PCDH8基因是原钙黏蛋白家族中的一种，作为抑癌基因可促进肿瘤细胞的分化以及介导肿瘤细胞之间的黏附，同时具有细胞间的特异性识别作用[1]。PCDH8蛋白表达的下调，可以促进肿瘤细胞的恶性生物学行为，如肿瘤细胞的侵袭和增殖能力[2]。前期研究发现在前列腺癌中，PCDH8基因启动子区域存在高甲基化，并且可以用来作为预测前列腺癌的预后的独立因素[3]。为探索PCDH8基因启动子甲基化可检测的范围，本实验中我们进步检测前列腺癌病人外周血中PCDH8基因启动子甲基化的情况。

1　材料和方法

1.1　样本收集与处理

研究标本为自2015-12～2017-06在佳木斯大学附属第一医院泌尿外科进行诊疗的30例前列腺癌患者和30例前列腺增生患者的血清学标本。所有病人的病例结果均由接受前列腺电切术或前列腺穿刺活检术诊断并且由术后病理证实。所有研究对象均登记患者年龄、PSA值、病理分期、Gleason评分和淋巴转移的情况。所有受试者于术前清晨空腹抽取静脉血3～4mL，收集在抗凝管中。收集到的血液标本于4℃静止2h，进行低速离心3000r/min，10min离心后弃沉淀，留上清。所有标本置于-80℃保存，并标记清楚编号，标本收集所用收集管及冻存管均需高压灭菌和去除内毒素，以防干扰实验结果。

湿地生态旅游开发很重要的工作就是湿地生态恢复，这需要充足的资金保证。资金的来源要多元化，政府、企业、社区、个人都可以成为投资者，都应当为湿地生态旅游开发贡献力量。旅游部门要接受政府部门的监管，遵守旅游市场规则，不断提高自身的经营管理水平，正确处理湿地生态与企业、社区的利益，体现人与湿地和谐的思想。

1.2　血清样本基因组DNA提取

取出冻存管，常温下解冻取2mL血清，在40℃水浴锅中快速解冻，样本基因提取采用德国QIAGENamp Blood Mini kit试剂盒提取血清DNA。通过以上步骤收集到的DNA使用紫外分光光度计进行测定波长在260nm处的OD值，计算DNA量，确保DNA总量在2μg以上，同时使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳观察DNA条带以及亮度。收集到的DNA样本置于-20℃保存备用。

1.3　PCR法进行PCDH8基因的筛选、鉴定及扩增和亚硫酸盐修饰

在Genebank文库中查找人PCDH8基因序列及其编号，使用Primer5软件设计PCDH8基因引物(引物序列见图表1)，PCR上机步骤及循环圈数严格按照实验设计方案进行，将回收后的DNA放入专用EP管中，置于-20℃。DNA亚硫酸盐修饰试剂盒购于德国天根公司生产(货号：HZ-F061)，具体步骤严格根据试剂盒操作说明操作，操作中严格控制每个步骤的反应温度及反应时间，最后每0.5μg的DNA经甲基化修饰后使用1μLDTT溶解，置于-20℃保存。

1.4　甲基化特异性聚合酶链式反应(methylation specific polymerase chain reflect，MSP)

前列腺癌是泌尿生殖系统中十分常见的常见肿瘤，并且近年来该疾病在我国以及亚洲地区的很多国家呈现出很高的发病率和病死率。许多前列腺癌患者在门诊得到初次诊断时已经发生了肺、肝、肾、骨等远处器官转移，因此这部分患者预后很差[4]。在我国前列腺癌的另一特点是前列腺癌发病率很不平衡。在医疗条件比较好的大城市，由于体检得到重视和医生对这种疾病认识的提高使前列腺癌的早期发现变得更加多见。由于多种原因使前列腺癌晚发现和早发现并存是我国前列腺癌流行病学的特点。早期发现前列腺癌依靠PSA，经直肠前列腺指诊和穿刺活检。但是都有局限性[5]。人们希望用更加方便准确的方法更早的发现和治疗前列腺癌。前列腺癌发病机制中，癌基因和抑癌基因的相互作用是肿瘤发生发展的重要原因。在肿瘤发生发展过程中，抑癌基因的失活是肿瘤发生发展的重要因素。启动子甲基化是抑癌基因失活的重要机制。

采用SPSS17.0软件进行统计学数据分析，其中以均数±标准差来表示本实验结果的各项数据，计数资料用卡方检验进行分析，P<0.05为差异具有统计学意义。

 

表1　PCR引物、反应循环圈数、退火温度以及目的条带大小

  

基因引物序列循环圈数退火温度(℃)PCR产物大小(bp)PCDH85'-GGTTATAAAGGTAAAG GTGGT-3'45604223’-CAAACATTTCTCACACTAAAA-5’MSP5’- GTTAGGGAGGATGGATGTAAGTATC-3’41581443’- GCGAAATAAAAACAATAAAACGAC-5’N-MSP5’- GTTAGGGAGGATGGATGTAAGTATT-3’38581473’-CCCACAAAATAAAAACAATAAAACAA-5’

30例前列腺癌患者血清中出现PCDH10基因甲基化的共有12例(40%)，见图1。但是在30例前列腺增生患者血清中，均未发现PCDH8基因启动子出现甲基化现象。二种结果进行对比，显示PCDH8基因出现甲基化的比率在两种疾病中差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。

1.3　统计学方法

1）拆架程序应遵守由上而下，先搭后拆、后搭先拆的原则，即先拆拉杆、脚手板、剪刀撑、斜撑，而后拆小横杆、大横杆、立杆等(一般的拆除顺序为安全网→栏杆→脚手板→剪刀撑→小横杆→大横杆→立杆)。

表示层用来完成地图数据和业务数据的展示以及人机交互的相关逻辑，接收用户的输入并将用户的意图转换为对业务层相关逻辑的调用。地图展示和地图操作通过调用ArcGIS API for JavaScript接口快速实现。

2　结果

以上所有反应结束后，可取5-10μL的PCR扩增产物跑胶(即琼脂糖凝胶电泳)，此步骤可加入适当的Lodding buffer作为指示剂，跑胶结束可在蓝光下观察实验结果，并拍照以进行实验分析。

PCa　　　　 BPH

  

图1　30例前列腺癌患者血清中PCDH8基因甲基化

PCa: 前列腺癌病人的血清标本, BPH: 前列腺增生病人的血清标本; M: 甲基化; U: 非甲基化; P1: 甲基化阳性对照; P2: 非甲基化阳性对照。

 

表1　前列腺癌病人临床病理与PCDH8基因启动子甲基化之间的相关性(n=30)

  

临床病理特征VariablesNo.M (%)U (%)P值年龄(岁)<7017890.6031≥701349病理分期pT218990.5650pT31239Gleason score<7162140.0045≥714104PSA<1014680.5098≥1016610外科切缘 Positive8760.1015Negative22517淋巴结转移Presence7430.6501Absence23815

M: 甲基化; U: 非甲基化

3　讨论

将上一步采用亚硫酸盐进行修饰以后的启动子DNA作为模板，甲基化反应步骤引物采用Primer5软件设计，(同时实验中也有部分引物设计来源于PCDH8甲基化相关文献)，出现阳性结果的引物序列及PCR反应条件见表1。反应体系为25μL：5X PCRbuffer5μL，10pmol/μL上下游引物各1μL，10mmol/LdNTPs0.5μL，3U/μL Tap酶0.5μL，DNA模板1μL，补ddH2O 16μL。该反应中所使用到的PCR引物均由北京擎科新业生物技术有限公司合成，具体引物碱基排列、PCR反应循环圈数、退火温度以及PCR结束后鉴定所需的目的条带大小见表1。

我们前期研究发现抑癌基因PCDH家族在前列腺癌的发病过程中起了重要作用。在前列腺癌组织中PCDH8启动子甲基化率达到60%。在前列腺增生组织中甲基化率为0%。可见PCDH8启动子甲基化检测具有极高的特异性[6]。为进步了解PCDH8启动子甲基化可检测的范围，本实验进一步针对前列腺癌患者血清中PCDH8基因启动子甲基化状态进行了深入的研究。在纳入本实验的30例前列腺癌患者中，共有12例患者血清中检测到PCDH8基因启动子甲基化；相反，而30例前列腺增生患者血清中无一例检出，本实验结果显示血清中PCDH8基因甲基化检测诊断前列腺癌的特异性为100%，敏感性只有40%。同时实验数据表明前列腺癌患者血清中发现PCDH8基因启动子甲基化率为40%，相对于前列腺癌组织样本进行的PCDH8启动子甲基化研究分析所得的60%的阳性率有一定差距，这种现象可能与组织释放至血液循环的DNA的量较少有关。当进行PCR扩增时，作为模板的DNA如果含量不足或者浓度太低，会影响血清中全部的PCDH基因进行完整分析，这一系列原因都可能引起MSP检测灵敏度受限。进一步将本实验中30例前列腺癌患者的临床资料进行统计学分析，发现阳性组与阴性组患者的Gleason评分和临床分期差异较大，且具有统计学意义，而在年龄、PSA、淋巴转移等指标之间无统计学意义。推测这种现象可能是Gleason评分较高，病理分期较高的前列腺癌患者自身的肿瘤细胞恶性程度较高、分化差、凋亡速度比较快，从而导致肿瘤细胞随血液进入血循环的总量增加有关，故释放至循环血液中的DNA量较多。随着释放入血液中的DNA量增加，较高程度基因的甲基化容易被检测发现。而病人的年龄、PSA和淋巴转移并没有影响血液中PCDH启动子甲基化率发生改变。

采用血清标本检测抑癌基因PCDH启动子甲基化的情况，相对于传统的PSA检测及前列腺穿刺活检，具有便捷性和极高的特异性，并且检测手段更加安全，同时相对减轻患者的痛苦。但相比传统的蛋白水平检测(如PSA、EPCA等)，其敏感性较低，目前不能作为前列腺癌早期诊断和预后判断的独立因素。这可能是由于技术上的不足，造成的血清样本基因提取和修饰过程中造成的大量DNA丢失有关。近几年相关的研究已经显示，同时联合检测多个不同信号通路上的抑癌基因甲基化可以提高肿瘤检出的敏感性。随着以后对基因和细胞工程研究的深入和技术上的提高，我们希望会找到更好的提高检测敏感度的方法，为前列腺癌的早期诊断和评估预后提供更多的探索。

参考文献：

[1]He D,Zeng Q,Ren G,et al.protocadherin8 is a functional tumor suppressor frequently inactivated by promoter methylation in nasopharyngeal carcinoma[J].Eur J Cancer Prev, 2012,21(6):569-575

[2]周永根.DNA甲基化与前列腺癌[J].中华男科学，2007，13(12):1108-1112

[3]Wen-Bin Niu ，Shi-Liang Gui，Ying-Li Lin,et al. Promoter Methylation of Protocadherin8 is an Independent Prognostic Factor for Biochemical Recurrence of Early-Stage Prostate Cancer[J].Med Sci Mor,2014,20

[4]韩旭，罗振国，吴旭鹏，等.探讨血清EPCA-2与FPSA/TPSA值在前列腺癌诊断的关系[J].黑龙江医药科学，2014，37(4)：7-8

[5]齐文天，牛文斌.PCDH8基因启动子在前列腺癌组织及细胞中的甲基化测定及临床意义[J].黑龙江医药科学，2017，40(2):52-55

[6]Macher H,Egea-Guerrero JJ,Revuelto-ReyJ,et al.Role of early cell-free DNA levels decrease as a predictive marker of fatal outcome after severe traumatic brain injury[J].Clin Chim Acta,2012,414(12):12-17