1 前言

基质固相分散（MSPD）在1989年由Barker等人率先提出，并应用于动物组织代谢产物的提取。从那以后，该技术引发大批研究人员的兴趣。基质固相分散萃取的优点包括用途广泛、灵活性高、可行性强、低消耗、快速等[1，2]。此外，这项提取技术还可用来提取含有大量有机化合物的样品，这些样品有来自固体、半固体，或者是高粘度的生物基质包括动物组织、血液、菌落、农作物蔬菜等。

众所周知，药用植物的成分十分复杂。在许多国家，这些植物用来治疗和预防疾病有上千年的历史。因此，提取药用植物的成分并测定活性成分的含量至关重要。传统的提取方法包括索氏提取、回流提取、超声提取和微波提取等，相关报道屡见不鲜。这些技术具有一些缺点，例如投料大、涉及有毒溶剂等。

青皮，为芸香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。在许多国家，青皮还作为食品添加剂和制成饮料供人们食用。药理学研究表明，青皮具有多种功效包括抗突变、消炎、抗癌和抗动脉硬化，还有开胃和清肺功能。青皮中主要的活性成分为橙皮苷、川青皮素、桔皮素[3]。最近，科学家们发现其生物活性显著，例如抑制冠心病、缓解痉挛等。

本实验的目的，在于建立一套基质固相分散萃取技术，结合超高效液相色谱，用于分析测定青皮中的黄酮类有效成分，并使得实验所用材料（样品、吸附剂、洗脱液）最小化，契合绿色化学概念。为了得到最优效果，我们系统考察了影响实验的因素包括分散剂种类、样品和分散剂的质量比、研磨时间、洗脱液种类和体积、洗脱液pH的影响以及其他因素的影响，最后，成功将方法用于真实样品的含量测定，灵敏度高，选择性好，应用前景良好。

2 实验部分

2.1 试剂与样品：C18购于上海正亚化工有限公司。弗罗里硅土和Al2O3购于上海安谱实验科技股份有限公司。色谱级甲醇和乙腈购于Sigma-Aldrich公司。分析纯乙醇、盐酸、丙酮购于徐州化学试剂有限公司。其余试剂均为分析纯。标准品橙皮苷、川青皮素、桔皮素购于江苏省食品药品检定所，每种标准品纯度均大于98%。青皮购于徐州当地药店。

3.5 洗脱液pH考察：我们采用在甲醇中添加乙酸的方式调节洗脱液的pH，乙酸含量在1%～5%范围。结果如图6所示。甲醇中乙酸含量分别对应1%、2%、3%、4%、5%。对于橙皮苷而言，随着乙酸含量的增加，提取效果逐级递减。而对于川橙皮素和桔皮素，乙酸含量从1%增加至2%，提取效果有下降趋势，往后则变化不大。可能的原因是，这类黄酮成分在常规环境下呈中性，且橙皮苷更容易受环境pH的影响。而且，分子筛和目标分子之间的相互作用，例如氢键和范德华力，会在酸性环境下得到加强，这就使得在解吸时变得困难，从而影响提取效果。另外，我们还发现三者活性成分的峰面积在纯甲醇环境下达到最大值。因此，我们最终确定最优条件时，不在甲醇中添加酸。

2.2.1 索氏提取：参照《中国药典》2015版。取本品粗粉约1g，精密称定，置索氏提取器中，加石油醚（60℃～90℃）80mL，加热回流2～3h，弃去石油醚，药渣挥干，加甲醇80mL，再加热回流至提取液无色，放冷，滤过，滤液置100mL量瓶中，用少量甲醇分数次洗涤容器，洗液滤入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。

核磁共振碳谱不仅可提供有机物碳核类型、核间关系、碳分布信息外，还能区分立体异构体的微细结构。并且13C-NMR能够测定含碳较多的有机物及不含氢的官能团，可反映出氢谱无法反映的结构，如季碳原子结构，羰基等功能基[30]。通过对核磁共振碳谱中有机物主要碳基团化学位移的分析，有机物的碳化学位移主要分为4个部分：烷基碳区(0～50 ppm)、烷氧基碳区(50～110 ppm)、芳香碳区(110～160 ppm)、羰基碳区(160～220 ppm)[31-32]。

在水利工程勘测与设计技术方面，引进了隧道测量、水下淤积快速测量、高精度探地雷达、三维激光数字仿真、水电工程三维设计等31项用于水利工程勘测和设计的技术与设备；开发了基于GPRS的放样无线数据通信控制系统等软件，并在我国黄河古贤水利枢纽、海南红岭水利枢纽等一些重要水利工程建设中成功运用；促进了我国在空间、地面及地下三个尺度层面上勘测能力的提高，提升了三维可视化设计水平，为复杂地质地形条件下大型水利工程的顺利建设提供了支撑。

2.2.2 基质固相分散萃取：精密称取25mg青皮药材粉末，按照质量比1∶1，称取25mg吸附剂，两者加入研钵中研磨150s。取1mL规格固相萃取小柱进行填充，填充完毕，置于固相萃取仪上。取0.5mL甲醇，对小柱进行洗脱。底部用1.5mL规格离心管收集。洗脱结束后，将离心管内液体涡旋10s，后放入离心仪中，13000rpm离心5min。在UPLC中进样分析。

3 结果与讨论

提取效果取决于吸附剂和样品之间的分配平衡。我们以样品的峰面积数据作为最终考察的标准。我们系统性地考察了吸附剂种类、吸附剂和样品之间比例、研磨时间、洗脱液种类、洗脱液体积、水影响、辅助吸附剂影响、洗脱液pH影响。

3.1 吸附剂种类考察：不同的吸附剂，吸附能力和选择性不同。本次考察的对象是3种黄酮类分子。我们考察了4种吸附剂，包括硅胶、Al2O3、弗罗里硅土和C18。结果如图1所示，硅胶的效果明显优于其他三者。众所周知，硅胶和目标分子之间是靠范德华力吸附，这就使得这类材料对不饱和黄酮类的吸附能力十分强烈，使得目标分子的提取效果显著提高。另外，如图1所示，弗罗里硅土的提取效果也较为突出，可能的原因是，该材料本身具有长链烃基结构，会和黄酮类成分产生相互作用。然而，C18和Al2O3两者的效果相对较差。上述现象表明目标分子和吸附剂相互作用是各种因素综合的结果。最后，我们采用硅胶作为最优吸附剂，用于后续的考察。

图1 吸附剂种类考察 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素。A为硅胶、B为Al2O3、C为弗罗里硅土、D为C18

3.2 样品和吸附剂之间比例考察：吸附剂和样品之间的质量比是十分重要的一个因素，因为该比例不仅控制了样品和目标分子的接触情况，还影响了洗脱环节。我们考察了样品:吸附剂=4∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3 几种情况，对应吸附剂的质量范围是 6.25～75mg。实验结果如图2所示，比例从4∶1到1∶1区间内，吸附效果递增。这意味着增加硅胶的用量，将使得吸附剂和目标分子之间接触更加充分。此外，当比例从1∶1增加到1∶2时，提取效果反而下降。最可能的原因是，过多的吸附剂将影响洗脱环节，不利于目标分子的解吸。随后，随着吸附剂用量的增加，提取效果并未显著增加，这表明，1∶1的比例已经足以在体系中达到饱和。因此，我们采用1∶1的比例作为最佳条件。

图2 样品和吸附剂比例考察结果 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素A 为 4∶1、B 为 2∶1、C 为 1∶1、D 为 1∶2、E 为 1∶3

3.6 方法学考察：在最优条件下，我们考察的方法学参数包括线性关系、精密度、检测限、定量限、重复性。结果详见表1。标准曲线拟合过程中，我们采用的线性范围在0.1～100ng。所有目标分子的线性相关系数良好，其值均大于0.9990。日内精密度中，保留时间的RSD值低于0.04%，峰面积的RSD值低于0.18%。日间精密度同样表现良好，保留时间和峰面积的RSD值分别低于0.93%和0.89%。检测限是信噪比为3时对应的进样量，三者活性成分的检测限范围在0.2～0.3μg/mL，定量限（信噪比为10）范围则是0.7～0.8μg/mL。5组平行试验的重复性考察结果显示，保留时间和峰面积的重复性RSD值分别为0.52%～1.33%和3.02%～3.55%。该方法的准确度以回收率为目标进行考察，三个分析物的回收率在90%～101%范围内。青皮提取液在0、6、12、18、24h内考察，三个目标化合物的峰面积RSD在1.21～3.02范围内。上述数据表明该方案可有效进行定量分析。

2.3 仪器条件：仪器：UPLC（Waters Co.，Milford，MA，U.S.A.）。色谱柱ACQUITY UPLCBEH C18柱（1.7 μm，2.1mm×50mm）。柱温40℃。流动相0.1%甲酸水溶液（A）、甲醇（B），流速0.4mL/min。梯度洗脱：0～2min，30%～45%B；2～4min，45%～45%B；4～6min，55%～70%B；6～7min，70%～80%B；7～8min，80%～90%B，8～9min，90%～100%B，9～10min，100%～100%B。进样体积0.2μL。检测波长283nm。

图3 研磨时间考察结果 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素

总而言之，GPS系统具有数据测量的高效性、准确性和科学性，减少了工作流程中浪费的大量人力、财力、物力。现代科学技术的发展推动了GPS技术和地理信息系统的结合，二者的应用也为人们的工作和生活带来了极大的便利。在未来的日子里，研究人员还要不断完善GPS技术，为各行业提供准确有效的数据支持。

我们在考察洗脱液体积时，范围在400～800μL。结果如图5所示。洗脱液体积在400～500μL时，提取效果增加，因为充足的洗脱液用量将更彻底地将目标分子解吸出来。此外，当洗脱液体积大于500μL后，随着稀释效应的影响，目标分子的峰面积逐渐下降并趋向平缓，证明500μL体积的洗脱液恰好能完全将目标分子解吸出来，并保证峰面积最大。因此，在后续考察中，我们统一采用500μL作为最优条件。

图4 洗脱液种类考察 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素 A为甲醇、B为乙醇、C为乙腈、D为丙酮和E为乙酸乙酯

图5 洗脱液体积考察 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素

2.2 样品前处理

根据GB/T 19073—2008《风力发电机组齿轮箱》的加载试验要求为：按25%、50%、75%的额定负载各运转30 min，按100%额定负载运转120 min，110%超负载运转30 min，120%超负载运转5 min。针对这些要求，试验台所使用的变频电动机必须要有很高的可靠性。

图6 洗脱液pH考察结果 1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素 A为纯甲醇、B为1%乙酸甲醇溶液、C为2%乙酸甲醇溶液、D为3%乙酸甲醇溶液、E为4%乙酸甲醇溶液、F为5%乙酸甲醇溶液

3.3 研磨时间考察：在考察研磨时间时，我们考察的范围是110～190s。结果如图3所示。时间在110～150s区间时，提取效果递增。该现象证明充分的研磨会增加目标分子和吸附剂之间的相互作用。此外，图3还证明，在150～190s区间，疏水性成分川青皮素和桔皮素效果递减较为明显，但具有酚羟基结构的橙皮苷变化不大。这表明研磨时间过度后，会使得吸附剂和目标分子之间吸附程度过度，反而在解吸环节引起困难。因此，我们采用150s作为最优条件。

表1 目标分子的线性关系、精密度、检测限、定量限

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其中，1为橙皮苷、2为川青皮素、3为桔皮素。

3.4 洗脱液种类考察：在考察洗脱液种类时，我们选取了甲醇、乙醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯。结果如图4所示。甲醇的洗脱效果明显优于其余洗脱液，尤其是对橙皮苷的洗脱效果，更是出类拔萃。这意味着洗脱液的结构性质影响着对目标分子的相互作用，即相似相溶原理。另外，甲醇的极性比其余四者都要大，而且甲醇可以和这三种目标分子相互产生氢键作用。如图4所示，丙酮组的橙皮苷响应较甲醇组低，丙酮组的川青皮素和桔皮素效果和甲醇组接近。这也证明了相似相溶的合理性。因此，我们采用甲醇作为最佳的洗脱液。

采取压实度和空隙率双重控制标准。压实度评定以钻芯样为准，取芯后用混合料回填芯洞并予以夯实。压实度和空隙率的计算应采用当天的马歇尔标准相对密度和最大相对理论密度，当天的马歇尔标准相对密度和最大相对理论密度与配合比设计时的标准相对密度和最大相对理论密度的偏差应小于1%。压实度采用双控指标，应在沥青路面铺筑完成3d后进行检测，要求马歇尔标准密度的压实度不小于98%，最大理论密度的压实度为92%～98%，面层实测空隙率应为2%～8%。

图7 本实验所得液相色谱图 A为标准品，B为药典方法，C为本方法

3.7样品分析：为了检验本方案的有效性，我们进行了青皮药材中这三种活性成分的含量测定。实验所得色谱图见图7。相比药典所述方案（图7B），本方案的富集倍数提高了12～29倍（图7C）。该结果证明SBA-15在富集青皮中活性成分的表现优异。此外，根据标准曲线，可测得青皮中的含量分别为87.94mg/g橙皮苷、42.76mg/g川青皮素、32.32mg/g桔皮素。同时，三种活性成分的回收率在90%～101%。

此外，还有以书局、报社、政府机构、学校、外国团体为代表的团体捐赠构成了这一时期图书捐赠的主体。藏书家们拥有丰富的典藏给予图书馆大力的援助；社会名人以其在各界的社会地位和名人效应，表率示范；书局、报社等出版机构因其行业特点，能够长期、批量的进行捐赠；政府机构尤其是教育部对图书馆的发展较为重视，常有举措以支持；学校本为教育机构，对利于普及民众教育的图书捐赠亦是不遗余力；中外文化更多的相互关注、交流和协助，图书的互相流通和共享，也是其中重要内容。

结果显示，本方案所用样品、吸附剂、洗脱液均比其他方案少，节约了实验成本，减少了环境污染。而且，本方案相比其他传统的基质固相分散萃取技术，富集倍数更大。

综上所述，本方案相比其他技术在天然产物的分析测定中更胜一筹。

4 小结

在本研究中，我们建立了一种简单、快速的基质微固相分散萃取技术，同时结合UPLC作为检测手段，用于提取测定青皮中的橙皮苷、川青皮素和桔皮素。

相比其他传统的富集方法，例如超声和回流，本方案的优点在于实验用量低、环境污染少。此外，硅胶展现了对黄酮类成分的强烈吸附作用。结果证明，本方案可有效地用于天然产物中有效成分的提取测定。

参考文献

[1]陈一鑫，冯清胜，王晓中，等.离子液体-基质固相分散-超声雾化-固相萃取结合高效液相色谱法检测人参中三嗪类除草剂[J].分析化学，2016，44（7）：1106-1111.

[2]殷斌，吴友谊，周震华，等.基质固相分散萃取-毛细管电泳测定米制品中丙烯酰胺[J].分析测试学报，2017，36（2）：280-283.

[3]罗琥捷，杨宜婷，李晓伟，等.11个品种来源陈皮中多甲氧基黄酮的测定[J].中成药，2017，39（3）：565-569.