钩藤药材为茜草科(Rubiaceae)钩藤属(Ucaria)植物，具有清热平肝、息风定惊等功效[1]。钩藤中所含主要化学成分有吲哚生物碱类、三萜类、黄酮类和酚类等，其中总生物碱(TAU)为降压和镇静作用的有效成分。研究表明许多中药可以通过诱导或抑制肝药酶CYP450酶活性，从而导致药物的药效降低及不良反应的发生[2]。本课题组前期通过CO吹泡法测定了肝脏中CYP450酶总量，发现在有效剂量(40、80mg/kg)下TAU对CYP450酶总量有诱导作用[3]。目前，缺乏TAU对药物代谢酶影响的基础数据，本文应用Cocktail探针药物法研究TAU对肝药酶主要亚型的作用，为其临床使用的安全性、合理性提供参考，对该中药材合理应用将具有重要的意义。

本文提出了对于接入海上风电场的区域电网的多风电场无功优化算法,在MATLAB中验证所提出算法的有效性和正确性。

目前用于测定体内CYP450亚酶活性的方法主要为Cocktail探针药物法，该方法能同时测定多种同工酶，与其他研究方法相比具有省时、节省资源和更全面的优势[4-5]。研究表明人类CYP1A2、CYP2E1、CYP2C9和CYP3A4与大鼠CYP1A2和CYP2E1，CYP2C11和CYP3A1/2均为同型[6-7]，因此研究以上4种亚酶的抑制和诱导作用对药物的临床使用具有一定参考意义。本研究拟选择咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲作为CYP1A2、3A4、2E1和2C9特异性探针药物，使用HPLC-UV法对其4种亚酶的活性进行测定。

如，浙江省教育厅教研室编制的四年级下册《劳动与技术》，主题一“小布袋的缝制”，主题的编制虽然也是由浅入深的，先“布块缝合”，然后是“创意小布袋”，最后是“缝香袋”。在这堂课里，要学会这个活动，而这个活动是学生从来都没有接触过的，对于学生来说是有一定难度的，所以学生很容易形成畏惧心理。鉴于这种情形，以活动一“小布袋的缝制”为例，将目标设置成为几个小目标：1.穿线，把线穿过针眼就成功。2.打结，将穿过针眼的线拉成一样长，在两股线头末尾打个结就成功。3.能用平针法缝就成功。4.能用回针法缝就成功。5.能用藏针法缝就成功。学生每达到一个目标就奖励一次，不奖励缝制得好或者快，而是要奖励完成目标的学生。

1 材料与仪器

1.1 药品与试剂

咖啡因(171215-201507)、卡马西平(100142-201105)、氯唑沙宗(100364-201301)(中国食品药品检定研究院)；

咖啡因原料药，质量分数>99%(批号2010-0420，山东新华制药股份有限公司)；氯唑沙宗原料药，质量分数>99%(批号20100826，山东鲁南制药股份有限公司)；甲苯磺丁脲原料药,质量分数>99%(批号20101015，郑州华文化工有限公司)；氨苯砜原料药，质量分数> 98%(批号20100820，郑州华文化工有限公司)；乙腈、甲醇(色谱纯，Dikma公司)；超纯水(沃特浦系统蒸馏水)；甲酸(HPLC级，天津市科密欧化学试剂有限公司)；羧甲基纤维素钠(天津市致远化学试剂有限公司)；

LC-20A 高效液相色谱仪(日本岛津公司，配备二极管阵列紫外检测器)；ST16R台式高速冷冻离心机(Thermo)；沃特浦超纯水机、MP200A电子分析天平(上海良平仪器仪表有限公司)；XW -80A微型旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司)；KUDOS超声仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 仪器和设备

钩藤采自广东清远，经鉴定为茜草科钩藤属植物钩藤[Uncaria rhynchophylla(Miq) Jacks]。

本研究选取的样本只有102份，且有些国家地区的留学生样本量太少，对研究结果造成了一定偶然性。研究得出的结构方程模型拟合度还不够好，说明在维度的划分和题项的设置上还需要进一步改进和完善。

1.3 动物

对于许多函数问题的求解往往需要应用多种知识和技能.因为高中的数学函数和许多复杂的知识是联系在一起的，只有在头脑中形成深刻的印象和学习思维，才能有条不紊地解决各种相关的例题，为高中数学函数的学习做出有效的应用探究.例如，和函数定义域相同的函数是( ).

群体大小对保育阶段猪的采食、饮水、排泄等影响不大，但对活动、争斗影响明显，以40头组发生打斗行为最少，20头组次之，10头组最高。

2 方法与结果

2. 1 动物分组与给药方法

SD大鼠按体质量随机分3组，每组8只，分别为空白对照组、40 mg/kg和80 mg/kg TAU给药组，于每天清晨按20 mL/kg分别灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠( CMC-Na)，2 mg/mL和4 mg/mL的钩藤总生物碱药理液，每天1次，连续给药10 d。

2.2 钩藤总生物碱药理液的配制

取咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲适量，精密称定，用少量0.5%CMC-Na研磨混匀后用生理盐水定容，制成质量浓度分别为2.005、2.007、3.996、1.009 mg/mL的Cocktail探针药液，此药液配置后需立即使用。

雄性SD大鼠，体质量(200±20) g，SPF级，购自南方医科大学同动物中心，动物生产许可证: SCXK(粤)2016-0041。

2.3 对照品溶液、内标工作液、Cocktail探针药液的配制方法

精密移取血浆样品100 μL，加入800 μL内标工作液，涡旋混匀2 min，10 000 g离心10 min，取上清，氮气吹干加入100 μL流动相(乙腈∶0.5%甲酸=20∶80)复溶，涡旋混匀2 min，离心取上清，进样20 μL进行HPLC分析。

空白组，TAU(40、80 m/kg)给药组均连续给药10 d，于第11天上午经灌胃给予Cocktail探针药液，给药体积为10 mL/kg。给予Cocktail探针药液前和给药后0、0.08、0.25、0.5、1、1.5、2.5、4、6、9、12、24 h眼眶静脉取血约0.5 mL，加入含肝素钠的EP管中，立即以5000 g，10 min离心，取上清，-20 ℃冷冻储存，待测。

钩藤总生物碱提取物提取自上述钩藤药材，经HPLC方法检测，该提取物中主要成分为钩藤碱(0.057 g/g)、异钩藤碱(0.088 g/g)、去氢钩藤碱(0.111 g/g)和异去氢钩藤碱(0.072 g/g)4种钩藤氧化类吲哚生物碱，且该4种物质的含量占钩藤总生物碱含量50%以上。使用时结合酸性染料比色法[8]定量钩藤总生物碱含量，计算得该提取物中钩藤总生物碱纯度为61%，使用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶解，将其配制成含钩藤总生物碱2 mg/mL和4 mg/mL的溶液，分别作为40 mg/kg和80 mg/kg剂量组的药理液。

2.4 血浆样品的采集

信小呆抽中“中国锦鲤”后也问过：“我下半生是不是不用工作啦？”朋友们，大力转发中国农资锦鲤，谁也不想工作，想得美，寻找中国农资锦鲤，还没有开始，就已经结束了！有人刚刚从这家公司辞职，因为每次开发票写公司名称时都被人骂，要不我们也去试试——宝鸡有一群怀揣着梦想的少年相信在牛大叔的带领下会创造生命的奇迹网络科技有限公司，已确认这是一家真实存在的公司，会不会马上要火？起码这39个字的公司名称似乎已经火了！应聘成功前，还是应朋友们之邀老老实实、勤勤恳恳地走走尿素市场吧。

2.5 血浆样品的处理方法

取咖啡因、氨苯砜、卡马西平、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲各约10 mg，精密称定，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为1.005、0.996、0.998 1、1.003、1.007 mg/mL的对照品储备液，避光保存。精密移取卡马西平对照品储备液1.0 mL，置于500 mL容量瓶中，用甲醇定容成含1.996 μg/mL卡马西平内标作为内标工作液。

2.6 液相方法

色谱柱CNW C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)和预柱C18保护柱(4.6 mm ×10 mm，5 μm) ；流动相：A相为0.5%甲酸，B相为乙腈，线性梯度洗脱( 0～4 min：20% B；4～18 min：20%～46% B；18～30 min：46% B)，流速1.0 mL/min，检测波长：270 nm，柱温35 ℃，进样体积20 μL。

2.7 液相方法学研究

2.7.1 系统适用性 取各血浆样品100 μL，按照“2.5”项下方法制备，利用“2.6”项下方法进行HPLC分析，考察各色谱峰分离与干扰情况。由图 l可见咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲各色谱峰峰形良好，分离完全，且无杂质峰干扰。

  

S1.空白血浆; S2.空白血浆+内标; S3.空白血浆+高浓度混标; S4:TAU(80 mg/kg)给药后1.5 h时血浆样品(1.咖啡因；2.氨苯砜；3.氯唑沙宗；4.卡马西平；5.甲苯磺丁脲)。

 

图1 大鼠血浆中咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的液相色谱图

 

Figure 1 HPLC chromatograms of caffeine,dapsone,chlorzoxazone and tolbutamide

2.7.2 标准曲线的制备及最低定量限 取“2.3”项下咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲对照品储备液，用甲醇稀释成不同质量浓度的对照品混合溶液，使咖啡因质量浓度依次为50.25、25.12、12.56、6.281、3.141、1.570、0.785 2、0.392 6、0.196 3、0.098 11 mg/L；氨苯砜质量浓度依次为49.80、24.90、12.45、6.225、3.112、1.556、0.778 1、0.389 0、0.194 5、0.097 26 mg/L氯唑沙宗质量浓度依次为50.15、25.075、12.54、6.269、3.134、1.567、0.783 6、0.391 8、0.195 8、0.097 95 mg/L；甲苯磺丁脲质量浓度依次为50.35、25.18、12.59、6.293、3.147、1.573、0.786 7 mg/L。取上述不同质量浓度的对照品混合溶液100 μL，氮气吹干后加入空白血浆100 μL，按“2.5”项下方法操作、“2.6”项下方法进行测定，记录峰面积，以药物质量浓度(mg/L)为横坐标，各样品的峰面积与内标峰面积之比作为纵坐标，进行标准曲线的制备，结果见表1。

2.7.3 精密度实验 取“2.3”项下各对照品储备液，用甲醇稀释制备成含咖啡因、氨苯砜、氯唑沙宗和甲苯磺丁脲的低、中、高浓度的对照品混合溶液，使咖啡因质量浓度为0.804 0、4.020、20.10 mg/L；氨苯砜质量浓度为0.199 2、0.996 0、4.980 mg/L；氯唑沙宗质量浓度为0.802 4、4.012、20.06 mg/L；甲苯磺丁脲质量浓度为1.611、8.056、40.28 mg/L。取上述低、中、高浓度对照品混合溶液各100 μL，氮气吹干后加入空白血浆100 μL，按“2.5”项下处理样品，按“2.6”项条件测定，分别于同日内测定3次，以及每日1次，连续测定3 d，计算日内和日间RSD。结果见表2，血浆样品中的日内精密度RSD在2.33%～9.74%，日间精密度RSD在2.96%～9.46%。

2.7.4 稳定性实验 取“2.7.3”项下制备的低、中、高浓度对照品混合溶液各100 μL，氮气吹干后加入空白血浆100 μL，按“2.5”项方法进行血浆样品处理后置-20 ℃的冰箱保存。按“2.6”项条件进行HPLC分析，考察样品在室温下放置24 h，在-20 ℃保存1周以及反复冻融(n=3)的稳定性，并计算其准确度(以测定值浓度与加入值之比计算准确度)。结果显示各条件下样品浓度准确度均在(85±110)%以内，RSD均小于15%，说明该样品符合生物样品定量要求。

2.7.5 回收率实验 取“2.7.3”项下制备的低、中、高浓度对照品混合溶液各100 μL，氮气吹干后加入空白血浆100 μL，按“2.5”项方法进行血浆样品处理，按“2.6”项条件进行 HPLC 分析，每个浓度平行制备5份，计算回收率，结果见表3，4种探针药物的回收率在90.08%～108.66%范围内，符合生物样本的分析要求。

 

表1 血浆样品中各探针药物的线性方程及线性范围Table 1 Linear equations and linear ranges of the probe drugs in plasma

  

标准品线性方程R2线性范围/(mg·L-1)LLOQ/(mg·L-1)咖啡因y=0．0715x+0．01430．999850．25-0．098140．09814氨苯砜y=0．1332x+0．02550．999849．80-0．097260．09726氯唑沙宗y=0．0259x+0．00390．999950．15-0．097940．09794甲苯磺丁脲y=0．0026x+0．00070．999150．35-0．78670．7867

 

表2 血浆样品中各探针药物的精密度实验结果Table 2 Results of the precision test of probe drugs in plasma (n=6)

  

标准品加入浓度/(mg·L-1)日内测定值/(mg·L-1)RSD/%准确度/%日间测定值(mg·L-1))RSD/%准确度/%咖啡因20．1021．04±0．48992．33104．6921．01±0．66833．18104．534．0203．709±0．13093．5392．263．855±0．17104．4495．900．80400．7307±0．045706．2590．890．7209±0．069169．5989．66氨苯砜4．9804．726±0．15013．1894．904．750±0．15573．2895．380．99600．9869±0．012561．2799．190．9579±0．034503．6096．270．19920．1814±0．019936．5891．060．1773±0．011596．5389．03氯唑沙宗20．0621．22±0．64023．02105．8120．82±0．81483．91103．784．0124．072±0．082672．03101．514．098±0．12122．96102．160．80240．8306±0．040904．92103．510．8430±0．074518．84105．07甲苯磺丁脲40．2839．62±1．1862．9998．3540．76±1．6724．10101．188．0567．833±0．20422．6197．247．774±0．26243．3896．501．6111．448±0．14109．7489．891．417±0．13409．4687．93

 

表3 血浆样品中各探针药物的回收率实验结果

 

Table 3 Results of the recovery test of probe drugs in plasma (n=6)

  

标准品加入浓度/(mg·L-1)测定值/(mg·L-1)RSD/%回收率/%咖啡因20．1021．22±0．66733．14105．574．0203．848±0．16294．2395．730．80400．7303±0．027273．7390．84氨苯砜4．9804．725±0．16863．5794．890．99600．9495±0．041234．3495．330．19920．1820±0．014708．0791．39氯唑沙宗20．0621．18±0．24831．17105．604．0124．0460±0．10652．63100．850．80240．8718±0．064157．36108．66甲苯磺丁脲40．2843．03±1．6753．89106．828．0567．628±0．29803．9194．691．6111．451±0．080555．5590．08

2.8 药动学实验

取“2.4”项下采集到的大鼠血浆样品100 μL，按照“2.5”项下方法处理，在“2.6”项色谱条件下进样分析，得到各探针底物的平均血药浓度-时间曲线。采用 DAS2.0软件，以非房室模型计算主要药代动力学参数，包括血药浓度-时间曲线下面积(AUC)、消除半衰期(t1/2)、清除率(CL)及平均滞留时间(MRT)等，采用SPSS19.0统计学软件进行分析，各组间检验方差齐性后采用单因素方差分析，P<0.05为差异具统计学意义。结果见表4～表7。

结果表明，与空白组比较，TAU80 mg/kg给药组的咖啡因AUC(0-t)，AUC(0-∞)，MRT(0-t)，MRT(0-∞)，t1/2z均有所下降，CLz/F增加，差异具统计学意义(P<0.01)；氨苯砜的药动学参数基本无变化；氯唑沙宗的AUC(0-t)，AUC(0-∞)，t1/2z均有下降，CLz/F增加，但差异无统计学意义；甲苯磺丁脲的AUC(0-t)和AUC(0-∞)均有下降，CLz/F增加，差异有统计学意义(P<0.05)。TAU(40 mg/kg)给药组与空白组比较，咖啡因，氨苯砜，氯唑沙宗，甲苯磺丁脲的药动学参数均基本无变化。说明TAU(80 mg/kg)给药组对CYP1A2，CYP2C9的活性有显著的诱导作用，对CYP2E1有微弱的诱导作用，而TAU(40 mg/kg)给药组对以上4种亚酶均基本无影响。

 

表4 咖啡因的药动学参数Table 4 Pharmacokinetic parameters of caffeine

  

参数空白组TAU(80mg/kg)TAU(40mg/kg)AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1)108．06±11．3865．75±14．05∗∗111．56±42．77AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1)109．59±11．9067．92±13．82∗∗113．32±43．69MRT(0-t)/h5．87±0．403．62±0．10∗∗5．43±1．43MRT(0-∞)/h6．45±0．724．11±0．28∗∗5．54±1．50t1/2z/h3．69±0．582．29±0．41∗∗3．25±0．82CLz/F/(L·h-1·kg-1)0．19±0．020．31±0．07∗∗0．20±0．08

与空白组比较：**P<0.01。

 

表5 氨苯砜的药动学参数Table 5 Pharmacokinetic parameters of dapsone

  

参数空白组TAU(80mg/kg)TAU(40mg/kg)AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1)19．59±4．6215．72±4．4017．58±5．75AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1)23．47±6．1317．03±4．2819．76±6．09MRT(0-t)/h6．50±1．807．09±1．077．75±0．40MRT(0-∞)/h10．40±3．8110．55±3．7411．71±1．48t1/2z/h7．62±2．987．00±1．187．33±2．41CLz/F/(L·h-1·kg-1)0．96±0．211．19±0．261．11±0．41

 

表6 氯唑沙宗的药动学参数

 

Table 6 Pharmacokinetic parameters of

  

参数空白组TAU(80mg/kg)TAU(40mg/kg)AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1)90．05±28．3661．41±15．3195．05±36．72AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1)91．86±29．6462．79±16．1495．41±36．47MRT(0-t)/h5．23±1．572．73±0．623．71±0．73VRT(0-∞)/h7．63±3．553．03±0．773．97±0．67t1/2z/h1．92±0．292．09±0．252．06±0．44CLz/F/(L·h-1·kg-1)0．48±0．150．67±0．170．47±0．16

 

表7 甲苯磺丁脲的药动学参数

 

Table 7 Pharmacokinetic parameters of

  

参数空白组TAU(80mg/kg)TAU(40mg/kg)AUC(0-t)/(mg·L-1·h-1)294．80±46．16161．30±54．56∗∗309．31±54．27AUC(0-∞)/(mg·L-1·h-1)356．99±57．76200．10±87．48∗∗363．08±60．15MRT(0-t)/h8．80±0．638．91±0．489．06±0．56MRT(0-∞)/h13．74±1．9215．38±1．5613．97±2．04t1/2z/h9．30±1．409．28±2．248．47±0．70CLz/F/(L·h-1·kg-1)0．029±0．0050．057±0．018∗∗0．028±0．005

与空白组比较：**P<0.01。

3 讨论

本研究建立了Cocktail探针药物法用于同时评价药物对肝药酶CYP1A2、2C9、2E1和3A4酶活性的影响。建立的HPLC方法在270 nm同时检测咖啡因、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗和氨苯砜这4种探针底物，结果表明该方法灵敏度高，具有良好的精密度和准确度，符合生物样本定量的要求。本研究利用常规的高效液相的方法即可达到定量的要求，操作简单、成本较低。

在采用Cocktail法研究药物对CYP450酶活性的影响时，底物探针的选择非常重要。美国FDA发布的药物相互作用研究指南中对CYP450不同亚型的探针药物作了推荐，CYP1A2的探针药物为咖啡因、茶碱； CYP2C9的探针药物为甲苯磺丁脲、双氯酚酸；CYP3A4的探针药物为咪达唑仑、氨苯砜等；CYP2E1的为氯唑沙宗[9]；另外，要求底物探针间在体内不能相互干扰且探针与待测酶的反应有专属性与高灵敏度[10]，综合上述因素考虑，本研究选择了咖啡因，氨苯砜，氯唑沙宗和甲苯磺丁脲分别作为CYP1A2、3A4、2E1和2C9的探针底物，以研究各亚酶的活性。

本文研究了两种有效剂量TAU作用下，对大鼠体内4种肝药酶亚型的影响，结果发现40 mg/kg的TAU对4种亚酶基本无影响，80 mg/kg的TAU对CYP1A2和2C9亚酶具有强烈的诱导作用、对CYP2E1有微弱的诱导作用,说明长期高剂量使用TAU可能对肝药酶活性产生较大影响，而低剂量使用则对肝药酶活性影响不大。结果提示在临床使用钩藤的过程中要注意剂量的控制，尤其是与其他药物联用时，需要注意钩藤对肝药酶的诱导作用。

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