海洋贝类含有丰富的天然活性产物，是营养食品和新型药物的重要来源。其中，象拔蚌(Panopea generosa Gould)不仅肉质鲜美、营养丰富，而且还具有清肝明目、祛脂降压、利尿消肿等功效[1]。象拔蚌又被称为太平洋潜泥蛤、皇帝蚌、女神蛤等，Vadopalas等[2]研究发现Panopea generosa和Panopea abrupta属于同种异名并建议以Panopea generosa统一命名。目前有关象拔蚌天然产物如多糖、多肽的研究较少，而且主要是针对提取制备工艺和体外抗氧化活性的研究[3-5]。本文以人细胞HepG2和模式动物秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans，以下简称秀丽线虫)为模型，针对象拔蚌多肽提取物(Panopea generosa protein hydrolyzate，PgPH)开展了抗氧化活性及其作用机理的研究。其中HepG2细胞被广泛用于各种抗氧化剂的研究[6]，而秀丽线虫具有生命周期短、实验操作简单、遗传背景清楚等优点，被广泛用于天然产物以及衰老、神经保护等研究[7]。因此，本研究将为象拔蚌多肽的抗氧化活性研究提供基础数据并为其保健功能的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料 象拔蚌购自广东省广州市黄沙水产交易市场，并经广东药科大学生命科学与生物制药学院贾伟章副教授鉴定；HepG2细胞株购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection，ATCC)；秀丽隐杆线虫和大肠杆菌购自美国明尼苏达大学秀丽隐杆线虫遗传学中心(Caenorhabditis Genetics Center，CGC)。

1.1.2 试剂 木瓜蛋白酶(食品级，6 000 USP U/mg)(北京索莱宝科技有限公司)；胰蛋白酶(食品级，≥25 00 U/mg,上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；RPMI-1640培养基、胎牛血清(FBS)、0.25%胰酶溶液(0.25% Tryspin-EDTA)；青霉素-链霉素双抗(10 000 U/mL penicillin and 10 000 μg/mL streptomycin)、磷酸盐缓冲液(PBS,pH 7.4)(Gibco公司)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH,Sigma公司)；噻唑蓝(MTT,北京索莱宝生物科技有限公司)；30%过氧化氢(H2O2,广州化学试剂厂)；二甲亚砜(DMSO,广州化学试剂厂)；百草枯、5-氟脲嘧啶(Sigma公司)；Western及IP细胞裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、过氧化氢酶(catalase,CAT)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；BCA试剂盒(Thermo Fisher Scientific)；Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)。

1.1.3 主要仪器 BioTek Synergy H1酶标仪、Thermo 3111 CO2细胞培养箱(Thermo Fisher Scientific)；CytoFLEX流式细胞仪(Beckman)；TDL-40B低速离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 方法

1.2.1 PgPH的制备 多肽提取物参照Wang等[8]的方法制备。取象拔蚌活体，去壳、去皮、去内脏，清洗除沙，切成薄片，匀浆。取匀浆液适量分装，经冷冻干燥获得象拔蚌干粉。称取5 g象拔蚌干粉，加入80 mL一级去离子水浸润，然后置于水浴锅中预热至45 ℃。用玻璃棒充分搅拌，加入0.5 mol/L NaOH溶液调节溶液pH至8.0，然后加入1 mL浓度为15 000 U/mL的胰蛋白酶在45 ℃水浴锅中恒温反应4 h。加入0.1 mol/L HCl溶液调节上述酶解液的pH值至6.0，然后加入20 mL浓度为750 U/mL的木瓜蛋白酶在60 ℃水浴锅中恒温反应4 h，最后在100 ℃水浴处理10 min。在酶解液自然冷却后加入适量95%(φ)乙醇使乙醇终浓度为60%，室温静置过夜，减压抽滤除去沉淀，所得滤液再经冷冻干燥获得PgPH干粉(得率约40%)。后续根据DPPH自由基清除实验、细胞实验和秀丽线虫实验需要，PgPH干粉分别溶解于去离子水、细胞培养液和S Medium培养液备用。

1.2.2 DPPH自由基清除实验 参照Chen等[9]方法进行。在96孔板中，空白组为100 μL不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)和等体积无水乙醇，处理组为100 μL不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL)和等体积DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/mL)，造模组为100 μL DPPH乙醇溶液(0.1 mmol/mL)和等体积去离子水，每个处理设3个重复，室温避光反应30 min后用酶标仪在515 nm测定吸光度值(A)，空白组、处理组和造模组吸光度值分别为A0、A1和A2。DPPH清除率计算如下：1-[(A1-A0)/A2]×100%。

1.2.3 细胞毒性实验 参照Ma等[10]方法，将对数生长期的HepG2细胞以104个/mL的密度接种于96孔板(100 μL/孔)，在5%(φ)CO2饱和湿度培养箱中于37 ℃培养24 h。处理组加入不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)，对照组加入等体积细胞培养基，每个处理设3个重复，继续培养24 h。每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h。吸去液体，每孔加入200 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪检测570 nm处A值。细胞存活率=(A处理组/A对照组)×100%。

1.2.4 H2O2细胞氧化造模实验 将对数生长期的HepG2细胞以104个/mL的密度接种于96孔板(100 μL/孔)，在5% CO2饱和湿度培养箱中于37 ℃培养24 h。造模组加入不同浓度H2O2(25、50、100、200、400、800 mmol/L)，对照组加入等体积细胞培养基，每个处理设5个重复，造模4 h。随后吸去原培养基并加入新鲜细胞培养基，继续培养24 h。每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h。吸去液体，每孔加入200 μL DMSO，振荡10 min，用酶标仪检测570 nm处A值。细胞存活率计算如下：细胞存活率=(A造模组/A对照组)×100%。

1.2.5 细胞抗氧化实验 将对数生长期的HepG2细胞以104个/mL的密度接种于96孔板(100 μL/孔)，在5%CO2饱和湿度培养箱中于37 ℃培养24 h。除对照组外，其余各组加入浓度为400 mmol/L的H2O2，每个处理设5个重复，造模4 h。随后吸去原培养基，处理组加入不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0 mg/mL)，其余各组加入等体积的细胞培养基，继续培养24 h。每孔加入10 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h。吸去液体，每孔加入200 μL DMSO，振荡10 min，酶标仪检测570 nm处A值。细胞存活率=(A造模组或处理组/A对照组)×100%。

1.2.6 细胞抗氧化酶活力的测定 将对数生长期的HepG2细胞以3×105个/mL的密度接种于6孔板(100 μL/孔)，在5%CO2饱和湿度培养箱中于37 ℃培养24 h。除对照组外，其余各组加入浓度为400 mmol/L的H2O2，对照组加入等体积细胞培养基，造模4 h。随后吸去原培养基，处理组加入不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0 mg/mL)，其余各组加入等体积细胞培养基，继续培养24 h。随后每孔加入500 μL细胞裂解液(细胞裂解液∶PMSF=100∶1，体积比)，室温裂解5 min后收集液体于EP管中，于4 ℃和10 000 g离心5 min，取上清液。用BCA法测定上清液中的蛋白浓度，并分别按照总SOD活性检测试剂盒(WST-8法)和CAT检测试剂盒说明测定裂解后上清液中的SOD和CAT活力。

1.2.7 细胞凋亡检测 将对数生长期的HepG2细胞以3×105个/mL的密度接种于6孔板(100 μL/孔)，在5% CO2饱和湿度培养箱中于37 ℃培养24 h。除对照组外，其余各组加入浓度为400 mmol/L的H2O2，对照组加入等体积细胞培养基，造模4 h。随后吸去原培养基，处理组加入不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0 mg/mL)，其余各组加入等体积的细胞培养基，继续培养24 h。收集每组细胞，用预冷的PBS清洗2次后，加入500 μL Binding Buffer重悬细胞，加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温避光孵育10 min，用流式细胞仪分析各组细胞凋亡情况。

1.2.8 秀丽线虫的培养与同步化 选用野生型秀丽线虫N2进行实验，在含有大肠杆菌OP50的NGM平板上进行日常培养和维护，采用碱性次氯酸盐法进行同步化[11]。

1.2.9 秀丽线虫食物清除率实验 食物清除率实验参照Zhang等[11]方法进行。将同步化的L1期N2秀丽线虫以10～15条/10 μL的密度加入96孔板，随后加入80 μL大肠杆菌NA22混合液(A570≈0.70)，处理组加入10 μL不同质量浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)，对照组加入等体积的S Medium培养液，每个处理设8个重复，在20 ℃培养。以加入96孔板为第0天，用酶标仪每24 h检测570 nm处A值，连续测定5 d。

1.2.10 秀丽线虫百草枯氧化胁迫实验 百草枯氧化胁迫实验参照Zhang等[11]方法进行。将同步化的成虫期N2秀丽线虫以10～15条/10 μL的密度加入96孔板，随后加入80 μL大肠杆菌NA22混合液(A570≈0.50)，处理组加入10 μL不同浓度的PgPH溶液(0.5、1.0、2.0 mg/mL)，对照组加入等体积S Medium培养液，每个处理设6个重复，在20 ℃培养24 h。然后加入终浓度为50 mmol/L的百草枯。以加完百草枯为第0小时，每12 h统计秀丽线虫的存活状况，直至全部死亡。以秀丽线虫身体僵直不动、对轻微震动和光源无反应为死亡状态。

1.2.11 统计分析 用GraphPad Prism 7软件作图，用SPSS 22.0软件进行统计分析。细胞数据采用单因素ANOVA分析并比较差异性，实验数据以表示，P<0.05为差异有统计学意义。秀丽线虫数据采用Kaplan-Meier法进行分析。

2 结果

2.1 PgPH对DPPH自由基的清除作用

本文首先采用DPPH清除实验检测了PgPH在体外清除自由基的能力。如图1所示，在0.5～4.0 mg/mL质量浓度范围内，随着浓度的增加，PgPH对DPPH自由基的清除率提高。在PgPH浓度为1.0 mg/mL时DPPH清除率已有近60%，在4.0 mg/mL之后DPPH清除率趋于稳定，达到90%。这些结果表明PgPH具有良好的体外抗氧化活性。

  

图1 PgPH对DPPH自由基的清除效果Figure 1 Scavenging effect of PgPH on DPPH radicals

2.2 PgPH对细胞生长的影响

为了选择合适的细胞给药浓度，采用MTT法检测了不同浓度PgPH对HepG2细胞生长的影响。如图2所示，PgPH在质量浓度为0.5～2.0 mg/mL范围内对细胞生长没有明显的抑制和促进作用，在4.0 mg/mL之后对细胞生长有一定的抑制作用。因此，后续细胞实验选择0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和2.0 mg/mL的PgPH进行。

  

图2 PgPH对HepG2细胞生长的影响Figure 2 Effect of PgPH on HepG2 cell growth

2.3 PgPH对H2O2损伤HepG2细胞的作用

为了选择适合HepG2细胞的H2O2氧化损伤造模浓度，采用MTT法检测了不同浓度H2O2(25、50、100、200、400、800 mmol/L)对HepG2细胞生长的抑制作用。如图3所示，H2O2在50～800 mmol/L浓度范围内对HepG2细胞呈现出浓度依赖性的生长抑制作用。其中，当细胞存活率≈50%时，H2O2浓度为400 mmol/L，因此后续细胞实验选择400 mmol/L H2O2浓度进行细胞氧化造模。

  

图3 H2O2对HepG2细胞生长的影响Figure 3 Effect of hydrogen peroxide on HepG2 cell growth

在确定了合适的PgPH给药浓度和H2O2氧化损伤造模浓度后，采用MTT法检测PgPH对H2O2造成HepG2细胞氧化损伤的作用。如图4所示，用不同浓度的PgPH(0.5-2.0 mg/mL)处理24 h后，细胞存活率比造模组略有提高，但差异无统计学意义。

  

图4 PgPH对HepG2细胞的抗氧化作用Figure 4 Effect of PgPH on H2O2-exposed HepG2 cells

2.4 PgPH对HepG2细胞抗氧化酶活力的影响

尽管在用PgPH处理24 h后H2O2氧化损伤的HepG2细胞存活率并没有显著提高，但细胞的氧化应激系统可能已激活或加强，因此本文进一步检测了PgPH对HepG2细胞部分抗氧化酶的影响。如图5所示，用PgPH处理后，HepG2细胞SOD和CAT的活力比H2O2造模组有显著提高。为了检测PgPH是否影响细胞凋亡，本文还用Annexin V/PI双染法检测细胞凋亡状态，结果表明，与造模组相比，PgPH处理后HepG2细胞在凋亡早期和晚期以及总凋亡细胞比例没有显著变化(数据未展示)，说明对细胞凋亡无影响。

为了验证PgPH的体内抗氧化能力，采用百草枯氧化胁迫实验检测了不同浓度PgPH(0.5、1.0、2.0 mg/mL)对秀丽线虫耐受氧化胁迫能力的影响。如图7所示，当用PgPH处理后，秀丽线虫存活率比百草枯氧化造模组都有提高。当浓度为0.5、1.0和2.0 mg/mL时，秀丽线虫存活率比造模组分别提高了18%、30%和42%(表1)。这些结果说明PgPH具有显著提高秀丽线虫缓解百草枯氧化损伤毒性的能力。

用模式动物秀丽线虫开展的进一步研究表明，PgPH对秀丽线虫的生长和繁殖没有明显影响，但能够显著提高在百草枯氧化胁迫下秀丽线虫的存活率，说明PgPH具有有效缓解百草枯氧化损伤的能力。有研究表明，一些抗氧化活性产物具有延长秀丽线虫寿命的作用，例如从鞘丝藻提取出的藻红蛋白通过其抗氧化作用延长秀丽线虫寿命[13]，当归多肽也可以通过抗氧化作用延长秀丽线虫寿命[8]。因此，PgPH也可能具有延长秀丽线虫寿命和抗衰老的潜在能力。

  

与H2O2造模组比较：*P<0.05，**P<0.01。

 

图5 PgPH对HepG2细胞内抗氧化酶的影响

 

Figure 5 Effect of PgPH on the antioxidant enzyme activities in HepG2 cells

2.5 PgPH对秀丽线虫氧化损伤的缓解作用

生物体内的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)广泛参与机体的生理和病理过程。在生理条件下，体内清除ROS的抗氧化物质主要有抗氧化酶、雌二醇等，而抗氧化酶是清除ROS的关键物质，包括SOD、CAT、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)、硫氧还蛋白过氧化物酶(peroxiredoxin,PRX)等[12]。本研究发现，PgPH不仅具有较强的体外清除DPPH自由基能力，还能提高HepG2细胞抗氧化酶SOD和CAT的活力，说明PgPH具有缓解细胞氧化性损伤的潜力。

  

图6 PgPH对秀丽线虫食物清除率的影响Figure 6 Effect of PgPH on food clearance of C. elegans

本系统主要包括主控模块、显示模块、检测模块、电源模块等四大部分，整体结构图如图1所示.其中主控模块可以实时控制电源模块为各个模块供电.检测模块负责检测油液获取数据信息，并与主控模块进行通信[11].图2概括了本系统硬件操作流程.对于系统的整体性操作步骤见表1.

  

图7 PgPH对秀丽线虫在百草枯氧化胁迫下存活率的影响

 

Figure 7 Effect of PgPH on the survival of paraquat-exposed C. elegans

 

表1 PgPH对秀丽线虫在百草枯氧化胁迫下平均存活时间和中位数存活时间的影响

 

Table 1 Effect of PgPH on the mean survival time and median survival time of paraquat-exposed C. elegans

  

c(PgPH)/(mg·mL-1)秀丽线虫数平均存活时间/h中位数存活时间/h0161116．2±3．5120．0±6．50．584137．0±5．6132．0±20．01．0126150．9±4．6168．0±4．62．0142165．0±3．9180．0±3．9

3 讨论

由于PgPH具有缓解氧化胁迫的潜力，本文进一步用秀丽线虫模型检测了其体内抗氧化能力。为了选择PgPH对秀丽线虫合适的浓度，采用食物清除率实验检测了不同浓度PgPH(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mg/mL)对秀丽线虫生长和繁殖的影响。如图6所示，PgPH在0.5-2.0 mg/mL浓度范围内曲线趋势与对照组一致，表明秀丽线虫摄食正常，PgPH在该浓度范围内对秀丽线虫生长和繁殖没有明显影响。因此，后续秀丽线虫实验选择0.5 mg/mL、1.0 mg/mL和2.0 mg/mL浓度进行。

由于气蚀的严重性往往发生在金属表面，也可在阀芯、阀座、阀座后流道处喷涂碳化钨或堆焊一层硬质合金，即表面硬化处理，推荐选用STL合金。

本研究证实PgPH具有体内、体外抗氧化活性，为象拔蚌相关产品的开发应用提供了实验基础。

十年前后的课堂教学中绝大部分学习材料来自“教师”的事先预设，只在“多倍”理解中有少数材料来自“学生”。十年前后材料的情境外衣发生了变化，但实质是“几个多少”，即“多少的几倍”，那么我们是否可将这个“干货”回归到更简单质朴的数学情境中，让学生参与“创造”知识的过程，在创造知识的过程中又创造学习材料，让学习真实发生。

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(7) 2台网关服务器进行同步2台应用服务器，由于2台应用服务器精度控制在50 ms内，这样可确保2台网关服务器精度在50 ms内。