苦参素(matrine) 是一种白色结晶单体粉末，可以从豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的干燥根中提取分离制得[9]。MMP-2的表达与肿瘤转移及侵袭程度密切相关，是肿瘤恶性进展的标志[1,2]。已有文献报道证实苦参素能降低基质金属蛋白酶MMP-2的表达，其已经在临床中应用于肿瘤放疗、化疗的辅助治疗[3]，但是目前还没有实验证明苦参素能抑制MMP-2活性的表达，提高牙本质耐脱矿能力。因此本课题通过检测苦参素对脱矿牙本质基质的影响，验证其抑制牙本质中MMP-2的活性，提高牙本质耐脱矿能力，从而保护牙本质基质。

1　 材料与方法1.1 　材料与设备

苦参素(99%)，氯己定，MMP-2活性比色法定量检测试剂盒(上海杰美基因生物科技有限公司)，牙托粉，牙托水，慢速切割机，液氮罐，移液枪，37℃恒温箱，低温超速离心机，酶标仪，超声波震荡仪，指甲油，乙酸，磷酸二氢钾，HEPES，pH试纸，试管，滤纸，罗丹明。

为解决电加热启停带来的温湿度惯性，SCR电加热初始以30%的热量输出。当室内环境制热量需求变化时，根据PID控制算法，SCR可控硅电加热无级调节输出精确的加热量。

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1.2　 实验溶液及牙本质片的制备

以去离子水为溶剂，配制苦参素母液8mmol/L及0.2%氯己定。牙本质试件的制备：取15颗新鲜离体牙自凝包埋后垂直牙长轴，用慢速切割机，切割成(200±20)μm的牙薄片，共30片，然后用高速手机将牙薄片四周的牙釉质磨除，放生理盐水中，-20℃冻存备用。另取15颗离体牙，按照上述方法切成厚度为3mm的牙本质块，同样用高速手机磨除周围牙釉质，放生理盐水中，-20℃冻存，使用时于4℃解冻。将牙本质试件待处理面用碳化硅砂纸600、800、1200、1500、2000目打磨抛光，然后用超声波对试件表面进行清洗，清洗干净后在试件表面涂上指甲油，待处理面中间部分不涂。

1.3.3　牙本质试件脱矿程度

1.3　实验方法

颅脑损伤是由暴力直接或间接作用在头部所致的一种颅脑组织损伤，患者伤后昏迷超过6小时或再次昏迷则为重型颅脑损伤，通常伤及中枢神经系统，在临床上具有较高的致残率和病死率[1]。临床上治疗重型颅脑损伤患者的常规方法是颞顶骨瓣开颅术，可以有效清除患者的脑内血肿，但由于受到骨窗限制，存在降低颅内压不够彻底、患者预后较差等问题[2]。标准大骨瓣减压术具有快速降低颅内压、彻底清除血肿和坏死脑组织等优势，近年来被广泛应用于临床且取得良好效果[3-4]。本研究将探讨标准大骨瓣减压术治疗重型颅脑损伤患者的临床效果，现将结果报道如下：

实验数据表明浓度为40、60、80、100μmol/L苦参素对MMP-2有明显的抑制作用，与阴性对照组对比差异有统计学意义(P<0.05)在60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L时与阳性对照组间差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

将15个牙本质试件随机分成3组(n=5)，放入不同溶液中处理，进行pH循环。分组好的试件分别放入5mL DDW，0.2%氯己定，60μmol/L的苦参素中浸泡10min后用去离子水冲洗1min，滤纸吸干水分后分别放入含有5mL的酸性脱矿液(50mmol/L乙酸，1.5mmol/L磷酸二氢钾，pH4.5)的试管中脱矿1h，再用去离子水冲洗1min，滤纸吸干水分再放入5mL中性缓冲液(20mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸HEPES，1.5mmol/L磷酸二氢钾，pH7.0)中5min。pH循环每日2次，循环10d，不进行循环的时间将试件放入中性缓冲液，置于37℃恒温箱中保存，所有液体现配现用。pH循环老化完成后将牙本质试件取出，然后将各组牙本质试件避光浸泡于0.1%罗丹明B溶液染色1h，染色完成后用去离子水避光浸泡洗脱30min。在激发波长为529nm下用激光共聚焦显微镜观察各试件牙本质染色程度，计算出每组试件的平均脱矿深度。

按照试剂盒说明书指示，移液枪移取79μL缓冲液，10μL反应液，1μL底物液及30μL基质金属蛋白酶提取液到96孔板中，再将5μL去离子水，0.2%氯己定，10,20,40,60,80,100μmol/L苦参素加入到对应孔板中，轻晃96孔板，放入酶标仪中，在412nm波长下，记录第0分钟和第15分钟读数，根据试剂盒给出的公式，计算待测物的酶活性抑制率。

本研究利用统计分析软件对308份问卷进行信度分析，由表3所示，整体问卷的克朗巴哈系数为0.708，8个潜在变量的克朗巴哈系数均大于0.6，说明获取的问卷数据可靠，达到信度要求。

1.3.2　基质金属蛋白酶MMP-2抑制率

1.4　统计学方法

a为去离子水组,b为0.2%氯己定组,c为60μmol/L苦参素组，红色区域即为脱矿部分

1.3.1　基质金属蛋白酶的提取

2　结果

2.1　各组药物对MMP-2的酶活性抑制率

将30个牙本质薄片放入冻存管中置于液氮罐中1h，取出后在研钵中快速研磨成粉。将磨得的牙本质粉称取1g，放入试管中，加入10mL 10%磷酸溶液，4℃冰箱脱矿6h，在4℃离心机中以3000r/min的速度离心2min，弃上清，加5mL，100mmol/L Tris-Hcl溶液，离心2min，弃上清，重复3次，向离心管中加入5mL十二烷基硫酸钠，以12000r/min的速度离心20min，取上清液。

 

表1　各组药物对MMP-2的酶活性抑制率

  

组别 样本量 酶活性抑制率 A组 5 25.05±0.23 B组 5 32.37±0.36 C组 5 41.42±1.106 D组 5 83.18±0.626 E组 5 82.49±0.666 F组 5 82.02±0.566 G组 5 81.85±0.576

注：A,B,C,D,E,F,G组分别为10μmol/L苦参素、20μmol/L苦参素、40μmol/L苦参素、60μmol/L苦参素、80μmol/L苦参素、100μmol/L苦参素，0.2%氯己定

  

图1　各组试件经pH循环后的CLSM的3D脱矿图像(×10)

采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，数据用表示，对实验数据进行单因素方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2.2　苦参素对脱矿牙本质的影响

激光共聚焦显微镜3D图像见图1。60μmol/L苦参素的染色深度明显低于DDW组，与氯己定组无明显差异。各组样本脱矿深度见表2。苦参素脱矿深度与阴性对照组对比差异有统计学意义(P<0.05)，但与阳性对照组比，差异无统计学意义(P>0.05)。

 

表2　各组样本脱矿深度

  

组别 样本量 平均脱矿深度 去离子水 5 622.00±1.681 氯己定 5 214.14±1.698 苦参素 5 185.74±1.242

3　讨论

在龋病的发展进程中，由于细菌分解底物产酸可致牙本质局部pH值降低，此时基质金属蛋白酶MMP -2的分泌会增多,发挥其水解作用，导致基质被降解的速度快于基质合成的速度,使得牙体硬组织被破坏[7]。一些学者就提出在裸露牙本质表面使用基质金属蛋白酶的抑制剂，保护牙本质胶原基质，从而起到保护牙本质结构的作用。经M.A.R. Buzalaf[8]研究发现0.2%氯己定可以表现出抗牙本质脱矿作用。但是氯己定存在可以使牙齿着色的缺点，所以现研究苦参素是否也能起到抗牙本质脱矿的作用。实验中所用的pH循环模型已被众多实验[4,5]所证实可以模拟龋病的形成，用于龋病防治跟再矿化的研究。

1.3 观察指标 术中记录前列腺剜除时间及术中并发症出现情况。术后记录前列腺剜除体积、膀胱持续冲洗时间、导尿管留置时间、术后住院时间、血常规及相关并发症等情况。术后4周复测IPSS、QOL及Qmax、PVR，并询问尿控等情况，评估手术疗效。术后压力性尿失禁诊断标准：术后拔除尿管24 h后，患者站立位时出现尿液从尿道口滴出现象或日常生活中每日须使用至少1块尿垫。

本实验实验结果显示：苦参素在10～60μmol/L时，药物浓度与酶活性抑制率成正比，在60μmol/L,80μmol/L,100μmol/L时与0.2%氯己定组无显著差异，验证了苦参素对MMPs确实有的抑制作用且作用效果与氯己定无明显差异。在牙齿耐脱矿实验中，实验组选用60μmol/L苦参素，阳性对照组选用0.2%氯己定，阴性对照组选用去离子水进行耐脱矿能力的实验，以验证苦参素对牙本质的耐脱矿能力的影响。各组试件经过pH循环10d后,牙本质表面都有不同程度的脱矿，通过罗丹明B染料的染色，将其强荧光性可以渗透到疏松间隙中，再通过激光共聚焦显微镜[6]观测牙本质试件中的荧光强度，判断牙本质脱矿深度，荧光带越宽表明脱矿越严重。实验结果显示苦参素组的脱矿深度小于阴性对照组，且与阳性对照组并无显著性差异，由此可以说明，苦参素对MMP-2有抑制作用，也可以影响牙本质的耐脱矿能力。可以考虑将苦参素应用于龋齿的防治工作中。

参考文献：

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[2]王烨，刘惠涛，许国忠，卓越.MMP-2和TIMP-2胃癌组织中的表达特点及临床意义[J].黑龙江医药科学 ,2009,32(5):72-73

[3]王才，王晓莉.苦参素对三维适形放射治疗中晚期肺癌疗效及血清 VEGF, MMP-9水平的影响[J].青海医学院学报，2016,37(3):185-188

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[5] Ling Zou, LingLin Zhang, JiYao Li, et al.Effect of Galla chinensis extract and chemical fractions on demineralization of bovine enamel in vitro[J]. Journal of dentistry,2008,36:999-1004

[6]徐帅. 表没食子儿茶素没食子酸酯保护脱矿牙本质基质的相关作用研究[D].第四军医大学,2014

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[9]陆振东，张戈.苦参素对胃癌细胞株MKN - 54产生金属基质蛋白酶的抑制作用[J].药学实践杂志，2006,24(3)：147-149