前列腺癌是常见的男性恶性肿瘤之一，近些年来随着人口老龄化的加速，中国前列腺癌的患病率及病死率呈上升趋势，已高居男性泌尿系统恶性肿瘤的第二位[1]。前列腺癌的发生发展过程中离不开免疫系统和肿瘤细胞微环境的变化和相互作用。肿瘤微环境包含多种细胞，大致分为恶性和非恶性两类，而非恶性细胞群包括间质细胞，脉管扩张系统和白细胞[2,3]。巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，对病原体及适应性免疫应答、炎症反应、组织稳态和癌症发展起着重要作用[4]。巨噬细胞对寄生虫感染，组织重塑，血管生成和肿瘤发展中具有重要作用[5]。Mysm1是一种金属蛋白酶，由于其在先天免疫调节中的特殊性收到重视，目前在国内外对Mysm1-/-巨噬细胞对前列腺癌细胞的影响仍未知。本研究中通过研究Mysm1-/-巨噬细胞在前列腺癌进展中的作用及机制，为前列腺癌的研究提供一定的理论基础。

1　材料方法

1.1　实验动物

C57BL/6小鼠为背景的Mysm1敲除小鼠由南加州大学Si-Yi Chen教授惠赠，饲养于军事医学科学院动物中心，由杂合小鼠繁殖，子代进行基因型鉴定，将野生型(WT)和Mysm1敲除型(KO)小鼠周龄性别配对试验，6～8周龄，雌雄不限。

田有园不知道，就在昨天，陈留打电话过来了，他在电话里东扯西拉，絮絮说着他们从前的好，从前的快乐时光。易非知道，他想重修旧好，可易非没有做声，不等自己的耳朵起茧子，她就挂了电话。

2005年2月12日，经联合国教科文组织批准，雁荡山成为全球第一个以中生代火山岩地质地貌景观为主题的世界地质公园。公园总面积294.6平方千米，由三个园区组成：主园区雁荡山，位于乐清市境内，为中生代火山岩地质地貌景观；东园区为温岭市的长屿硐天古采石遗址和方山流纹岩台地地貌景观；西园区为永嘉县楠溪江河流地貌景观。

1.2　主要试剂

人前列腺癌细胞株PC3由佳木斯大学实验室传代培养。培养基RPMI-1640为Sigma公司产品，小牛血清为Gibico公司产品。巨噬细胞集落刺激因子(M-csf)、γ-干扰素(IFN-γ)、白介素-4(IL-4)由eBioscience购，胰蛋白酶Amresco公司购得，脂多糖(LPS)由Sigma公司购，PE anti-mouse F4/80、FITC anti-mouse CD11b和FITC anti-mouse Annexin eBioscience公司购，三氯甲烷、异丙醇、无水乙醇有国药集团购，TRI Reagent由Sigma公司购，反转录试剂盒、qPCR试剂盒由Toyobo公司提供，qPCR引物由上海生工生物生产。

1.3　方法

分离后的巨噬细胞在诱导7d后，用胰酶消化，离心后弃上清，用1mLPBS洗一遍弃上清，用150μL的PBS重悬，然后每个样品中加入1μL的F4/80和CD11b抗体，放入4℃冰箱避光30min，然后用1mL的PBS洗一遍，用1%的多聚甲醛固定，放入4℃冰箱保存。

1.3.5　划痕实验

1.3.2　流式细胞术

1.3.1　骨髓来源巨噬细胞的分离及培养及极化

用TRIzol 试剂提取细胞总RNA，然后以此总RNA 为模板，Oligo( dT) 为引物，将mRNA 逆转录为cDNA。再以cDNA 为模板，PCR 扩增Mysm、iNOS、IL-1β和IL-13基因，iNOS基因上游引物：5’-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3 ’， 下游引物为5’-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG’-3’ ;IL-1β基因上游引物：5’-cattagacaactgcactacagg-3’，下游引物为5’gttctccttgtacaaagctcat-3 ’; IL-13基因上游引物：5’- tggagacctggaatcagaca-3’，下游引物为5’-gggttcactggcacCtttga-3’ ;Mysm1基因上游引物：5’- AGG CAG GAC TCA AGT GGA AA-3’，下游引物为5’-CAG GAA TCG CTT GCT TTT CT -3 ’;内参GAPDH基因上游引物：5’-ACAATGAATACGGCTACAG -3’，下游引物为5’-GTCCAGGGTTTCTTACTC -3 ’;PCR 反应总体积为20μL，基因扩增参数为: 94℃预变性3min，94℃变性30s、55℃退火20s、72℃延伸30s，40个循环，72℃延伸5 min。

1.3.3　RT-PCR

1.3.4　细胞凋亡的检测

习近平心系教育。党的十八大以来，习近平站在战略和全局的高度，提出了一系列关于教育改革及发展的重要论断，强调“建设教育强国是中华民族伟大复兴的基础工程，必须把教育事业放在优先位置，深化教育改革，加快教育现代化，办好人民满意的教育。”[1]以习近平为核心的党中央将教育放在优先发展的战略地位，系统地回答了为什么办教育、办什么样的教育、怎样办教育等重大命题，进一步丰富和发展了中国特色教育理论体系，对推动我国教育事业的改革与发展具有重要的指导意义。

用marke笔每隔在6孔板背后0.5～1cm划横线，然后再垂直着划2条，用细胞浓度为3×105个/mL对数生长期的前列腺癌细胞，每孔2mL种入六孔板，24h后，孔中细胞密度大概达到90070，用200贝枪头垂直所划的横线，过圆心划过一条直线，用HBSS洗去划下的细胞;分别向第1～4孔加入M0, M1, M2, TAM的条件培养基lmL，各孔再补加1mL无FBS的RPMI1640培养液，第5孔加入2mL的无FBS的RPMI1640培养液，并拍照，记录为Oh24h后，再次于显微镜下观察拍照。

分离小鼠后腿的股骨和胫骨，用无菌PBS冲洗骨髓腔至白色。收集骨髓细胞，用10mL PBS洗一次，加入10mL红细胞裂解液悬浮细胞，避光4℃3～5min，离心，弃上清，PBS洗一次，RPMI1640培养基+10%胎牛血清重悬细胞，加入20ng/mL M-CSF 培养7d,隔天换新鲜的培养基。流式检测分化效率，一般7d后CDllb、F4/80双阳的细胞比例超过95%。LPS (100ng/mL)和IFN-y (20ng/mL)刺激过夜极化为M1型，IL-4(20ng/ml)和10%FBS的RPMI1640刺激过夜后极化为M2型。

取对数生长期PC-3细胞，制备细胞悬液，调细胞浓度为5×104个/mL;将细胞悬液加入96孔板中，每孔100μL，放入37℃孵育1h,细胞培养箱中培养18h;取出96孔板，吸出上清液，分别加入巨噬细胞的条件培养基100μL/孔，同时设置阴性对照孔和调零孔，各组设_5复孔，放入细胞培养箱中分别培养24h, 48h和72h;取出96孔板，每孔加入20μL的MTT，放入细胞培养箱中继续培养，4h后小心轻柔地吸去孔内培养液，每孔加入DMSO150μL，低速振荡10min，用酶标仪在490nm波长处测定光吸收值。抑制率=1-(给药组OD值均值一空白组OD值均值)/(阴性组OD值均值一空白组OD值均值)

用对数生长期的前列腺癌细胞，调细胞浓度为4×104个/mL，种24孔板，放在孵箱中过夜，弃上清然后加入条件培养基，各设3个副孔，放入细胞培养箱中分别培养24h。用胰酶消化，收集细胞并用PBS洗2遍，然后向1xBuffer中加入Annexin V-FITC和PI，常温避光30min，入FITC和PI;用流式细胞仪上机检测。

第五条 危改房选址应选择安全地段。对于可能发生滑坡、崩塌、地陷、地裂、泥石流、洪水、山洪等灾害的地段应采取技术措施处理。

1.3.6　MTT检测

设计意图 通过练习帮助学生进一步理解三角函数的概念，并能运用概念灵活求直角三角形中锐角的函数值，使学生对知识的理解螺旋上升，形成能力，达到了较高要求.

1.4　统计学方法

采用SPSS17.0软件进行统计学数据分析，其中以均数±标准差来表示本实验结果的各项数据，计数资料用χ2检验进行分析，当P<0.05为差异具有统计学意义。

2　结果

2.1　Mysm1-/-巨噬细胞诱导分化后的特性

FCM检测了诱导5d后培养体系中CDllb和F4/80阳性细胞的比例，结果显示Mysm1-/-的骨髓细胞与野生型基本都分化为了巨噬细胞(图1A)。通过定量RT-PCR证实了Mysm1-/- 的BMC中Mysm1的缺陷表达(图1B)。RT-PCR检测了在LPS刺激下的Mysm1-/-和WT巨噬细胞的细胞因子产生。数据显示在Mysm1-/-巨噬细胞中iNOS和IL-1βmRNA的表达量更高(P<0.05)，然而IL-13mRNA的表达量两者无明显差距(图1C)

 

图1A　Mysm1-/-的骨髓细胞与野生型；图1B　Mysm1-/- 的BMC中Mysm1的缺陷表达；图1C　Mysm1-/-巨噬细胞中iNOS，IL-1β和IL-13 mRNA的表达量

 

图2A　24h后与M2组相比对PC-3细胞的迁移；图2B　柱状图显示Mysm1-/-的M1型巨噬细胞对前列腺癌细胞迁移；图2C　Mysm1-/-M1，M2型细胞计数

2.2　Mysm1-/-巨噬细胞抑制前列腺癌的生长

诱导后的Mysm1-/-和WT的巨噬细胞的上清液与前列腺癌细胞共培养， Mysm1-/-巨噬细胞的上清液在24h后与M2组相比对PC-3细胞的迁移有抑制作用(图2A)。通过统计做出的柱状图显示，Mysm1-/-的M1型巨噬细胞的上清液对前列腺癌细胞迁移运动的抑制作用远比WT的M1型巨噬细胞更加明显(P<0.05)，而M2型的无明显差异(图2B)。通过细胞计数发现Mysm1-/-M1较WT型的抑制更明显，但M2亚型分别在促进和抑制作用无明显差异(图2C)。

3　讨论

随着前列腺癌细胞组学研究的不断深入，肿瘤细胞因子的表达与调控的机制成为研究的热点区域之一。表观遗传学是重要的调控机制，组蛋白修饰是重要的表观遗传方式，主要通过改变染色质结构来激活或抑制基因的转录，然后调节免疫细胞的发育和功能[6]。Mysm1是一种金属蛋白酶，被报道用于靶向单泛素化组蛋白H2A，这是表观遗传转录抑制的标志[7]。除了在细胞核中的作用，Mysm1是先天免疫的关键负调节因子，Mysm1的缺陷将促进过高炎性反应会引起休克[8]。这提示Mysm1-/-巨噬细胞可能向着促进炎症的方向发展，这与M1型巨噬细胞及其相似，那么它对肿瘤细胞的影响可能是抑制性的。

将上述接枝聚合物与同一种SAN树脂共混，保持共混物中橡胶质量分数都为20%，分析共混物的冲击强度，如图3所示。随着接枝率增加，橡胶粒子接枝层厚度逐渐增加，接枝率在30%～60%范围内共混物冲击强度出现峰值。

为了研究Mysm1-/-巨噬细胞炎性因子表达的特点，我们首先确定了诱导分化5d后的是巨噬细胞，用FCM检测了诱导5d后培养体系中CDllb和F4/80阳性细胞的比例，我们发现Mysm1-/-的骨髓细胞与野生型基本都分化为了巨噬细胞。通过定量RT-PCR证实Mysm1-/- 的BMC中Mysm1的缺陷表达。为了研究Mysm1-/-巨噬细胞在诱导分化后的炎性因子表达的特点，我们RT-PCR检测了在LPS刺激下的Mysm1-/-和WT巨噬细胞的细胞因子产生。数据显示在Mysm1-/-巨噬细胞中iNOS和IL-1βmRNA的表达量更高，然而IL-13mRNA的表达量两者无明显差距。前列腺癌细胞的迁移能力对癌细胞的扩散至关重要。本实验已经证实到Mysm1影响巨噬细胞中炎性细胞因子的表达。接下来我们用诱导后的Mysm1-/-和WT的巨噬细胞的上清液与前列腺癌细胞共培养，从实验结果的细胞图中可以看出Mysm1-/-巨噬细胞的上清液在对前列腺癌细胞株作用24h后与M2组相比对PC-3细胞的迁移有抑制作用。通过统计做出的柱状图显示，Mysm1-/-的M1型巨噬细胞的上清液对前列腺癌细胞迁移运动的抑制作用远比WT的M1型巨噬细胞更加明显，而M2型的无明显差异。通过细胞计数发现Mysm1-/-M1较WT型的抑制更明显，但M2亚型分别在促进和抑制作用无明显差异。接下来我们用FCM检测细胞周期和凋亡，周期中显示Mysm1-/-M1抑制前列腺癌细胞的增殖和凋亡无明显差异，M2两者都无明显差距。MTT的检测结果显示Mysm1-/- M1型巨噬细胞显著抑制前列腺癌细胞的细胞活力。而M2无明显差异。我们的实验中发现Mysm1对巨噬细胞的诱导分化无明显的影响， RT-PCR发现Mysm1的缺失使iNOS和IL-1β表达升高，这说明Mysm1的缺失使巨噬细胞向着发挥抗炎的方向发展。进一步的MTT实验表明前列腺癌PC-3细胞受阻于细胞周期的G1期，同时划痕实验证实PC-3细胞的迁移速度收到明显的影响。由此可见Mysm1-/-巨噬细胞对PC-3细胞具有抑制作用，并且抑制作用是通过使前列腺癌细胞的生长周期阻滞在非常关键的G1期实现的，其抑制了前列腺癌细胞的迁移和增殖能力。

本实验证实：巨噬细胞是免疫系统的重要组成部分，作用于多样化的免疫反应，组织稳态和癌症发展。巨噬细胞分为经典活化(M1)的巨噬细胞和替代性活化的巨噬细胞(M2)[9]，M1型巨噬细胞具有抗肿瘤活性，而M2巨噬细胞则促进肿瘤细胞的侵袭和转移。Mysm1对前列腺癌细胞有重要的调节作用，这一作用是通过巨噬细胞得到体现的，Mysm1-/-巨噬细胞可以显著抑制人前列腺癌PC-3 细胞的增殖，影响细胞周期。

参考文献:

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[2]Badawi MA,Abouelfadl DM,El-Sharkawy SL,et al. Tumor-Associated Macrophage (TAM) and Angiogenesis in Human Colon Carcinoma[J]. Open Access Maced J Med Sci,2015,3(2):209-214

[3]Quatromoni JG, Eruslanov E. Tumor-associated macrophages: function. Phenotype, and link to prognosis in human lung cancer[J]. Am J Transl Res,2012,4(4):376-389

[4]Martinez FO, Helming L, Gordon S. Alternative activation of macrophages: an immunologic functional perspective. Annu Rev Immunol[J]. Annu Rev Immunol,2009,27:451-483

[5]Wynn TA, Chawla A, Pollard JW. Macrophage biology in development，homeostasis and disease[J]. Nature,2013,496(7446):445-455

[6]Bermick JR, Lambrecht NJ, denDekker AD,et al. Neonatal monocytes exhibit a unique histone modification landscape[J]. Clin Epigenetics,2016,20(8):99

[7]Cui K, Zang C, Roh TY, et al. Chromatin signatures in multipotent human hematopoietic stem cells indicate the fate of bivalent genes during differentiation[J]. Cell Stem Cell,2009,4(1):80-93

[8]Zhu P, Zhou W, Wang J, et al. A histone H2A deubiquitinase complex coordinating histone acetylation and H1 dissociation in transcriptional regulation[J]. Mol Cell,2007,27(4):609-621

[9]L Orntoft TF,Moestrup SK,Mller HJ. Tumor-promoting macrophages induce the expression of the macrophage-specific receptor CD163 in malignant cells[J]. International Journal of Cancer,2012,131(10):2320-2331