蒺藜是蒺藜科蒺藜属一年生草本植物蒺藜的干燥成熟果实，又称白蒺藜、刺蒺藜，为我国传统中药之一[1]。味辛、苦，性微温，具有平肝解郁、活血祛风、明目止痒之功效[2]。蒺藜皂苷是从蒺藜草中提取的有效成分之一，以甾体皂苷为主的10多种皂苷的混合物，主要包括呋甾醇与螺甾醇2种皂苷，形状为黄色粉末，易溶于水[3]。现代药理表明蒺藜皂苷具有抗肿瘤、抗心脑血管疾病、降血糖、抗衰老等方面的作用[4]，但针对于抗炎方面的研究鲜有报道。炎症通常是过敏源在结构识别受体作用下激活炎症信号通路，使其损伤部位以及周围组织出现炎症介质和因子聚集，复杂的生化反应过程就被激活，同时也是机体在抗感染和损伤过程的复杂的级联反应[5]。因此，为更一步了解蒺藜皂苷的抗炎作用及其作用机制，本实验通过LPS诱导产生小鼠急性炎症模型，研究该药对炎症因子IL-17、TNF-α及NF-κB信号通路的影响，为蒺藜皂苷的下一步研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级健康昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，由广东医学实验动物中心提供，动物许可证号为SCXK(粤)2013-0002，在SPF级动物室饲养。

1.2 主要试剂

脂多糖(上海翊圣生物科技有限公司，批号：L37140)；地塞米松磷酸钠注射液(湖北天药药业股份有限公司，批号：51611071)；OCT包埋剂(美国Sakura公司)；TNF-α ELISA 试剂盒(Proteintech公司)；IL-17F和IL-23 ELISA试剂盒(CUSABIO公司)；无水乙醇、二甲苯(国药集团化学试剂有限公司)；EDTA(pH8.0)抗原修复液、 4%多聚甲醛、BSA、苏木素染液、苏木素分化液、组化试剂盒DAB显色剂、HRP标记山羊抗兔IgG、苏木素返蓝液和中性树胶均(武汉塞维尔生物科技有限公司)；兔多克隆抗体(IL-17、TNF-α、NF-κB，沈阳万类生物科技有限公司)；蒺藜皂苷(广州合诚化学有限公司)。

1.3 实验仪器

脱水机(武汉俊杰电子有限公司，JJ-12J)；包埋机(武汉俊杰电子有限公司，JB-P5)；病理切片机(上海徕卡仪器有限公司，RM2016)；冻台(武汉俊杰电子有限公司，JB-L5)；组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司，KD-P)；烤箱(上海慧泰仪器制造有限公司,DHG-9140A)；倒置荧光显微镜(德国莱卡公司，BDS200-FL)。

1.4 实验方法

将小鼠按体质量随机分为4组，每组6只，雌雄各半并分笼饲养，分为正常组、模型组、阳性对照组、蒺藜皂苷给药组。正常组和模型组每日灌服生理盐水，阳性对照组腹腔注射地塞米松注射液，剂量为10 mg/kg，蒺藜皂苷给药组，灌胃给药，剂量为50 mg/kg。各动物组按照剂量连续给药7 d，每天2次。

由表1可知，空白对照组的IL-17F、IL-23和TNF-α细胞因子水平均低于模型组，差异具统计学意义(P<0.01)。地塞米松阳性组和蒺藜组血清中IL-17F和TNF-α均低于模型组(P<0.05)。

1.5 检测指标与方法

1.5.1 ELISA法检测血清中细胞因子IL-17F 、TNF-α和IL-23的表达量 所有动物血清采用ELISA试剂盒测定血清中各细胞因子含量，操作步骤严格按照说明书进行，使用多功能酶标仪检测。根据标准曲线换算出各组IL-17F 、TNF-α和IL-23的含量。

1.5.2 免疫组化 将制备好的石蜡切片进行抗原修复和阻断内源性过氧化物酶，血清封闭后加一抗孵育过夜，二抗孵育后进行苏木素和DAB染色，脱水封片后，显微镜镜检并进行图像分析。

1.6 统计分析

LPS又称为细菌内毒素，是革兰阴性细菌细胞壁中的一种成分，能引起急性肺损伤和其他炎症疾病的主要原因之一[6-7]。LPS进入体内后会被巨噬细胞和中性粒细胞等炎症相关细胞的Toll样受体识别，然后经TLR-MyD88途径激活NF-κB从而产生一系列的炎症因子如IL-1、ICAM-1和肿瘤坏死因子TNF-α等[8-10]。由LPS诱导的小鼠炎症模型主要特点是造模时间短，能短时间在小鼠体内产生大量的炎症因子，可以快速建立小鼠炎症模型。

2 结果

2.1 蒺藜皂苷对LPS诱导的炎症模型小鼠血清中细胞因子水平的影响

所有动物组第7天末次给药后禁食不禁水。除正常组外，其余各组第8天一次性腹腔注射LPS(15 mg/kg)0.2 mL，建立小鼠炎症模型。3 h后进行眼眶取血，室温静置30 min，3 500 r/min 离心10 min取上清分装后存于-80 ℃冰箱待用。并将小鼠解剖取脾脏、胸腺保存于4%(φ)多聚甲醛溶液待用。

试点地区高度重视水资源监控能力建设，完善监控体系，为最严格水资源管理各项工作提供基础保障。上海市依托水务一体化管理优势，在已建成的城市水资源实时监控与管理系统基础上，整合共享其他部门数据，建成了集气象、海洋、水利、供水、排水等信息于一体的省级水资源管理信息系统，并完成与中央平台的互联互通。天津市率先建立地下水与水环境监测系统，为实时了解地下水采补数据、提高地下水管理水平奠定良好基础。泉州市创建红黄蓝动态分区管理模式，设立全市水资源监控调度中心，自主研发建设水资源动态管理系统，基本实现水资源总量、效率、纳污等重要控制指标可监测、可评价、可考核，有效解决了区域性缺水、水污染和用水效率不高等问题。

2.2 蒺藜皂苷对LPS诱导的炎症模型小鼠免疫相关脏器系数的影响

在传统思维中，我们似乎更重视青铜方鼎、方尊等代表“国之重器”礼器，而精美、实用的青铜生活用具则不太被宣传，其实这些生活用器承载的工匠工艺和日常生活细节，更能反映一个时代的文化气质。

 

表1 蒺藜皂苷对炎症小鼠模型血清中细胞因子水平的影响Table 1 Effect of GSTT on the levels of serum cytokines in inflammatory mouse model

  

组别剂量/(mg·kg-1)ρ(IL⁃17F)/(pg·mL-1)ρ(IL⁃23)/(ng·mL-1)ρ(TNF⁃α)/(pg·mL-1)空白对照组/61．43±5．53∗∗1．08±0．41∗∗88．08±19．77∗∗模型组/120．13±34．702．83±1．17724．25±202．33地塞米松阳性组1080．3±21．10∗∗3．57±0．31411．54±119．58∗∗蒺藜皂苷组5074．07±15．94∗∗2．30±1．34289．87±191．12∗∗

与模型组比较:**P<0.01。

 

表2 蒺藜皂苷对炎症小鼠模型脾脏和胸腺系数的影响

 

Table 2 Effect of GSTT on spleen and thymus coefficients in inflammatory mouse model

  

组别脾脏系数胸腺系数空白对照组0．1043±0．00950．0633±0．0209模型组0．1070±0．03410．0891±0．0286地塞米松阳性组0．0342±0．0125∗∗0．0155±0．0062∗∗蒺藜皂苷组0．1129±0．04830．0719±0．0526

与模型组比较，**P<0.01。

2.3 蒺藜皂苷对LPS诱导的炎症模型小鼠胸腺IL-17、TNF-α和NF-κB的表达水平的影响

Preparation and skin care efficacy of rose essential oil and rose water 11 30

与模型组对比，地塞米松阳性组脾脏系数和胸腺系数明显较低(P<0.01)，蒺藜皂苷给药组脾脏系数和胸腺系数与模型组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。

将免疫组化结果于200倍显微镜拍照成像见图1～图2，可以观察到空白组、地塞米松阳性组和蒺藜皂苷给药组的IL-17、TNF-α和NF-κB对比模型组黄色明显变浅，说明蒺藜皂苷可降低由LPS诱导的炎症小鼠模型体内IL-17、TNF-α和NF-κB通路的蛋白表达量。经Image-Pro Plus .6.0软件半定量分析得到平均光密度值，见图4。IL-17、TNF-α和NF-κB这3个的平均光密度均高于其他组别，差异有统计学意义(P<0.05)。

  

A．空白对照组；B.模型组；C.地塞米松阳性组；D.蒺藜皂苷组。

 

图1 各组小鼠胸腺的免疫组化结果图(IL-17,IHC,200×)

 

Figure 1 Expression of thymus IL-17 by immunohistochemistry in four groups (IHC,200×)

  

A.空白对照组； B.模型组； C.地塞米松阳性组； D.蒺藜皂苷组。

 

图2 各组小鼠胸腺的免疫组化结果图(TNF-α,IHC,200×)

 

Figure 2 Expression of thymus TNF-α by immunohis- tochemistry in four groups (IHC,200×)

  

A．空白对照组； B.模型组； C.地塞米松阳性组； D.蒺藜皂苷组。

 

图3 各组小鼠胸腺的免疫组化结果图(NF-κB,IHC,200×)

 

Figure 3 Expression of thymus NF-κB by immunohisto- chemistry in four groups (IHC,200×)

  

与模型组比较:**P<0.01。

 

图4 各组炎症小鼠免疫组化的平均光密度

 

Figure 4 Average optical density of immunohistochemistry of inflammatory mediators in four groups

3 讨论

使用SPSS 19.0进行单因素方差分析，数据以表示，以P<0.05为差异有统计学意义。

IL-17分泌于Th17的CD4+T细胞，IL-17F是其亚型之一，自1993年被发现以来，IL-17一直被认为是一种极为重要的炎症因子，能诱导前炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α等的表达，并能与IL-1β、IFN-γ和TNF-α等细胞因子发挥协同效应，促进T淋巴细胞的活化使B细胞产生抗体，放大靶器官的免疫反应和炎症性破坏从而参与多种感染和自身免疫疾病的发生[11]。IL-17现今已被证实与多种自身免疫性疾病如类风湿关节炎、系统性红斑狼疮及银屑病等密切相关[12]。同时，有研究表明，IL-17能通过MAP激酶和NF-κB途径释放促炎症因子进而加强炎症反应[13]。从检测血清中的细胞因子水平可以看出，蒺藜皂苷能明显下调IL-17F与TNF-α在血清中的表达水平，且在免疫组化结果可以得出，蒺藜皂苷给药组小鼠胸腺IL-17、TNF-α、NF-κB蛋白质的表达量对比模型组均有不同程度的下降，具有统计学意义，证实蒺藜皂苷可能抑制细胞中IL-17的分泌水平和阻碍NF-κB信号通路的激活进而下调肿瘤坏死因子TNF-α等炎症因子的表达以减轻小鼠体内的炎症程度。

蒺藜皂苷是由中药蒺藜草提取的有效成分，具有毒性低、易获取、疗效好等优点。本实验结果表明，蒺藜皂苷能显著降低炎症小鼠体内IL-17、TNF-α、NF-κB蛋白质的表达量，为与其炎症通路相关的炎症性肠病和自身免疫疾病如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮和银屑病的临床治疗提供了一种新思路。

在运维现场作业过程中，能否落实安全监护制度是一项非常关键的环节，也是现场作业最坚实的安全保障。在实行安全监护时，一定要保证份工作职责的明确，形成安全监护和安全检查的闭环。

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