西南齿唇兰[Anoectochilus elwesii(Clarke ex Hook.f.)King et pantl ]别名：西南开唇兰、锺氏齿唇兰，属于兰科开唇兰属。开唇兰属植物在世界分布大约有40余种，而我国大约有20余种，主要分布于我国西南部至南部。其中金线兰又被称作“药中之王”，是我国珍稀濒危的名贵药材，具有清热解毒、祛风利湿、消炎止痛、镇咳等功效。近年来金线兰对肿瘤、糖尿病及其高血压等难题的治疗效果引起了相关研究学者的高度重视。由于金线兰自身及其生长环境等原因使其数量较少无法被广泛开发应用，使得相关品种活性开发的研究具有十分重要的作用[1-2]。相关学者对齿唇兰、西南齿唇兰及其艳丽齿唇兰在降血糖活性方面进行研究，实验表明西南齿唇兰具有良好的降血糖活性[3]。目前还未见西南齿唇兰抗氧化相关活性的报道，而相关研究表明当机体内正常代谢产生的活性氧、活性氮超出人体自身抗氧化保护系统的范围就会对机体造成伤害，动脉粥样硬化、癌症、神经性疾病等多种疾病都与氧化胁迫有关。随着经济的发展，人们更加关注身体健康问题，保健食品应运而生，其中保健食品以中草药为主，研究发现中草药中抗氧化的有效成分含量较多。通过抗氧化消除自由基的作用从而达到降血糖、降血压、提高免疫力、糖尿病性骨质疏松及其抗衰老的作用[4-5]。本文采用DPPH、ABTS、OH·自由基消除以及FRAP体外抗氧化模拟体系，旨在探讨西南齿唇兰提取物及其各极性部分的体外抗氧化作用，筛选出具有较高抗氧化活性组分，丰富和提高西南齿唇兰在医药、食品和保健领域的利用途径和价值。

[4] 季国兴：《南海航行自由原则的歧义及增进信任措施》，《上海交通大学学报(哲学社会科学版)》2005年第4期，第9-13页。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

西南齿唇兰于2016年在云南省文山自治州采摘，由广东药科大学中药学院马鸿雁老师鉴定为兰科开唇兰属植物西南齿唇兰Anoectochilus elwesii的全草，标本保存于广东药科大学药学院。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮基-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨盐(ABTS)、2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)及其2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(BHT)均购自上海麦克林生化科技有限公司；无水乙酸钠、H2O2、浓盐酸、浓硫酸、六水合三氯化铁及其冰乙酸均购自广州化学试剂厂；FeSO4、过硫酸钾及其抗坏血酸(VC)均购自天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

旋转蒸发仪RE52AA(上海亚荣生化仪器厂)；KQ5200E超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；酶标仪Eon(美国伯腾仪器有限公司)。

2 方法

2.1 样品提取与制备

A=A10-A11-A12

控制血糖。①饮食、运动治疗。根据孕周、体重和血糖指数计算患者每日所需摄入总量，合理搭配，保证蛋白质、碳水化合物、脂肪、维生素及微量元素的摄入，满足孕妇及胎儿发育所需。根据孕妇身体适当进行有氧运动。②血糖监测。每周对空腹血糖、三餐后2 h血糖进行监测，如血糖控制较差，需给予胰岛素治疗。③胰岛素皮下注射，从小剂量开始，根据血糖控制水平对胰岛素用量进行调整至血糖达理想水平。

2.2 溶液配制

2.2.1 样品溶液的制备 将西南齿唇兰总浸膏、石油醚部位浸膏、乙酸乙酯部位浸膏、正丁醇部位浸膏、水部位浸膏、抗坏血酸及其BHT使用80%(φ)甲醇溶解配制成一系列质量浓度的样品溶液。

2.2.2 DPPH溶液的制备 将DPPH溶解于甲醇中，配制成浓度为0.2 mmol/L的DPPH溶液。

2.2.3 ABTS+·溶液的制备 取7 mmol/L的ABTS水溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾水溶液等体积混合，23 ℃暗处反应12～16 h，将10 mL ABTS+·溶液移至500 mL容量瓶中定容稀释，使其734 nm下的吸光度值(A)在0.7±0.02范围内即得到目标浓度的ABTS+·溶液，避光23 ℃放置备用。

2.2.4 FRAP工作液的制备 根据中国药典，取无水乙酸钠5.1 g，加冰乙酸20 mL，再加水稀释至250 mL，即得乙酸盐缓冲液(pH=3.6)。称取适量的TPTZ粉末溶于一定量的40%(φ)盐酸溶液，即得10 mmol/L TPTZ溶液。将乙酸盐缓冲液(pH=3.6)、10 mmol/L TPTZ溶液以及20 mmol/L FeCl3溶液按10∶1∶1体积比混合，于37 ℃避光温育，临用前现配。

2.3 抗氧化活性的测定

2.3.1 DPPH自由基清除作用[6-7] 分别取2 mL不同质量浓度0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的西南齿唇兰总浸膏及不同极性部位供试品溶液，加入0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL，避光反应30 min，在571 nm波长下使用酶标仪测定吸光度值(A)。以2 mL不同浓度的BHT、VC为阳性对照，进行3次平行实验，取平均值。

DPPH自由基清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%

式中A1为2 mL对应浓度样品与2 mL DPPH溶液混合的吸光度值，A2为2 mL对应浓度的样品溶液与甲醇溶液2 mL混合的吸光度值，A3为80%甲醇作为空白溶液与0.2 mmol/L DPPH甲醇溶液2 mL混合的吸光度值。

式中A4为0.1 mL对应浓度的样品溶液与3.9 mL ABTS+·溶液混合的吸光度值，A5为0.1 mL样品与3.9 mL蒸馏水混合的吸光度值，A6为80%甲醇作为空白溶液与3.9 mL ABTS+·溶液混合的吸光度值。

2.3.2 ABTS自由基消除作用[8-10] 分别取0.1 mL不同质量浓度0.3、0.9、1.5、2.1、3.0 mg/mL的西南齿唇兰总浸膏及不同极性部位供试品溶液加入3.9 mL ABTS+·溶液，置于23 ℃水浴中反应30 min，在734 nm波长下使用酶标仪测定吸光度值。以0.1 mL不同浓度的BHT、VC作为阳性对照，进行3次平行实验，取平均值。

ABTS自由基清除率=[1-(A4-A5)/A6]×100%

水稻白叶枯病发生流行的前提，首先是要有足够的菌源，至于流行程度的轻重则受气候、水肥管理、品种感病性等多种因素影响。

2.3.3 OH·自由基清除能力[11] 分别取1 mL不同浓度0.8、1.4、2.0、2.6、3.2 mg/mL 的西南齿唇兰总浸膏及不同极性部位供试品溶液加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水杨酸乙醇溶液以及1 mL 9 mmol/L H2O2溶液，置于37 ℃水浴反应30 min后，分别在510 nm波长处使用酶标仪测定混合溶液的吸光度值。以1 mL BHT、VC作为阳性对照，进行3次平行实验，取平均值。

从图1可知，西南齿唇兰总浸膏及其各不同极性部位浸膏对于DPPH自由基消除具有一定的活性作用，在质量浓度0.25～2.0 mg/mL范围内，所有样品对 DPPH自由基的清除能力均随样品浓度的升高而逐渐增大呈现明显的剂量依赖性，各浸膏部位高剂量组的DPPH自由基清除能力接近阳性药的DPPH自由基清除能力。其中总浸膏、石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位及其水部位的IC50分别为0.896、1.463、0.463、0.271、0.537、0.859 mg/mL。在西南齿唇兰各部位浸膏对DPPH自由基清除作用考察中，乙酸乙酯部位清除DPPH自由基的能力最强，IC50为0.271 mg/mL，其中在乙酸乙酯浓度为1.0 mg/mL时其DPPH自由基的清除率为94.79%，而相同浓度下的阳性药BHT的DPPH自由基清除率为94.44%，相比之下该浓度下乙酸乙酯部位的DPPH自由基清除能力比阳性药BHT的DPPH自由基清除能力强。

式中A7为1 mL对应浓度样品与FeSO4溶液、H2O2溶液以及水杨酸溶液混合的吸光度值，A8为1 mL对应浓度样品与FeSO4溶液、H2O2溶液以及70%乙醇混合的吸光度值，A9为1 mL 80%甲醇与FeSO4溶液、H2O2溶液以及水杨酸溶液混合的吸光度值。

2.3.4 FRAP方法[12] FRAP即考察样品对铁离子还原能力。分别取0.5 mL不同质量浓度0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL的西南齿唇兰总浸膏及不同极性部位供试品溶液与3 mL FRAP工作液混合，37 ℃温育反应30 min后593 nm波长下使用酶标仪测吸光度值。以1 mL BHT、VC作为阳性对照，进行3次平行实验，取平均值。

将采摘的西南齿唇兰自然晾晒得到干重西兰齿唇兰6.146 kg，使用粉碎机将药材粉碎成一定大小的碎片，将其置于提取罐中，使用10倍量的95%(φ)乙醇在50 ℃下提取3次，再将其在70 ℃下提取3次，每次提取3 h，将依次过滤得到的提取液在45 ℃浓缩罐中浓缩得到总浸膏(TF)1.533 kg。将浸膏混悬于适量的水中，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯以及正丁醇多次萃取浓缩得石油醚部位浸膏(PEF)316.0 g、氯仿部位浸膏(CF)47.0 g、乙酸乙酯部位浸膏(EAF)32.0 g、正丁醇部位浸膏(BF)168.1 g以及水部位浸膏(WF)918.9 g。

将测得的数据使用SPSS 22.0软件进行处理，得到样品清除DPPH自由基、ABTS自由基和羟基自由基的半数抑制浓度(IC50)及其量效关系曲线图。

在图2中可知，西南齿唇兰总浸膏及其各不同极性部位浸膏对ABTS自由基均具有一定清除作用，在质量浓度0.30～3.0 mg/mL范围内，所有样品对ABTS自由基的清除能力均随样品浓度的升高而逐渐增大呈现明显的剂量依赖性。其清除能力大小依次为VC>BHT>乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>总浸膏>水部位>石油醚部位，其中乙酸乙酯部位的IC50为0.600 mg/mL，而氯仿部位与正丁醇部位的IC50为1.571、1.927 mg/mL，其他部位对ABTS自由基的清除率相对较低，均未超过50%。相同质量浓度下乙酸乙酯部位对于ABTS自由基的清除能力远远大于其他部位，在浓度为3.0 mg/mL时其清除率达到84.85%，从曲线可以看出乙酸乙酯部位浓度超过3.0 mg/mL后清除率随着浓度的增加仍处于快速增强的趋势。

2.4 统计学方法

项目3：财务信息化管理系统核心模块的构建，根据信息系统总体功能要求，对关键信息的采集、分析模块的搭建、工作流程的规范、审批权限的设定进行定义和规划。

3 结果

3.1 对DPPH自由基清除作用

羟自由基清除率=[1-(A7-A8)/A9]×100%

  

图1 西南齿唇兰乙醇提取物及不同极性部位对DPPH自由基的清除作用

 

Figure 1 Scavenging effect of Anoectochilus elwesii ethanol extract and different polar parts on DPPH free radicals

3.2 对ABTS自由基清除作用

式中A10为0.5 mL对应浓度的样品与3 mL FRAP工作液混合的吸光度值，A11为0.5 mL对应浓度的样品与3 mL乙酸盐缓冲液混合的吸光度值，A12为80%甲醇与3 mL FRAP工作液混合的吸光度值。

3.3 OH·自由基清除能力

在图3中可知，西南齿唇兰总浸膏及其各不同极性部位浸膏对OH·自由基均具有一定清除作用，在质量浓度0.80～3.20 mg/mL范围内，所有样品对OH·自由基的清除能力均存在一定的量效关系。其清除能力大小依次为VC>石油醚部位>BHT>乙酸乙酯部位>总浸膏>氯仿部位>正丁醇部位>水部位，其中石油醚部位的IC50为2.153 mg/mL，石油醚部位的OH·自由基清除能力比阳性药BHT的强，并且随着浓度的增长，其OH·自由基清除能力处于快速增强的趋势。而乙酸乙酯部位的OH·自由基清除能力与BHT相近，其他部位浸膏的OH·自由基清除能力相对较弱，其量效关系不明显。

  

图2 西南齿唇兰乙醇提取物及不同极性部位对ABTS自由基的清除作用

 

Figure 2 Scavenging effect of Anoectochilus elwesii ethanol extract and different polar parts on ABTS free radicals

  

图3 西南齿唇兰乙醇提取物及不同极性部位对OH·自由基的清除作用

 

Figure 3 Scavenging effect of Anoectochilus elwesii ethanol extract and different polar parts on hydroxyl free radicals

3.4 还原能力

在图4中可知，西南齿唇兰总浸膏及其各不同极性部位浸膏可较好地将Fe3+还原为Fe2+，在质量浓度0.25～2.0 mg/mL范围内，所有样品对将Fe3+还原成Fe2+的能力均存在一定的量效关系。各个样品还原能力由强到弱顺序依次VC>BHT>乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>水部位>总浸膏>石油醚部位。相同质量浓度下乙酸乙酯部位的还原能力远远大于其他部位，而石油醚部位还原能力较弱基本不具有还原能力。

当节点检测到枪声信号时开始监听网络中是否有相同频率的载波，以此来判断当前信道是否空闲。当前信道忙碌时，节点不发送数据并保持连续监听；当前信道空闲时，网络中可能出现多个节点同时需要发送数据的情况，需要合理的退避机制来规避节点的信道冲突。在节点退避周期结束之后执行空闲信道评估（Clear Channel Assessment，CCA），如果此时节点检测到信道空闲则发送数据，否则节点进入下一个数据收发周期。退避算法[5]的流程如图3所示。

  

图4 西南齿唇兰乙醇提取物及不同极性部位将Fe3+还原成Fe2+能力

 

Figure 4 Effect of Anoectochilus elwesii ethanol extract and different polar parts on reducing Fe3+ to Fe2+

4 讨论

不同的抗氧化体系具有不同的抗氧化作用机制，本文采用DPPH法、ABTS法、OH·自由基清除及其FRAP法4种不同体系的体外抗氧化活性检验方法对西南齿唇兰的不同极性部位的清除DPPH·、ABTS+·、OH·自由基及其将Fe3+还原成Fe2+能力的相关抗氧化活性进行了综合评价，通过以上研究发现西南齿唇兰的石油醚部位、氯仿部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位、总浸膏均存在不同程度的抗氧化活性，不同部位的抗氧化能力也存在一定差距。在一定的浓度范围内都呈现出一定的量效关系，即提取物的浓度越大，抗氧化活性越高。DPPH法检测样品抗氧能力实验中研究发现在DPPH自由基清除模型中，抗氧化活性强弱顺序为乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>总浸膏>水部位>石油醚部位，其中乙酸乙酯部位浓度大于1.0 mg/mL时，其清除DPPH自由基的能力比相同浓度的阳性药BHT强。在检测样品的ABTS自由基清除能力实验中，西南齿唇兰不同极性部位的抗氧化顺序为乙酸乙酯部位>氯仿部位>正丁醇部位>总浸膏>水部位>石油醚部位。在OH·自由基清除模型中，抗氧化活性强弱顺序为石油醚部位>乙酸乙酯部位>总浸膏>氯仿部位>正丁醇部位>水部位。在考察样品的Fe3+还原成Fe2+实验中，西南齿唇兰不同极性部位的抗氧化顺序为乙酸乙酯部位>正丁醇部位>氯仿部位>水部位>总浸膏>石油醚部位。不同极性部位的抗氧化能力的强弱是由于各极性部位中具有的抗氧化能力的化合物的结构和含量差异引起的。在这些不同极性部位中乙酸乙酯部位展现出来的抗氧化能力最为突出，证实了西南齿唇兰中的抗氧化活性物质主要存在于乙酸乙酯萃取物中，乙酸乙酯部位可作为西南齿唇兰抗氧化活性研究的主要极性部位进行深入研究，并进一步分离其中的抗氧化活性成分。研究结果可为进一步深入开展研究西南齿唇兰关于氧化应激损伤性疾病的防治药物筛选提供参考。

成人对儿童阅读重要性的认识以及对儿童阅读指导方法的掌握在很大程度上影响着儿童阅读。因此，在推进区域性儿童阅读的过程中，我们首先做的不是给孩子布置任务和作业，而是抓住教师这个关键，积极促进教师阅读。金牛区在这方面总结出“四线推进”的阅读推广模式。

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