫酸-苯酚法对提取液进行多糖溶出量的测定，试验过程中发现沿壁与悬空加入浓硫酸对多糖含量的测定有影响，沿壁加入的重现性不好，悬空加入重现性较好，可能由于悬空加入能充分聚热，有利于浓硫酸与苯酚和多糖的充分反应，使结果更准确。

从图4可知，随着破壁率的提高，多糖的提取程度也在增加，鲜汁的提取程度明显高于干粉，可能是由于鲜铁皮石斛干燥后，多糖溶解溶出难度加大所致。通过上述结果可见，有效成分分布于细胞内，通过粉碎让细胞破碎，可以更大程度、更快速地让有效成分溶出。中药材的破壁和鲜用不仅可以提高中药材的利用率，还可以节约时间和成本，为中药材更合理有效地使用提供理论依据。

本试验所采用的50目粉，为《中国药典》2015年版一部铁皮石斛项下多糖含量测定规定的过50目筛网的粉末，按该方法(提取2 h)测得多糖溶出量为35.51%，小于本文极细粉和微粉15 min时的多糖溶出量，表明多糖并未提取完全，是否能代表铁皮石斛药材中多糖的含量值得商榷。。

（4）对生态系统的威胁。以转基因大豆为例，其可能会给生物资源以及生态系统造成一定的风险，影响生物的多样性，或者引起耐除草剂杂草的蔓延等。

参考文献:

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[2] 高秀娟,王春生.鲜品铁皮石斛的应用介绍[J].北京中医药,2013，32(7):543-544.

[3] 张明丽,吕伟德,饶君凤,等.基于物联网的铁皮石斛仿野生高品质栽培关键技术[J].现代农业科技,2016(19):89-91.

[4] 周焕第,李丽.中药鲜药的药理作用和临床应用研究概况[J].中国民族民间医药,2012,21(1):43-45

[5] 冯霞,赵欣.铁皮石斛水提物对SD大鼠胃损伤的预防效果[J].江苏农业科学,2013,41(7):294-296.

[6] 李娟,麻晓雪,李顺祥,等.铁皮石斛超微粉碎破壁工艺的优化[J].中国实验方剂学杂志,2014,20(7):30-33.

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[8] 李雅,蔡光先,杨永华,等.白芍微粉细胞破壁率的测定[J].中国医药导报,2009,6(9):13.

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[11] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2015年版一部[M].北京:中国医药科技出版社,2015:282-283.