生物膜是由细菌及其分泌的胞外基质组成的微生物群落，能增强细菌对抗菌药物的耐受能力。细菌生物膜对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，其形成与细菌群体感应系统[1]、鞭毛[2]、外膜蛋白[3]及其相关基因等密切相关。广藿香(Pogostemon cablin (Blanco) Benth.)是著名“南药”，具有芳香化湿、去瘴气、止霍乱的功效。研究表明，其具有抗菌[4]和抑制白念珠菌生物膜形成[5]的活性。本实验室前期研究发现，广藿香对哈维氏弧菌生物膜形成有显著抑制作用。本文拟研究广藿香对耐药哈维氏弧菌[6]生物膜形成及成膜相关基因的影响，为广藿香用于细菌生物膜防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌株

哈维氏弧菌(Vibrio Harveyi)是一种革兰阴性短杆菌，为甲壳类、贝类和鱼类等多种海洋生物易感致病菌，可引发水生生物急性败血症和溃疡等[7]。哈维氏弧菌X140701来源于海水养殖水体，由中国水产科学研究院南海水产研究所分离、鉴定、命名并保藏。

第1步：根据模糊互补判断矩阵，对同一属性ck(k=1,2,…,m)下各个方案两两进行比较，建立方案之间可能度矩阵：

1.2 药物和试剂

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(广东环凯微生物科技有限公司，批号1063811)，调节NaCl含量为3%，pH 7.5；技术琼脂粉(广东环凯微生物科技有限公司，批号3206047)；结晶紫( Sigma-Aldrich公司，批号C3886)；细菌RNA抽提试剂盒(Magen公司，批号20170607)；Prime ScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，批号AK6003)；SYBR®Premix Ex TaqTM II(Tli RNase H Plus)试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司，批号AKA806)。

广藿香(佛山星联中药饮片有限公司，批号160801)，经广东药科大学中药学院刘基柱教授鉴定为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.的干燥地上部分。供试药液制备：广藿香粗粉10.0 g加水100 mL回流提取1 h，过滤，滤液减压浓缩成质量浓度为1.0 g/mL提取液备用。

1.3 仪器

与对照组比较，在广藿香作用下哈维氏弧菌鞭毛调控基因fla B表达量极显著上调(P<0.01)，群体感应系统基因lux R表达量显著上调(P<0.05)，lux S基因和外膜蛋白基因omp W表达量极显著下调(P<0.01)，hfq基因表达量显著下调(P<0.05)，lux M、 flr A、rpo N、rpo S、omp K和omp U基因表达量没有显著变化(图4)。

有研究表明广藿香对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA)、枯草杆菌、铜绿假单胞菌、肠炎球菌、产气杆菌均有抑制作用[4]，其对MSSA抑制机制与细胞壁透性、膜蛋白构象和离子渗漏等因素有关[16]。广藿香可显著抑制白色念珠菌成熟生物被膜的生长[17]，但其作用机制未见报道。本研究前期发现，广藿香有抑制哈维氏弧菌生物膜形成作用，其浓度在0.391 mg/mL以上时对耐药哈维氏弧菌X140701生物膜的形成有显著抑制作用。本文进一步从细菌群体感应系统、鞭毛、外膜蛋白相关基因入手，研究了广藿香抑制细菌生物膜形成的作用途径。

1.4 方法

1.4.1 起始菌量的确定 取哈维氏弧菌X140701按菌液浓度106、105、104、103、102、101 CFU/mL接种于无菌96孔板，于28 ℃静置培养，分别于1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h测定吸光度值A600，阴性对照为空白培养基。

1.4.2 广藿香最低抑菌浓度(MIC)的测定 广藿香水提物MIC采用二倍稀释法[8]测定，各组给药终浓度依次为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91 mg/mL，共8个浓度，于28 ℃静置培养24 h，以无细菌生长的最低浓度为MIC。

1.4.3 广藿香抑制哈维氏弧菌生物膜形成的活性及最佳浓度选择 将经培养基稀释的广藿香水提物与2×104CFU/mL的等体积菌液混合，为了降低药物对菌株生长的影响，设置广藿香给药终浓度为低于MIC的3个浓度，分别为1.563、0.782和0.391 mg/mL，以未给药的菌液为对照。取200 μL接种于无菌96孔板中，28 ℃静置培养，在第4、5、6小时测定吸光度值A600。采用结晶紫染色法[9]检测生物膜的形成量，以吸光度值A570判断生物膜形成量。

在10 h内不同起始菌量对哈维氏弧菌生长状况的影响结果见图1。当起始菌量为104CFU/mL时，3～7 h为最佳检测时间。因此选择104 CFU/ml起始菌量，培养4 h、5 h、6 h时检测药物作用下哈维氏弧菌的生长情况。

(1-A处理组/A对照组) ×100%

1.4.4 目标基因选择 哈维氏弧菌生物膜形成相关的基因包括群体感应系统基因(lux R、hfq、lux M、lux S)[10]、鞭毛基因(flr A、fla B、rpo N、rpo S)[11]和外膜蛋白基因(omp W、omp K、omp U)[12]。

1.4.5 细菌总RNA的提取及反转录 将广藿香水提物以培养基稀释后与相同体积2×104 CFU/mL的菌液混匀，广藿香给药终浓度为0.782 mg/mL，以未给药的菌液为对照。取200 μL接种于无菌96孔板中(n=10)，28 ℃静置培养。在第6小时收集全部菌体，参照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA。紫外分光光度法检测RNA纯度及浓度，A260/A280值应大于1.8。参照反转录试剂盒说明书，每个样品取等量的总RNA反转录成cDNA，-20 ℃保藏。

1.4.6 qRT-PCR qRT-PCR的引物分别参考Luo G [13]、Mao[14]和钟琳红[15]等，由华大基因公司合成。根据SYBR®Premix Ex TaqTM II荧光染料说明书配制成10 μL的PCR反应体系，扩增反应在Light Cycler®480荧光定量系统，每个样品设3个重复，每个重复样品做3个平行，熔解曲线用来保证扩增产物的特异性。以16S基因作为内参基因，2-ΔΔCt法用于比较不同样本间基因表达量变化。

1.4.7 数据处理 数据采用Microsoft Excel 2010软件及SPSS 18.0软件分析处理，组间差异比较采用单因素方差分析和t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 起始菌量的确定

按公式计算生物膜抑制率： 生物膜抑制率=

信息化是当代企业发展的重要方向，财务内控管理作为企业管理中的重要组成部分，其发展也必须跟上企业信息化建设的步伐。而在企业发展的过程中，虽然财务部门也初步完成了信息化的转变，一些基础的信息收集、数据处理、财务报表的制作等工作已经通过财务管理信息系统来完成。但是在财务管理中信息技术手段的应用还是比较初级的，一些深入的财务数据分析工作由于难度大，很少有员工能够熟练地掌握并应用。因此，财务内控管理的信息化建设无法进一步深入，信息化的建设和应用水平较低，不利于信息技术在财务内控管理当中的应用和发展。

  

图1 不同培养菌量哈维氏弧菌的生长曲线

 

Figure 1 Growth curve of Vibrio harveyi at different inoculation amounts

2.2 MIC的测定和不同浓度广藿香对哈维氏弧菌生长及生物膜的影响

通过二倍稀释法测定广藿香对耐药哈维氏弧菌X140701的MIC为31.25 mg/mL。在低于MIC的多个不同浓度广藿香作用下，哈维氏弧菌培养4 h、5 h、6 h时生物膜形成量均有一定程度降低。1.563 mg/mL广藿香作用4 h和5 h的抑制率分别为41.9%(P<0.01)和35.1%(P<0.01)，0.782 mg/mL广藿香作用6 h的抑制率为37.6%(P<0.01)(图2)。3个不同浓度的广藿香对哈维氏弧菌生长均有抑制作用(图3)。为减少抑菌作用对抑制生物膜作用的干扰，以抑制生物膜作用较强同时抑菌作用较弱的浓度0.782 mg/mL检测广藿香作用第6 h时生物膜相关基因表达量。

2.3 广藿香对生物膜形成相关基因表达的影响

752-P紫外可见分光光度计(上海现科仪器有限公司)；SUNRISE酶标仪[瑞士帝肯(TECAN)集团公司]；C1000TM Thermal Cycler PCR仪(赛默飞世尔科技公司)；Light Cycler®480荧光定量系统[罗氏诊断产品(上海)有限公司]。

  

与对照组比较：**P<0.01。

 

图2 不同浓度广藿香对哈维氏弧菌生物膜的影响

 

Figure 2 Effect of different concentrations of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. on the biofilm formation of Vibrio harveyi

  

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

 

图3 不同浓度广藿香对哈维氏弧菌生长的影响

 

Figure 3 Effect of different concentrations of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. on the growth of Vibrio harveyi

  

与对照组比较：*P<0.05，**P<0.01。

 

图4 广藿香对哈维氏弧菌生物膜相关基因表达的影响

 

Figure 4 Effect of Pogostemon cablin (Blanco) Benth. on biofilm-related gene expression of Vibrio harveyi

3 讨论

前列腺液中锌离子、PSA及MIP-1α水平与慢性非细菌性前列腺炎患者症状的相关性………………………………………………………………………… 罗 琳，等(7):802

Yildiz等[18]发现弧菌形成生物膜的能力取决于特定结构基因和调控过程。荧光定量PCR实验表明广藿香能影响耐药哈维氏弧菌X140701的生物膜相关基因lux S、hfq、lux R、fla B和omp W的表达。lux S、lux R和hfq基因属于细菌群体感应系统[10]，参与生长自我调控，fla B属于细菌特定结构鞭毛形成相关基因，omp W是细菌外膜蛋白形成相关基因。分析哈维氏弧菌的群体感应功能通路可知，lux S能激活AI-2信号分子进而影响感应蛋白，hfq能结合群体调节RNA Qrr；lux S基因和hfq基因缺失会抑制生物膜的形成，研究发现大菱鲆弧菌的lux S基因突变株[19]和李斯特菌的hfq基因突变株[20]使其生物膜形成减少；lux R同源物负调控生物膜形成，Yildiz等[21]发现霍乱弧菌的lux R同源物负调控细菌胞外多糖基因。本研究发现广藿香水提物下调X140701的lux S和hfq基因表达，上调lux R基因表达，推测其抑制生物膜作用与干预多糖基因表达等功能有关。fla B为鞭毛丝亚基蛋白基因，与弧菌鞭毛调控有关[11]。根据KEGG霍乱弧菌的生物膜形成通路分析可知，fla B等鞭毛调节基因能影响鞭毛装配。Kalmokoff 等[22]发现fla B蛋白在空肠弯曲杆菌的蛋白质组学分析中，浮游细胞中的表达高于生物膜细胞。广藿香上调fla B基因的表达，推测其减少生物膜形成与细菌从生物膜菌转变为浮游菌有关。外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)是重要的黏附因子[12]，omp W、omp K和omp U为弧菌主要的外膜蛋白，研究表明omp W能影响细菌耐药性[23]。Ritter等[24]发现不产omp W的铜绿假单胞菌突变体具有较低生物量和改变结构的生物膜。广藿香下调omp W基因，推测其抑制生物膜活性与生物膜结构改变有关。

综上所述，广藿香能显著抑制哈维氏弧菌生物膜形成，其作用机制与影响群体感应系统基因lux S、hfq、lux R、鞭毛调控基因fla B、外膜蛋白基因omp W基因的表达有关。

典型例题在《概率统计》教学中的创新应 用 ………………………………………………… 葛 旸，李 纯（52）

参考文献:

[1] SOLANO C，ECHEVERZ M，LASA I. Biofilm dispersion and quorum sensing[J]. Curr Opin Microbiol，2014，18(4):96-104.

[2] BELAS R. Biofilms，flagella，and mechanosensing of surfaces by bacteria[J]. Trends Microbiol，2014，22(9):517-527.

[3] WANG S Y，LAURITZ J，JASS J，et al. Role for the major outer-membrane protein from Vibrio anguillarum in bile resistance and biofilm formation[J]. Microbiology，2003，149(4):1061-1071.

[4] 罗超坤. 广藿香水提物的抗菌实验研究[J]. 中药材，2005，28(8):700-701.

[5] 汪长中，程惠娟，徐胜利,等. 中药水提物对白念珠菌生物膜抑制作用的研究[J].中国微生态学杂志，2009，21(11):965-969.

[6] 蒋魁，徐力文，苏友禄,等. 2012年～2014年南海海水养殖鱼类病原菌哈维弧菌分离株的耐药性分析[J].南方水产科学，2016，12(6):99-107.

[7] 张美霞，耿慧君，王丽丽,等. 哈维弧菌对水产动物的致病性及其噬菌体防控研究进展[J]. 中国抗生素杂志，2017，42(9):717-723.

[8] 徐硕超，李洋，符春丹,等. 清热解毒复方对头孢拉定的抑菌增效作用及机理[J].广东药科大学学报，2017，33(2):198-202.

[9] 李洋，徐硕超，刘广锋,等. 熊果酸对金黄色葡萄球菌生物膜形成的影响[J].广东药科大学学报，2017，33(2):158-161.

[10] 白方方，张晓华. 哈维氏弧菌群体感应系统对几种胞外酶的活性影响[J].中国海洋大学学报(自然科学版)，2010，40(6):91-95.

[11] 曾县平. 细菌鞭毛系统的研究进展[J]. 安徽农业科学，2012(27):13215-13217.

[12] 陆盼盼，郭松林，关瑞章,等. 致病性弧菌外膜蛋白及其免疫原性研究进展[J].生物技术通报，2014(4):30-35.

[13] LUO G，HUANG L，SU Y，et al. flrA ，flr B and flr C regulate adhesion by controlling the expression of critical virulence genes in Vibrio alginolyticus[J]. Emerg Microbes Infect，2016，5(8):e85.

[14] MAO Z,YU L,YOU Z,et al. Cloning,expression and immunogenicty analysis of five outer membrane proteins of Vibrio parahaemolyticus zj2003[J]. Fish Shellfish Immunol,2007,23(3):567-575.

[15] 钟琳红，陈吉祥，姜莹安,等. 非可培养状态哈维氏弧菌(Vibrio harveyi )复苏后生理特征及毒力相关基因表达[J].海洋与湖沼，2010，41(3):435-439.

[16] 万峰，彭成，曹小玉,等. 广藿香精油对金黄色葡萄球菌的抑菌活性及机制研究[J]. 中成药，2014，36(7):1376-1381.

[17] 彦培傲，彭成，李芸霞,等. 广藿香抗菌作用的研究进展[J].华西药学杂志，2016，31(5):540-543.

[18] YILDIZ F H，VISICK K L. Vibrio biofilms:so much the same yet so different[J]. Trends Microbiol，2009，17(3):109-118.

[19] CRISTINA G A，SILVIA M R，MILTON D L，et al. Quorum-sensing regulates biofilm formation in Vibrio scophthalmi[J]. BMC Microbiol，2012，12(1):1-9.

[20] 卢海亭,乔军,孟庆玲,等.分子伴侣hfq基因缺失对单核细胞增生李斯特菌毒力及生物被膜生成的影响[J]. 华北农学报,2017,32(1):94-98.

[21] YILDIZ F H，LIU X S，HEYDORN A，et al. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae O1 El Tor phase variant[J]. Mol Microbiol，2004，53(2):497-515.

[22] KALMOKOFF M，LANTHIER P，TREMBLAY TL，et al. Proteomic analysis of Campylobacter jejuni 11168 biofilms reveals a role for the motility complex in biofilm formation[J]. J Bacteriol，2006，188(12):4312-4320.

[23] 吴贤斌，邹海杰，田丽花,等. 大肠杆菌外膜蛋白ompW基因敲除菌的构建及其对两种抗生素的敏感性[J]. 微生物学报，2012，52(8):1021-1026.

[24] RITTER A，COM E，BAZIRE A，et al. Proteomic studies highlight outer-membrane proteins related to biofilm development in the marine bacterium Pseudoalteromonas sp. D41[J]. Proteomics，2012，12(21):3180-3192.