涎腺腺样囊性癌 （salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是口腔颌面部最为常见的恶性肿瘤，由于该肿瘤侵袭性极强，易浸润神经和血管，并且远处转移率极高，多数患者预后不佳[1]，严重影响患者生存质量。目前，SACC发生机制尚未完全清楚，临床上以手术切除为主要治疗手段，但患者术后10年局部复发率超过50%，远处转移率高达40%[2]。因此，积极探讨SACC发生相关机制以指导治疗，对改善患者预后具有重要意义。Rho蛋白作为一种功能性蛋白，具有三磷酸鸟苷酶活性，在细胞骨架活动、细胞变性、细胞黏附、增殖、迁移、凋亡中发挥分子开关功能，同时是维持细胞间连接完整性的关键性调节因子 [3]。近年来研究发现[4]，RhoA及其下游效应蛋白参与了细胞恶性转化、异常增殖、抗凋亡及侵袭、转移过程，与肿瘤发生、进展密切相关。目前，RhoA蛋白在SACC发生及进展中的作用鲜有报道。本研究拟利用小分子RNA干扰（siRNA）技术，特异性沉默SACC细胞株ACC-2细胞中RhoA基因，观察其对ACC-2细胞增殖、侵袭能力的影响，以期为SACC机制研究提供基础资料。

1 资料和方法

1.1 主要试剂和设备

ACC-2细胞株购自中国科学院上海细胞所，胰蛋白酶、DMEM培养液购自美国Gibco公司，Trizol总RNA提取试剂盒、胎牛血清、Lipofectamine2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司。逆转录及PCR试剂盒购自大连宝生物公司，RhoA及内参引物均由上海生工生物公司设计合成。siRNA-RhoA及阴性对照序列均由上海吉玛公司设计合成。四甲基偶氮唑盐（MTT）细胞增殖试剂盒、二甲基亚砜（DMSO）购自美国Sigma公司，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自北京沃比森科技有限公司。Transwell小室购自美国Corning公司，小鼠抗RohA单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，Matrigel基胶、流式细胞仪购自美国BD公司，凝胶电泳分析系统购自美国伯乐公司。

低低聚集区主要有：沙河口区西北部一部分住宅。甘井子区周水子国际机场、大连北站、营城西路、鹤大高速公路、虹港路和迎客路附近、华北路和华东路周围、振兴路、关厢路以及甘井子线、长大线沿线。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组转染处理 用含10%胎牛血清的DMEM培养液恒温培养ACC-2细胞，培养条件：5%CO2、37℃，取对数生长期细胞，胰酶消化后接种于6孔板，待细胞丰度达到80%左右时，利用Lipofectamine2000转染试剂盒进行转染。根据转染物不同对细胞进行分组。siRNA-RhoA组：转染Rho基因siRNA序列，上游5’-GACAUGCUUGCUCAUAGUCTT-3’， 下 游 3’-TTCUGUACGAACGAGUAUCAG-5’。siRNA-对照序列组： 上游 5’-CAGUCAGGAGGAUCCAAAGTG-3’，下游 3’-TTGUCAGUCCUCCUAGGUUUC-5’。空白对照组：不作任何处理。各组细胞转染后继续培养，完成后续实验。

1.2.2 各组细胞中Rho基因表达 利用实时荧光定量PCR技术检测。取各组培养48 h的细胞，加入细胞裂解液，利用Trizol总RNA提取试剂盒提取细胞中总RNA，用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为模板单链cDNA，以cDNA为模板行PCR扩增。引物序列如下。RhoA序列：上游5’-GATGGAGCTTGTGGTAAG-3’， 下 游 5’-TCAGTGTCTGGGTAGGAG-3’；β-actin 序列：上游 5’-GCAAGTTCAACGGCACAG-3’，下游 5’-GCCAGTAGACTCCACGACAT-3’。 PCR反应条件：95℃ 5 min， 随后，95℃ 15 s，60℃ 45 s，72℃30 s，连续进行40次循环，每个样品均设3个平行反应复孔。用2-△△C法获得各组细胞中Rho基因相对表达量。

此次研究抽取的胃溃疡患者76例,收治时间为2016年3月至2017年3月。将所有患者依据治疗方法的差异性均分研究和参照两组,患者各38例。研究组中,男性患者、女性患者分别为21例、17例,最大年龄为73岁,最小年龄为21岁,中位年龄统计后为(53.48士7.36)岁。参照组中,男性患者、女性患者分别为25例、13例,最大年龄为74岁,最小年龄为22岁,中位年龄统计后为(54.19士7.40)岁。在统计软件SPSS19.0中将研究组和参照组胃溃疡患者的基本信息输入,组间差异呈P>0.05,则表示数据结果不具有统计学意义。

与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-RhoA组细胞中RohA mRNA和蛋白相对表达量均降低，差异均有统计学意义（P<0.05），见表1，图 1。

1.2.5 各组细胞凋亡情况 取各组转染培养48 h细胞，胰酶消化后，1 000 g离心10 min，弃上清液，用预冷PBS液洗涤3次，用250 μL上样缓冲液重悬细胞，调整细胞浓度为2×105个/mL，将Annexin V-FITC 5 μL 加入各孔，避光下静置 20 min，将 5 μL 的 PI加入各孔，室温下避光反应10 min，再加入400 μL上样缓冲液，30 min内上机检测。重复实验3次。

1.2.6 各组细胞迁移能力 Transwell法检测。取各组转染培养48 h细胞，将各组细胞用无血清DMEM培养液饥饿培养12 h，胰酶消化后，重悬细胞，调整细胞密度为 2×105个/mL。取 200 μL 细胞悬液接种于Transwell小室的上室，将含20%胎牛血清的培养液加入小室的下室，继续培养于含5%CO2的恒温培养箱中，24 h后取出，将多余的散落细胞去掉，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，PBS洗涤3次，用倒置显微镜观察，随机取10个高倍视野，计数穿膜细胞数。重复实验3次。

与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-RhoA组迁移细胞数和侵袭细胞数均减少，差异均有统计学意义（P<0.05），见表3、图4和图5。

1.3 统计学分析

与siRNA-对照序列组和空白对照组比较，siRNA-RhoA组细胞在 24、48、72和 96 h时吸光度A值均降低，差异有统计学意义（P<0.05），见图2。

2 结果

2.1 各组细胞中RohA基因和蛋白表达比较

1.2.4 各组细胞增殖能力 MTT法检测。取各组转染后呈对数生长期细胞，继续培养于含5%CO2的恒温培养箱中，分别于12、24、48、72和96 h时，向各孔加入MTT液，继续培养4 h，弃上清液，加入DMSO液，充分振荡15 min，待结晶物完全溶解，利用全自动酶标仪检测各孔490 nm处吸光度A值。

2.2 各组细胞增殖能力比较

利用SPSS 17.0统计分析对数据进行整理和分析，计量资料采用均数±标准差（±s ）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，P<0.05差异有统计学意义。

2.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡情况

 

表1 各组细胞中RohA基因和蛋白表达比较（±s ）Table 1 Comparison on expressions of RohA gene and proteinin each group(±s)

  

注：a表示与空白对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义；b表示与siRNA-对照序列组比较，P<0.05，差异有统计学意义。

 

组别 RohA mRNA RohA蛋白siRNA-RhoA 组 1.20±0.17ab 0.34±0.07ab siRNA-对照序列组 1.92±0.14 0.73±0.08空白对照组 1.84±0.12 0.72±0.10 F 73.724 68.594 P 0.000 0.000

  

图1 各组细胞中RohA基因和蛋白表达A：siRNA-RhoA 组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组Figue 1 Expressions of RohA gene and protein in each groupA：siRNA-RhoA group；B：siRNA-control sequence group；C：blank control group

  

图2 MTT法检测各组细胞增殖情况Figure 2 Cell proliferation in each group was detected by MTT assay

当＞1时，贸易互补性强，值越大，说明贸易互补性越强；当≤1时，贸易互补性弱，越小，说明贸易互补性越弱。

siRNA-RhoA组细胞凋亡率均高于siRNA-对照序列组和空白对照组，差异有统计学意义 （P=0.001），见表 2 和图 3。

1.2.3 各组细胞中RohA蛋白表达 采用Western blot法检测。各转染组培养48 h后，胰酶消化，加入细胞裂解液，用总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，用BCA蛋白检测试剂盒检测总蛋白纯度。取40 μg总蛋白，加热使总蛋白变性后，行SDS-PAGE电泳分离，电转移至尼龙膜上，室温下用脱脂奶粉封闭60 min。将一抗小鼠抗RohA单克隆抗体按1∶1 500稀释后加入，4℃过夜孵育，TBST洗膜3次，加入二抗，室温下培养60 min，TBST洗膜3次，加入ECL发光液避光反应20 min，拍照。利用Image J图像分析软件分析各组细胞中RohA蛋白相对表达量。

 

表2 各组细胞凋亡率比较（±s ）Figure 2 Comparison on the apoptosis rate in each group(±s)

  

组别 细胞凋亡率（%）siRNA-RhoA 组 16.2±3.6ab siRNA-对照序列组 8.8±1.1空白对照组 11.2±2.8 F 11.821 P 0.001

2.4 各组细胞迁移和侵袭能力比较

1.2.7 Transwell法检测各组细胞侵袭能力 将Matrigel胶平铺于Transwell小室上室，风干后备用。其余步骤同1.2.5。

  

图3 流式细胞检测各组细胞凋亡情况A：siRNA-RhoA 组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组Figure 3 Cell apoptosis was detected by flow cytometryA:siRNA-RhoA group;B:siRNA-control sequence group;C:Blank control group

  

图4 Transwell法检测各组细胞迁移能力（结晶紫，×400）A：siRNA-RhoA 组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组Figure 4 Transwell method was used to detect the migration of cells in each group （Crystal violet staining,×400）A：siRNA-RhoA group；B：siRNA-control sequence group；C：Blank control group

  

图5 Transwell法检测各组细胞侵袭能力（结晶紫，×400）A：siRNA-RhoA 组；B：siRNA-对照序列组；C：空白对照组Figure 5 Transwell method was used to detect the invasive of cells in each group （crystal violet staining,×400）A：siRNA-RhoA group；B：siRNA-control sequence group；C：Blank control group

 

表3 各组细胞中迁移细胞数和侵袭细胞数比较（±s ）Table 3 Comparison on the number of migrating cells and the number of invasive cells in each group(±s)

  

注：a表示与空白对照组比较，P<0.05，差异有统计学意义；b表示与siRNA-对照序列组比较，P<0.05，差异有统计学意义。

 

组别 迁移细胞数 侵袭细胞数siRNA-RhoA 组 71.6±5.2ab 87.9±5.8ab siRNA-对照序列组 106.7±7.8 127.5±7.3空白对照组 109.4±9.1 130.2±8.1 F 50.958 112.397 P 0.000 0.000

3 讨论

SACC作为好发于唾液腺的恶性肿瘤，发病较为隐匿，多数患者发现时已处于晚期，同时该病目前尚无特效的治疗手段，且放化疗治疗效果不佳，手术切除后高复发转移是导致患者死亡的主要因素[5]。有研究指出，强侵袭力、嗜神经性生长及远处转移是导致SACC患者预后较差的主要原因[6]。因此，积极探讨影响SACC细胞侵袭生长的相关基因有望为SACC基因治疗提供新的契机。RhoA作为Rho亚家族的一种异构体，是广泛存在于细胞内的一种中间信号分子，在细胞生长、增殖、细胞黏附运动及细胞骨架重组等过程中发挥重要作用[7]。近年来研究发现，RhoA 在结肠癌[8]、胃癌[9]、肝癌[10]等多种恶性肿瘤组织中呈高表达，且参与调控细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等环节[11]。严国鑫等[12]指出，RhoA基因参与了舌癌细胞增殖和生长，可望成为舌癌基因治疗的靶位。本研究进一步探讨RhoA基因在SACC发生及进展中的作用，结果显示：在利用siRNA技术沉默SACC细胞株ACC-2细胞中RhoA基因后，RhoA基因和蛋白表达均下调，提示细胞中RhoA基因被特异性抑制。

本研究MTT实验结果显示，RhoA基因沉默后，ACC-2细胞在24、48、72和96 h时吸光度A值均降低，说明特异性沉默RhoA基因可有效抑制ACC-2细胞增殖能力，提示RhoA基因可能参与了ACC-2细胞增殖过程。流式细胞术检测结果显示，在沉默RhoA基因后，细胞凋亡率明显增加，说明特异性抑制Rho基因表达可促进ACC-2细胞发生凋亡。严国鑫等[12]指出，Rho蛋白可通过调控Cyclin D1、p21和p27等细胞周期关键性蛋白，参与舌癌发生进展。我们推测，RhoA也可能通过调控ACC-2细胞周期而抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。本研究结果显示，在特异性沉默RhoA基因后，ACC-2迁移细胞数和侵袭细胞数均减少，说明在抑制RhoA基因表达后，ACC-2细胞迁移和侵袭能力被抑制，提示RhoA可能参与了ACC-2细胞迁移和侵袭过程。

（4）多数地质灾害治理往往注重其防灾功效，而治理工程与生态环境融合较差。特别是在风景名胜区、城镇和聚居区周边、交通沿线等可视区范围，混凝土的治理工程给人极不协调的视觉感受。

念蓉摁响门铃，里面没有动静。念蓉站在门口等了一会儿，里面仍然没有动静。念蓉长舒一口气，转身，往回走。她走出约十几米，身后传来“嘎吱”一声，回头，房间的木门被推开一隙，一个女人的半个身子从门缝里探出。女人眯着猫般的眼睛看看念蓉，脸上没有任何表情，然后，门被轻轻关上，念蓉被冻在那里。

综上所述，特异性沉默RohA基因表达可明显减弱ACC-2增殖能力，促进细胞发生凋亡，抑制细胞转移和侵袭能力，有望为SACC基因分子治疗提供新的靶位。

参考文献：

[1] Li Q,Huang P,Zheng C,et al.Prognostic significance of p53 immunohistochemical expression in adenoid cystic carcinoma of the salivary glands:a meta-analysis[J].Oncotarget,2017,8(17):29458-29473.

[2] Dantas AN,Morais EF,Macedo RA,et al.Clinicopathological characteristics and perineural invasion in adenoid cystic carcinoma:a systematic review[J].Braz J Otorhinolaryngol,2015,81(3):329-335.

[3] Otsu K,Harada H.Rho GTPases in ameloblast differentiation[J].Jpn Dent Sci Rev,2016,52(2):32-40.

[4] Hetmanski JH,Schwartz JM,Caswell PT.Modelling GTPase dynamics to understand RhoA-driven cancer cell invasion[J].Biochem Soc Trans,2016,44(6):1695-1700.

[5] Cai Q,Zhang R,Wu G,et al.Adenoid cystic carcinoma of submandibular salivary gland with late metastases to lung and choroid:a case report and literature review[J].J Oral Maxillofac Surg,2014,72(9):1744-1755.

[6] Wysocki PT,Izumchenko E,Meir J,et al.Adenoid cystic carcinoma:emerging role of translocations and gene fusions[J].Oncotarget,2016,7(40):66239-66254.

[7] Watzlawick R,Sena ES,Dirnagl U,et al.Effect and reporting bias of RhoA/ROCK-blockade intervention on locomotor recovery after spinal cord injury:a systematic review and meta-analysis[J].JAMA Neurol,2014,71(1):91-99.

[8] Jeong D,Park S,Kim H,et al.RhoA is associated with invasion and poor prognosis in colorectal cancer[J].Int J Oncol,2016,48(2):714-722.

[9] 廖山婴,刘超,王蓓蓓,等.RhoA/ROCK信号通路在胃癌中的表达及其与胃癌生物学行为的关系[J].胃肠病学和肝病学杂志,2017,26(3):251-255.

[10]胡威,董忠谊,吴德华.FAT10通过激活RhoA介导肝细胞性肝癌侵袭转移[J].中国肿瘤临床,2015,42(14):689-694.

[11]Timpson P,McGhee EJ,Morton JP,et al.Spatial regulation of RhoA activity during pancreatic cancer cell invasion driven by mutant p53[J].Cancer Res,2011,71(3):747-757.

[12]严国鑫,樊兵,邹荣海,等.沉默RohA基因对舌鳞状细胞癌细胞增殖的影响[J].华西口腔医学杂志,2016,34(6):620-625.