随着近年来对肠道菌群的研究不断深入以及“菌群-肠道免疫”、“脑-肠轴”等理论的提出[1]，发现肠道菌群与人体的多个系统存在密切的联系，尤其是免疫系统。最近发表在《Science》上的多篇研究论文表明，肠道菌群直接影响到PD-1封闭抗体抗肿瘤免疫治疗的效果[2]，进一步提示人们有必要重视肠道菌群与免疫系统的联系。考虑到传统中药以饮用为主，很可能也会通过改变肠道菌群而调节人体的生理状态，尤其是补益类的中药。

甘草是一类能够调节机体免疫功能的补益类中药，能调和百药、解百毒[3]，已有大量的研究[4]表明甘草能够调节机体的免疫状态，因此本研究探讨了甘草水提物对肠道菌群的影响,为进一步研究肠道菌群如何影响机体的免疫状态奠定基础。

1 材料

1.1 试剂与仪器

甘草产地甘肃，产品批号YPA6A0002，经广东药科大学杨全教授鉴定为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch；金银花产地河南，生产批号：150901，经广东药科大学杨全教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花；Stool DNA Kit(OMEGA,D4015-01); SIGMA 1-16小型台式离心机(德国SIGMA公司)；BSA124S-CW分析天平(德国Sartorius公司)；VORTEX-6旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.2 实验动物

8周龄SPF级BALB/c小鼠25只，雄性，体质量18～22 g，购于广州中医药大学实验动物中心，生产许可证号SCXK(粤)2013-0034。

2 方法

2.1 水提物制备

甘草(Glycyrrhiza uralensis)可清热解毒、祛痰止咳，而金银花(honeysuckle,HS)具有清热解毒、疏散风热[5]的功效，两者作用既有相似之处，又有显著差异，因此在本研究中以金银花作为对照。称25 g甘草和15 g HS分别用8倍体积水浸泡30 min，加热2 h，8层纱布过滤，分别旋蒸至25 mL和15 mL，得到1 g/mL水提物。根据中国药典中甘草用量为2～10 g，HS用量为6～15 g，以人与动物体表面积换算折算法为依据[6]，得到小鼠正常服用甘草最大剂量为1.5 g/kg，并以此作为中剂量组,分别以增大5倍和减小5倍作为高剂量组和低剂量组，HS正常可服用最大剂量为4 g/kg，确定小鼠甘草灌胃剂量设置高、中、低剂量组为7.5 g/kg、1.5 g/kg、0.3 g/kg，HS组为4 g/kg，分别用生理盐水进行稀释。灌胃生理盐水作为空白对照组。

2.2 动物分组处理

肠道是人体最大的消化器官，含有丰富的淋巴细胞，其中肠道菌群发挥了重要作用，一旦失衡，部分身体功能将发生紊乱。传统中药以饮用为主，因此很可能也会通过改变肠道菌群而调节人体的生理状态，而中药是否能够影响肠道菌群，以及如何影响非常值得进行研究。

2.3 粪便收集

最后1次灌胃24 h后，收集各组小鼠粪便，每组100 mg。置于2 mL干燥的灭菌离心管中，-80 ℃冰箱中进行保存。

2.4 DNA提取和测序

本研究中，Alpha多样性是通过重抽样，使OTU数不同的各组统一为序列数相同的情况，再用特定算法对各组的多样性进行估算。通过计算结果可以看出，作为对照的HS组与空白对照相近，并未对肠道菌群的丰富度和均匀度起到明显的调节作用，说明了HS与甘草所具有的差异。相比于空白对照组，甘草中剂量组有助于改善肠道菌群多样性，而高、低剂量组都不同程度产生了相反的作用。图5可以看出高剂量组与低剂量组、空白对照组均有较大差异而低剂量组与空白对照组差异不大。图4(B)中，因横轴占有82.51%的绝对权重而单独分析横坐标发现，低剂量组与空白对照组也非常接近，说明低剂量的甘草对菌群的丰度影响不大；图4(A)中，高、低剂量组距离较远且均与空白对照组距离较远，说明菌群类型有较大差异。以上分析说明，高剂量的甘草通过改变菌群种类和丰度降低了肠道菌群多样性，而低剂量甘草中有益成分可能尚未发挥明显作用，改变菌群类型的成分降低了肠道菌群多样性，这体现了中药使用中的过犹不及现象。

2.5 数据分析

基于群落组成信息，计算样品的Alpha多样性从而得知丰富度和均匀度，通过Beta多样性的主坐标分析等，进一步比较不同样品和分组的群落结构差异。Alpha多样性(Alpha diversity)主要包括Shannon指数和Simpson指数，用来估算样本中微生物多样性，其中指数越大说明群落多样性越高。Beta多样性(Beta diversity)主要包括PCoA分析(主坐标分析，principal co-ordinates analysis)和样本距离heatmap图分析，它们反映的是不同样品的微生物群落间的差异。PCoA分析基于beta多样性距离矩阵，通过降维手段使各组间的差异在坐标中以距离大小表示。样本距离heatmap图根据OTU在不同样品中的相对丰度，利用距离公式计算不同样品间的相异系数，并进行聚类。

3 结果

3.1 共有及特有OTU统计分析

通过对原始数据的处理，得到每个样本的OTU总数(表1)，并根据不同样品之间共有、特有的OTU数绘制具有代表性组的韦恩图(图1)，可以看出甘草水提物降低了特有OTU数目。

 

表1 各样本OTU总数Table 1 Total amounts of OTU in different groups

  

组别剂量/(g·kg-1)序列数OTU数空白对照-35130685HS435970688甘草 高剂量7．532278607 中剂量1．530493600 低剂量0．326748604总计1606193184

  

注：high.甘草高剂量组；Med.甘草中剂量组；low.甘草低剂量组；Con.空白对照组。

 

图1 5组样品间OTU差异Venn图Figure 1 Venn diagram of OTU identified in five groups

3.2 群落结构

行业专家认为，智能建造正逢其时，从纯手工制造到智慧建筑，是一项复杂而又艰巨的科技攻关项目，更是实践性要求极强的复杂工程实践探索。但面对建筑用工成本的攀升、难度增强，以及市场需求等现实问题，建筑业的“云端”转型刻不容缓。

Beta多样性是样品间的生物多样性比较PCoA分析选择区分样品的2个最大差异特征为坐标轴，图4A为基于Unweighted Unifrac[8]距离，对稀有物种较敏感，图中两样品距离越近，表示物种组成越相似。甘草中剂量与空白对照组距离较近，而高、低剂量组都距离它们较远；图4B基于Weighted Unifrac距离中，对丰度高的物种较敏感，与图A结果基本一致。图5样本距离heatmap图中甘草中剂量组与空白对照组相近，而低剂量和高剂量表现出较大差异。

群落结构与机体特性及免疫系统联系紧密，图2可知门水平上主要由拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、软膜菌门(Tenericutes)组成，其中拟杆菌门和厚壁菌门相对比例最高。图3中，在空白对照组和甘草低剂量组中均以拟杆菌门为绝对优势菌种，随着甘草水提物浓度的提高，拟杆菌门比例明显下降，厚壁菌门比例明显升高并成为绝对优势菌种；而相比于空白对照组，HS组主要降低了变形菌门的丰度，与甘草有明显不同。美国华盛顿大学医学院的研究发现[9]，肥胖者比瘦者多出约20%的厚壁菌，同时又比瘦者少了约90%的拟杆菌，这与不同浓度甘草灌胃的结果也是非常相似的，说明肠内厚壁菌门多于拟杆菌门时会导致更有效吸收食物热量从而导致肥胖，高剂量的甘草水提物可能通过这一途径促进肠道的吸收。另有研究表明[10]，高剂量的甘草能够促进胃肠运动，从另一方面揭示了可能的原因。

  

图2 小鼠肠道微生物在门水平的组成Figure 2 Bacterial distribution at the level of phylum

3.3 物种丰富度和均匀度分析

Alpha多样性是对单个样品中物种多样性的分析，包含物种组成的丰富度和均匀度2个因素。表2中Shannon指数和Simpson指数可以看出甘草中剂量组的群落多样性最高，高剂量组多样性最低。

  

A.门水平上各组丰度比较； B. S24-7科和理研菌科组间丰度比较; C.脱硫弧菌属和Flexispira属组间丰度比较。

 

图3 肠道群落的丰度比较Figure 3 Abundance of intestinal flora in five groups

 

表2 Alpha多样性指数分析Table 2 Alpha diversity indices analysis

  

组别剂量/(g·kg-1)ShannonSimpson空白对照-6．3210．971HS46．3630．972甘草 低剂量0．36．7190．981 中剂量1．56．0060．963 高剂量7．55．7290．912

3.4 Beta多样性分析

②如杨国强所言：“曾在两千多年岁月里笼罩了中国人精神世界的儒学，已在一百来年的历史震荡之后，大半移到了中国人的精神世界之外,成了一种熟悉而又陌生的东西,一种看起来很近,实际上又离得很远的东西。而其间仍然留存于文字和观念里的部分，则在势易世迁之中不是对象化(客体化)了，便是片断化了；或者是既对象化了，又碎片化了。若以儒者之学本是为己之学相对比，显见得都隔了一层而不能由外入里。因此，一百年之后说儒学，其实我们都在门墙之外。”(杨国强：《历史中的儒学》，《东方早报·上海书评》，2013年4月7日。)

  

图4 基于Unweighted Unifrac距离(A)和Weighted Unifrac距离(B)的PCoA分析Figure 4 PCoA analysis based on unweighted Unifrac metrics (A) and weighted Unifrac metrics (B)

  

图5 样本距离热图聚类分析Figure 5 Heatmap clustering analysis

4 讨论

将25只8周龄SPF级雄性BALB/c小鼠适应性喂养3 d后随机分为5组，每组5只，高、中、低剂量组、HS组、空白对照组灌胃0.2 mL/d，灌胃7 d;饲养期间，小鼠自由取食(饮用灭菌水)。

采用粪便基因组DNA提取试剂盒提取各组中小鼠粪便样品的微生物总DNA。送至广州美格生物有限公司测序。样品总DNA通过PCR扩增、产物纯化、文库制备及库检、上机测序得到原始数据，对原始数据进行剪切过滤拼接成Tags，进一步过滤目标片段并聚类成为操作分类单元(operational taxonomic units，OTU)。先根据得到的总OTU，统计分析其中共有及特有的OTU，再进行OTU物种注释得到每个样品不同水平的群落组成信息[7]。

4.2.2 临近保质期食品提示制度。设立临近保质期食品的常温、冷藏或冷冻销售专柜，集中陈列出售临近保质期食品。向消费者作出醒目的“临近保质期食品”提示。

在门水平上整体的群落构成主要为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、软膜菌门(Tenericutes)。其中除了甘草高、中剂量组以厚壁菌门比例最大外，其余组均以拟杆菌门比例最大,见图2。在不同水平上部分差异显著的细菌群落见图3，可见拟杆菌门和变形菌门的丰度随着甘草水提物剂量的增加而降低，而厚壁菌门的丰度则随着甘草水提物剂量的增加而增加。在科水平上，S24-7科和理研菌科(Rikenellaceae)的丰度均随着甘草剂量的增加而降低。在属水平上，脱硫弧菌属(Desulfovibroi)的丰度随着甘草剂量的增加而增加，而Flexispira属的丰度则随着甘草剂量的增加而降低。这些菌群的变化与甘草水提物的给药剂量之间表现出良好的相关性。

随甘草水提物浓度升高，拟杆菌门中S24-7科的比例显著下降(图3B)，S24-7科可能与逆境环境相关，如其在冬眠松鼠的肠道微生物中含量显著高于夏天的松鼠[11]，S24-7还被报道与IgA相联系，可能导致结肠炎[12]。甘草能够显著降低这一菌群，这部分解释了甘草具有抗炎和治疗腹痛的功效。 变形菌门中(图3C)，脱硫弧菌属虽然占比重很小，但组间具有较大差异，有研究表明[13]，脱硫弧菌增多是息肉和溃疡性结肠炎疾病的一个重要特征。据报道，Flexispira属主要高表达于有炎症性疾病复发人群、慢性腹泻及胃肠道炎症或溃疡，在衰老小鼠体内其高丰度可能与衰老小鼠的氧化应激状态有关[14]。在Flexispira属的丰度结果中，低剂量明显升高而其他剂量都与空白对照相近或降低，说明低剂量的甘草中致炎成分可能大于抗炎成分发挥的作用，HS组的大大降低也证明了HS与适当剂量的甘草都具有减轻炎症的作用。不同剂量甘草对于这些菌群的调节表明，剂量对于治疗的效果有着非常重要的影响，过高和过低都可能导致某些菌群的比例显著增加，从而影响机体的生理状态。此外，这些发生变化的菌群普遍涉及宿主的免疫状态，与朱雪峰[15]甘草对小鼠免疫功能的影响研究结果一致。

综上所述，本研究表明甘草水提物能够显著影响小鼠肠道菌群的构成，并且部分菌群的变化与甘草剂量之间表现出良好的相关性。改变的菌群与宿主的免疫状态和代谢关系密切，从而部分解释了甘草的一些药效作用机制，本研究为进一步探索肠道菌群的改变对机体免疫状态的影响及拓展中药研究的新方向奠定了基础。

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