溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)发病机制未明，主要临床表现为腹痛、腹泻和便血。是炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)的一种。目前临床治疗一线用药以5-氨基水杨酸为主，病情严重患者以糖皮质激素抗炎抑炎治疗为首选[1]。目前已知与UC的重要危险因素即为肠道生态平衡的失调，主要表现为肠道上皮黏膜屏障受到破坏(肠道感染等)[2]。自噬通过清除长寿命蛋白和受损的细胞器，修复受损的肠上皮细胞，清除肠内入侵细菌来维持内环境稳态[3]。在IBD发生过程中，内质网应激产生自噬体，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物进而改变肠上皮细胞功能[4]。有关研究表明自噬可以通过调节肠道菌群和粘液分泌来维持肠道内稳态，最终达到减轻UC的作用[5]。但在结直肠癌发展的不同阶段自噬的作用结果不同，Beclin-1、LC3表达升高有利于早期结肠癌的发展，而在葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)联合二甲肼诱导的结肠炎相关性结肠癌中，自噬相关基因Beclin-1、LC3B-Ⅱ/LC3b-Ⅰ、P62的下调可以减少小鼠结肠炎相关性结肠癌的发生[6-7]。本研究进一步探讨自噬在UC中的作用，并探讨自噬是否通过改变肠黏膜屏障功能等来影响UC的机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级C57BL/6 小鼠(简称C57)20只，体质量24～26 g,8周龄,购自广东省医学实验动物中心，生产许可证号：SCXK(粤)2013-0002。

1.2 主要试剂及抗体

DSS购于MP Biomedicals；便隐血试纸购于珠海贝索生物技术有限公司；抗TNF-α、IL-1β抗体购于Proteintech；ATG7购于Sigma；LC3-b购于Cell Signaling Technology；免疫组化鼠抗、兔抗均购于中国北京中杉金桥生物技术公司；免疫荧光兔抗购于Cell Signaling Technology；PCR引物由上海生工生物有限公司合成。

上午十一点，扬子晚报记者来到中山陵的接驳车站点，等待接驳小火车的队伍仍然很长，一位接驳车的司机告诉扬子晚报记者，她估计中饭肯定是来不及吃了，因为游客太多天又热，只有赶紧多运送些客人。

1.3 DSS诱导构建UC模型

C57雄性小鼠20只，随机分为实验组与对照组，每组各10只，实验组小鼠自由饮用2%DSS溶液7 d，每隔1天更换新鲜配置的DSS溶液，对照组小鼠饮用无菌蒸馏水，在此期间每天监测记录小鼠的体质量，联苯胺法测量记录小鼠的粪便粘稠度和便血严重情况。

1.4 结肠组织病理形态评分

此次结果中可见，观察组实践操作、理论知识、制度掌握、流程掌握及法律法规评分高于对照组，P＜0.05；在满意度方面，观察组自我评价、教学方式、实习过程数据均高于对照组，P＜0.05。显然，观察组所用方式更具优势，学习效率及效果更佳。

1.5 免疫组化(immunohistochemical，IHC)

免疫组化检测小鼠结肠自噬蛋白ATG-7的表达，结果显示，与对照组相比，DSS组ATG-7表达下降。见图4。

1.6 免疫荧光(immunofluorescence，IF)

免疫组化以及免疫荧光病理切片在显微镜下使用同一背景色调，随机取20倍视野拍摄20张图片，使用Image-Pro-Plus6.0软件进行吸光度分析统计。实验数据以表示，采用GraphPad Prism 5软件进行统计分析。两组间比较采用配对t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

1.7 RT-qPCR方法检测结肠组织自噬相关基因的表达

使用TRIzol试剂分别提取小鼠结肠组织总RNA，紫外分光光度法检测RNA纯度并定量后，再按RT-qPCR试剂盒(Takara)说明书进行逆转录。以GAPDH为内参，检测小鼠结肠上皮组织中自噬相关基因ATG-7和P62的相对表达量，RT-qPCR结果计算公式为2-△△Ct=(Ct目的基因-Ct内参基因)实验组-(Ct目的基因-Ct内参基因)对照组。各引物序列见表1。

将小鼠结肠组织提取总RNA，逆转录后进行QPCR检测自噬相关基因ATG-7、P62表达。结果显示： 与对照组相比，DSS组ATG-7和P62的表达均下降，与对照组比较P<0.01，差异有统计学意义。见图6。

 

表1 各检测基因引物序列Table 1 PCR primers for genes

  

基因 Forward(5′⁃3′) Reverse(5′⁃3′)GAPDHTCCACCACCCTGTTGCTGTATCCACCACCCTGTTGCTGTAATG⁃7CCTTCGCGGACCTAAAGAAGTCCCGGATTAGAGGGATGCTCP62TGCTCTTCGGAAGTCAGCAACCCGACTCCATCTGTTCCTC

1.8 统计学处理

常规石蜡组织切片，脱蜡后高温高压抗原修复，10%BSA封闭，一抗LC3-b以1∶100的稀释比例用10%PBS配制后覆盖于组织上4 ℃过夜，复温1 h后使用带荧光的二抗避光孵育1 h ,PBS洗片后10%DAB显色10 s，苏木素复染后晾干封片，使用荧光二抗后所有操作均避光处理，最后用激光共聚焦拍摄统计。

免疫荧光方法检测LC3-b表达，激光共聚焦显微镜下观察LC3-b的表达，DSS组，LC3-b表达下调，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5。

2 结果

2.1 疾病活动指数

随着饮水天数的增加，与对照组相比，DSS组小鼠体质量出现明显下降，粪便粘稠度增高,便隐血增加。粪便粘稠度和便血根据试纸说明书进行评价。在DSS 7 d取材测量小鼠结直肠长度统计结果显示，DSS后小鼠结肠长度显著缩短。见图1。

2.2 结肠病理学形态及组织学评分

与对照组相比，DSS组出现重度炎症，上皮组织不连续或消失，大量炎症细胞浸润，腺体溶解消失，局部形成溃疡。组织学评分结果显示DSS诱导后出现重度炎症主要表现在横结肠和远端结肠段。见图2。

2.3 结肠组织中TNF-α、IL-1β的表达变化

与对照组相比，DSS组TNF-α、IL-1β表达明显增高(P<0.01)。见图3。

DSS第7天时颈椎脱臼法处死小鼠，取盲肠至肛门间的结直肠部分，测量结直肠长度，然后纵向剖开平铺在滤纸上，4%(φ)多聚甲醛固定12 h，卷肠、脱水、包埋后切片，进行HE染色，显微镜下观察结直肠的组织学形态、上皮腺体的完整性以及炎症的浸润情况，进行组织学评分[8]。

2.4 结肠组织中自噬蛋白ATG-7的表达变化

常规石蜡组织切片，脱蜡后高温高压抗原修复10 min，3%H2O2/甲醇灭活过氧化物酶，10%(φ)BSA封闭，一抗TNF-α、IL-1β、ATG-7均以1∶100的稀释比例用10%PBS配制后覆盖于组织上4 ℃过夜，复温1 h后,二抗孵育1 h,PBS洗片后10%DAB显色10 s，阳性染色显示为棕黄色，随后用苏木素复染后晾干，封片。光学显微镜拍摄分析统计。

2.5 结肠组织中自噬蛋白LC3-b的表达变化

(3)基坑开挖过程中，桩间土体流坍。现场踏勘情况表明，隧道下部地层为中砂，在基坑开挖中有桩间土体流失现象发生，致使隧道侧面及基底地层损失和漏空，进一步影响了隧道结构的受力状态。

  

与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图1 小鼠体质量、粪便粘稠度、便血情况以及结直肠长度Figure 1 Body weight,stool consistency,fecal blood and colon length in mice

  

A.对照组； B.DSS组。与对照组比较：**P<0.01。

 

图2 结肠组织病理形态及组织学评分(40×)Figure 2 Histopathological change and score of colon tissues in mice

  

A.对照组TNF-α免疫组化； B. DSS组TNF-α免疫组化； C.对照组IL-1β免疫组化; D. DSS组IL-1β免疫组化。与对照组比较：**P<0.01。

 

图3 结肠组织中TNF-α、IL-1β表达(40×)Figure 3 Expression of TNF-α and IL-1β in colon tissues (40×)

  

A.对照组； B. DSS组。与对照组比较：**P<0.01。

 

图4 结肠组织中ATG-7的表达(40×)Figure 4 Expression of ATG-7 in colon tissues (40×)

  

A.对照组LC3-b表达； B.对照组LC3-b与DAPI共定位； C. DSS组LC3-b表达； D. DSS组LC3-b与DAPI共定位。与对照组比较：**P<0.01。

 

图5 结肠组织中LC3-b的表达(40×)Figure 5 Expression of LC3-b in colon tissues (40×)

2.6 结肠组织中ATG-7、P62 mRNA的表达变化

2017年，在学校领导下成立了几十个社团，其中DIY创新科技社团是最受学生和老师关注的社团之一。其实在社团成立之前，学校就高度重视校园科技的发展了。在2016年和2017年连续两年里，学校都选派徐军副校长和王佐老师参加了全县的科技创新和辅导员培训。

  

与对照组比较：*P<0.05,**P<0.01。

 

图6 结肠组织中自噬因子ATG-7和P62 mRNA的表达

 

Figure 6 Expression of ATG7 and P62 mRNA in colon tissues

3 讨论

IBD主要包括克罗恩病和UC。目前，IBD在全球的发病率逐年上升，近10年来在亚洲不同城市IBD的流行病学调查及综合分析结果显示[9]：UC的发病率高于克罗恩病，而中国地区IBD的发病率显著高于其他国家。另外，在中国部分医院的统计数据分析也表明[10-11]，住院病人以及门诊IBD患者的人数逐年增加。由此，对于UC病因及发病机制的研究和探讨有重要的临床意义。近年来，UC自噬作用的研究主要集中在自噬基因表达改变对UC的影响及调控通路的研究，以及肠黏膜屏障破坏、内环境稳态失衡的免疫功能学研究，但自噬在UC不同时间段的作用尚存在争议，自噬途径免疫学研究具体机制尚未明确。

目前，模拟人类UC的动物模型方法有诸多，诱导急性UC多采用DSS进行诱导，与临床自发UC病理形态更为类似，且易于操作[12-15]。本研究利用免疫组化法检测DSS诱导的急性UC模型组和C57对照组结肠组织中TNF-α、IL-1β和ATG-7的表达，结果显示模型组结肠组织中促炎因子TNF-α、IL-1β表达升高，而自噬蛋白ATG-7表达降低，一方面证明了急性炎症诱导成功，另一方面，也说明了急性UC中自噬作用受损。另有文献报道自噬作用受损的情况下，脂多糖等累积，进而刺激了TNF-α和IL-1β的升高[15]，与本研究结果一致。

在自噬的过程中，LC3-b是主要被用来检测自噬活性的蛋白[16]。而P62作为自噬底物，其水平可以被看作自噬能力的指征。所以本研究主要选取了LC3-b、ATG7和P62进行IHC和RT-qPCR的检测，RT-qPCR检测结果表明，在结肠段这3种基因表达均呈现下调趋势，充分说明在UC急性期自噬作用受到了抑制，肠道内环境被破坏。有部分文献结果表明[17- 18]，通过阻断mTOR信号通路可以上调LC3-b和P62,增强自噬作用，最终达到减轻结肠炎症的作用。本研究结果表明，在结肠炎急性期，ATG7在结肠组织中的表达下降，与临床对UC患者血清中ATG7的检测结果一致[19]。反之，已有相关研究表明[20]，ATG7的缺乏、肠上皮细胞自噬功能下降的情况下，可以影响潘氏细胞颗粒形成，并且不能改善DSS诱导的肠道炎症和免疫反应，与本研究肠道炎症中ATG7的表达下调，自噬作用下降的实验结果一致。在IBD与自噬关系的研究中，研究较多的是关于肠道潘氏细胞、巨噬细胞和杯状细胞[21]，如果能够进一步明确自噬过程发生的具体细胞定位，将能更清楚诠释自噬在DSS诱导结肠炎中发挥作用的机制。

参考文献:

[1] ADAMS S M，BORNEMANN P H. Ulcerative colitis[J]. Am Family Physic,2013,87:609-705.

[2] PARKES M. The genetics universe of Crohn's disease and ulcerative colitis[J]. Dig Dis,2012,30(Suppl):178-181.

[3] 方健松. 自噬介导肠黏膜屏障维持肠道稳态在炎症性肠病中的作用[J]. 实用医学杂志,2016,32(8):1367-1369.

[4] KASER A，BLUMBERG R S. Autophagy,microbial sensing,endoplasmic reticulum stress,and epithelial function in inflammatory bowel disease[J]. Gastroenterology,2011,140(6):1738-1747.

[5] TSUBOI K，NISHITANI M，TAKAKURA A，et al. Autophagy protects against colitis by the maintenance of normal gut microflora and secretion of mucus[J]. J Biol Chem,2015,290(33):20511-20526.

[6] TRIVEDI P P，JENA G B，TIKOO K B，et al. Melatonin modulated autophagy and Nrf2 signaling pathways in mice with colitis-associated colon carcinogenesis[J]. Mol Carcinog,2016,55(3):255-267.

[7] 顾闻. 自噬相关基因与结肠癌的研究进展[J]. 医学研究生学报,2014,27(4):414-417.

[8] ADOLPH T E，TOMCZAK M F，NIEDERREITER L，et al. Paneth cells as a site of origin for intestinal inflammation[J]. Nature,2013,503(7479):272-276.

[9] NG S C. Emerging leadership lecture: Inflammatory bowel disease in Asia: emergence of a "Western" disease[J]. J Gastroenterol Hepatol,2015,30(3):440-445.

[10] 黄娟，魏艳玲，王军,等. 294例炎症性肠病临床特点及随访分析[J]. 第三军医大学学报,2016,38(8):835-839.

[11] 阮水良，沈海燕，陆其明,等. 2000—2014年我院炎症性肠病发病趋势及临床特征[J]. 中国医药导报,2016,13(22):40-43.

[12] LUO F Y. Animal models of ulcerative colitis[J]. World Chn J Digestol,2013,21(7):607-613.

[13] 张忠，程富胜，贾宁. 小鼠溃疡性结肠炎模型的建立及病理组织学比较[J]. 中国实验动物学报,2012,20(6):69-72.

[14] 梁颖,古筱茹,刘俊娥,等.肠炎康治疗DSS诱导小鼠实验性结肠炎的疗效及其机制研究[J].今日药学,2016,26(5):321-324.

[15] IIDA T，ONODERA KNAKASE H. Role of autophagy in the pathogenesis of inflammatory bowel disease[J]. World J Gastroenterol,2017,23(11):1944-1953.

[16] SCHAAF M B，KEULERS T G，VOOIJS M A，et al. LC3/GABARAP family proteins: autophagy-(un)related functions[J]. FASEB J,2016,30(12):3961-3978.

[17] CASTANO-RODRIGUEZ N，KAAKOUSH N O，LEE W S，et al. Dual role of Helicobacter and Campylobacter species in IBD: a systematic review and meta-analysis[J]. Gut,2017,66(2):235-249.

[18] MACIAS-CEJA D C，COSIN-ROGER J，ORTIZ-MASIA D，et al. Autophagy stimulation prevents intestinal mucosal inflammation and ameliorates murine colitis[J]. Br J Pharmacol,2017,174(15):2501-2511.

[19] LANKARANI K B，SEPEHRIMANESH M，SEGHATOLESLAM S F，et al. Autophagy-related protein 7 level in patients with ulcerative colitis[J]. Scand J Gastroenterol,2017,52(4):468-468.

[20] WITTKOPF N，GUNTHER C，MARTINI E，et al. Lack of intestinal epithelial atg7 affects paneth cell granule formation but does not compromise immune homeostasis in the gut[J]. Clin Dev Immunol,2012,10(3):1-9.

[21] KE P，SHAO B Z，XU Z Q，et al. Intestinal autophagy and its pharmacological control in inflammatory bowel disease[J]. Front Immunol,2016,7(10):1-14.

介孔二氧化硅纳米粒的功能化修饰及其在药物研究中的应用 ……………………………………………… 马博乐等（15）：2156