溴代阻燃剂(Brominated flame retardants，BFRs)，因具有优异的阻燃性能被广泛应用于建筑保温材料、纺织品、电子电器设备和交通工具中[1]。BFRs作为一种半挥发性有机物，易进入大气或附着于水体沉积物及空气悬浮颗粒等环境介质，近年来有较多文献报道BFRs及其代谢产物对生物体具有一定的毒性效应[2-5]。

甲状腺素运载蛋白(TTR)是一种同源四聚体蛋白，在生物体内主要由肝脏合成，在血液中主要运载甲状腺素(T4)和三碘甲腺原氨酸(T3)，还可与视黄醇(Vitamin A)结合蛋白形成蛋白质-蛋白质复合物，协助运载视黄醇。已有文献报道许多非内源性小分子可与TTR结合在甲状腺素位点上，包括天然产物、药物、环境污染物等[6-8]。本课题组前期研究也发现四溴双酚A(TBBPA)可与甲状腺素运载蛋白形成稳定的蛋白质复合物，TBBPA可在生物体内竞争性地结合到TTR蛋白上，从而干扰甲状腺素的运输和正常的生理功能产生毒性效应[9]。

非变性电喷雾质谱(Native ESI-MS)能够在接近生理条件下分析检测完整的生物大分子，保持生物大分子的结构和生物功能，近年来广泛应用于蛋白质非共价复合物的研究[10-11]。而且非变性ESI-MS分析法适合多个结合平衡以及多个不同的分子量配体结合的复合物检测[12-13]，且具有快速高效、灵敏、精确等优点[10,14]，因此是研究蛋白质复合物的有力工具[15-16]。

本文在前期工作的基础上，进一步采用非变性电喷雾质谱法研究了1种溴代阻燃剂(TBS)以及2种溴代阻燃剂羟基化代谢产物(4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180)(结构式见图1)与甲状腺素运载蛋白的相互作用和结合能力，结合分子对接模拟计算，探究了相互作用的位点及作用方式，有助于进一步了解溴代阻燃剂及其羟基化代谢物在人体内的生物过程和毒理机制。

在备案审查制度方面，要加快在国家层面对政府规章备案审查工作进行统一立法的步伐，进一步完善备案审查启动机制，充分发挥好主动审查和被动审查的整体合力。同时，强化对于规章备案审查主体的监督，健全公众的参与保障机制，强化公众的参与权、建议权和监督权，健全备案审查公开机制。

图1 4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS的分子结构式 Fig.1 Molecule structures of 4-OH-BDE-187,6-OH-BDE-180 and TBS

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TTR在体内或生理条件下的天然结构以四聚体的形式存在，因此污染物配体分子主要与四聚体TTR蛋白发生相互作用。采用非变性电喷雾质谱法检测TTR分别与4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS浓度比为1∶4的混合溶液，均得到配体分子与TTR结合的蛋白质复合物峰。为探究配体分子结合数量，进一步检测了浓度比分别为1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8的TTR和4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS的混合溶液(图3)。如图3A所示，将与配体分子结合的TTR ESI-MS谱图和空白TTR ESI-MS谱图进行比较，前者显示蛋白质复合物峰，复合物离子峰对应的m/z为(TTR质量+结合配体个数×配体质量+i)÷i，i为正离子模式检测到的蛋白质的电荷价态。结合一个配体的离子峰用▲标注，结合两个配体的离子峰用★标注。随着4-OH-BDE-187浓度增加，其与TTR形成化学计量比为1∶1(▲表示)和2∶1( ★表示)的配体-TTR复合物，表明TTR可以结合1～2个4-OH-BDE-187，并且TTR结合2个4-OH-BDE-187时达到饱和。6-OH-BDE-180与4-OH-BDE-187是同分异构体，它们与TTR相互作用的结合模式相似(如图3B)。图3C显示，随着TBS摩尔浓度比不断增大，未见TTR与多个TBS结合的离子峰，表明TBS能与TTR形成化学计量比为1∶1的复合物，且TTR最多能结合1个TBS。

乙腈对照组：当蛋白质与4-OH-BDE-187或6-OH-BDE-180的浓度比为1∶8时，样品溶液所含乙腈的体积比约为14%。故配制50 μL(乙腈-醋酸铵缓冲液：7.3∶42.7)的2.5 μmol/L蛋白溶液，在与上述实验一致的条件下，进行ESI-MS对照分析检测。

Substituting Eq.(17)into Eq.(16),the dynamics coupling relationship between the active and passive joints can be obtained as follows:

1.2 溶液配制

甲状腺素运载蛋白用超纯水溶解，配成25 μmol/L的母液备用。TBS用甲醇溶解，配成50 mmol/L母液，用pH 7.4的醋酸铵缓冲液稀释至25 μmol/L备用。4-OH-BDE-187和6-OH-BDE-180，分别氮吹浓缩至100 μg/mL，用pH 7.4的醋酸铵缓冲液稀释至25 μmol/L备用。将TTR与3种小分子分别按照1∶0、1∶0.5、1∶1、1∶2、1∶4、1∶6、1∶8(蛋白质∶小分子)浓度比进行配制，蛋白的最终浓度为2.5 μmol/L，将混合液振荡、混匀，配制好的混合溶液均放置在37 ℃恒温水浴箱中孵育45 min，随后进行ESI-MS检测。

人源甲状腺素运载蛋白(Sigma公司)，3,5,3′,5′-四溴-4,4′-二羟基基二苯砜(分析标准品，Adamas-beta公司)，4-羟基-2,2′,3,4′,5,5′,6-八溴联苯醚、6-羟基-2,2′,3,4,4′,5,5′-八溴联苯醚(50 μg/mL溶于乙腈，AccuStandard公司)，冰醋酸(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.3 仪器条件

由于实验所购置的4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180为乙腈溶液，为排除溶剂对蛋白质自然态的影响，将不含配体分子的乙腈加至TTR样品溶液作为对照组进行实验。当蛋白质与4-OH-BDE-187或6-OH-BDE-180的浓度比为1∶8时，样品溶液所含乙腈的体积分数约为14%，故对照组中乙腈的含量为14%。乙腈对照组的质谱图如图2C所示，与不含配体分子的乙腈空白组(图2B)对比，TTR的多电荷峰形状和强度均无明显变化，因此可排除溶剂对TTR蛋白多电荷分布的影响，真实反映配体分子4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180对TTR的作用。

1.4 分子对接条件

分子模拟对接实验采用软件AutoDock 4.2.6模拟,对接后的结果由软件Pymol( v 1.3)观测。从蛋白质数据库(http://www.rcsb.org/pdb/)中选取TTR(PDB代码:1z7j)为最佳三维晶体受体结构。配体分子的三维结构均由PRODRG数据库获取 (http://davapc1.bioch.dundee.ac.uk/programs/prodrg/)。采用拉马克遗传算法运行数从150个随机的个体开始全局优化，每个配体进行10次对接实验，本地搜索迭代的最大数目为27 000，对接使用受体盒子的大小为60×60×60，格点间距为0.037 5 nm，其他参数为默认值。

成联方：艺术品的商业化，是经济发展的必然。西方的艺术市场已经比较规范。中国古代也有艺术市场，例如明代中期的吴门书家、吴门画家，清代初期的扬州八怪，晚清的海上艺术家等等。当今的艺术重镇还是集中在经济发达的地区，体现了所谓经济基础决定上层建筑。市场经济对艺术作品存在很大的影响，包括作品风格、大众审美等等方面都有影响。市场上也会出现价格偏离价值的现象，但没关系，市场只会越来越规范、越来越完善。

2 结果与讨论

2.1 TTR蛋白的ESI-MS分析

对比这3种配体与TTR相互作用的ESI-MS谱图，TTR分别最多能结合1个TBS，2个4-OH-BDE-187，2个6-OH-BDE-180。在相同实验条件下，4-OH-BDE-187与6-OH-BDE-180，4-OH-BDE-187与TTR形成化学计量比为2∶1的蛋白质复合物趋势更大，蛋白复合物离子峰强度更高，因此推测4-OH-BDE-187结合TTR的能力强于6-OH-BDE-180。

2.2 乙腈溶剂对TTR的影响

待测样品溶液采用液相系统自动进样器直接进样，流动相：超纯水(含体积分数0.5‰的冰醋酸)，流速：0.05 mL/min，进样体积：10 μL，电喷雾离子源(ESI)，正离子模式，干燥气温度：240 ℃，干燥气流速：10 L/min，喷雾器压力：30 psi，裂解电压：175 V，毛细管电压：3 500 V，雾化器电压：65 V，质谱扫描范围：m/z 500～4 800。

关税税率的不断降低及鸦片贸易的合法化，使外货充斥中国市场，鸦片公开输入，削弱了生产力，同时，使中国财富大量外流。

图2 甲状腺素运载蛋白(A)、溶剂为醋酸铵缓冲液TTR(B)以及溶剂为含14%乙腈的醋酸铵溶液TTR的ESI-MS谱图(C) Fig.2 The ESI-MS spectra of TTR(A)，TTR in ammonium acetate(B) and TTR in ammonium acetate containing 14%acetonitrile(C) concentration of TTR：2.5 μmol·L-1

2.3 TTR蛋白相互作用的ESI-MS分析

高效液相色谱仪(Agilent 1200，美国安捷伦科技有限公司)，电喷雾四极杆飞行时间质谱仪(Agilent 6520 ESI Q-TOF MS，美国安捷伦科技有限公司)，超纯水机(Molelement 1815a 摩尔元素型，上海摩勒科学仪器有限公司)，数控超声波清洗器(KQ-25DB，昆山市超声仪器有限公司)，高精度数控摇床(SHZ-03，上海堪鑫仪器设备有限公司)。

TTR具有单体和四聚体两种结构，理论分子量分别为13 761 Da和55 044 Da。在优化的温和ESI-MS条件下，检测到低质荷比区域单体TTR蛋白质的多电荷分布为m/z 600～2 000，高质荷比区域TTR蛋白质四聚体多电荷峰为(m/z 2 400～4 000 )，电荷分布为+15～+21(图2A)。

图3 4-OH-BDE-187(A) 、6-OH-BDE-180(B) 、TBS(C)分别与TTR相互作用的ESI-MS 谱图 Fig.3 ESI-MS spectra of the complexes of TTR binding with 4-OH-BDE-187(A),6-OH-BDE-180(B) and TBS(C) concentration of TTR is 2.5 μmol·L-1

2.4 TTR复合物结合常数的计算

电喷雾电离过程中将液相的蛋白质溶液转化为气相离子。当配体结构和分子量远小于蛋白质时，蛋白质复合物的大小和表面性质与未结合配体的蛋白质基本一致，所以在气相中测得的相对离子强度可以代表其平衡时的浓度[17]。为了研究4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS的结合能力，根据去卷积谱图，可以得出不同浓度比时4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS与TTR相互作用的结合常数[17-19]。通过公式(1)、(2)推导得到Ka,1与Ka,2的计算公式(3)、(4)，其中[P]0为总蛋白质浓度，[L]0为总小分子浓度，[P]为未结合配体的蛋白质浓度，R为结合配体的蛋白质复合物与未结合配体的蛋白浓度比值，等同于蛋白质复合物峰的丰度(IPLn)与未结合配体的蛋白质峰的丰度(IPn)比，Ka为复合物的结合常数。

(1)

(2)

(3)

(4)

由表1可知，从浓度比1∶1开始，与TBS相比，4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180能与TTR形成更多的复合物。比较相同摩尔浓度比的3种小分子结合TTR的结合常数，大小顺序为4-OH-BDE-187>6-OH-BDE-180>TBS，结合常数越大说明结合能力越强。这与Yang等[20]得到的间位和对位羟基化PBDEs结合活性比邻位羟基化PBDEs强的结果相一致。因此，本实验推测此3种环境污染物与TTR的结合能力顺序为4-OH-BDE-187>6-OH-BDE-180>TBS。由于上述3种环境污染物与甲状腺素结构相似，可能在生物体内累积到一定浓度时与TTR形成蛋白复合物，从而干扰TTR对天然底物甲状腺素的运输和生理功能，其毒理效应有待进一步研究。

表1 不同浓度比时4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS与TTR的结合常数 Table 1 The binding affinity of 4-OH-BDE-187,6-OH-BDE-180,TBS bind to TTR in different mole ratios

Mole ratioKa4-OH-BDE-1876-OH-BDE-180TBS1∶0.5Ka,11.3×1061.9×1067.3×1051∶1Ka,11.7×1063.2×1053.8×105Ka,28.7×1052.7×1051∶2Ka,19.2×1054.8×1052.6×105Ka,23.3×1053.8×1051∶4Ka,13.9×1053.6×1051.6×105Ka,21.3×1058.1×1041∶6Ka,13.1×1053.2×1051.5×105Ka,21.2×1058.0×1041∶8Ka,12.7×1051.9×1057.4×104Ka,21.0×1057.2×104

2.5 TTR复合物的分子对接模拟实验

本文采用Autodock分子对接模拟计算的方法，进一步探讨了4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS与TTR相互作用的结合位点、结合自由能和主要作用方式。采用Autogrid计算格点能量，对接运算采用拉马克遗传算法，配体小分子与蛋白受体之间的结合情况用半经验的自由能计算方法评价。对所有配体的对接结果进行成簇分析，依据最低对接能和成簇分析的情况选取合理的配体-蛋白质结合模式作为复合物结构[21]。图4中红色虚线表示配体与TTR的氨基酸残基形成的氢键，4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180与TTR的作用位点分别为GLU-89和LYS-235，TBS与TTR的作用位点为LYS-235和ASP-74，此3种配体与TTR的结合位点均位于ASP-74附近。3种配体小分子均有羟基官能团，并可与氨基酸残基形成氢键，表明羟基可能在配体分子与TTR结合中起重要作用，已有文献报道溴代阻燃剂羟基化代谢后产生与溴代阻燃剂不同的毒性效应[22]。分子对接的计算结果如表2所示，结合自由能的计算方法如下：结合自由能(EBinding)=分子间相互作用能(EIntermolecular)+内能(EInternal)+扭转能(ETorsional)-未成键的排斥能(EUnboundextended)。4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS与TTR相互作用的结合自由能分别为-27.46、-25.65、-23.94 kJ·mol-1。结合能量越低表示蛋白质复合物越稳定。3种配体分子与TTR的结合能力顺序为4-OH-BDE-187>6-OH-BDE-180>TBS，与ESI-MS实验的分析结果一致。

张伟民的绘画既体现着中国传统的强大生命力，同时也反映时代的审美意趣，他的作品既具备严整技法规范，又具备文人画丰富的笔墨技法和个性化的诗境。画中透露出一种忧伤，一份禅意，一个境界，一种无法散去的诗化了的绝妙语境。这一切，正是张伟民将人之生命价值的感悟和对人生意义的认识，通过手中的画笔，演绎出一首首属他特有的诗意化境般的心灵绝唱的诗篇。张伟民说：“谁生活在杭州，谁就是幸福的。在杭州这样的环境下，学习绘画，从事艺术，更是幸福加幸运。在今天这么美好的环境里，有这么多嘉宾和这么多书画爱好者一起，共同对中国画艺术的欣赏和研究那是幸福加幸福！”

图4 4-OH-BDE-187(A)、6-OH-BDE-180(B)、TBS(C)与TTR相互作用的分子模拟对接结果示意图 Fig.4 Docking spectra of 4-OH-BDE-187(A) ,6-OH-BDE-180(B) and TBS(C) with TTR the red dotted lines represent the formed H-bonds between each ligand and amino acid residues in TTR

表2 TTR-4-OH-BDE-187、TTR-6-OH-BDE-180、TTR-TBS复合物的分子对接模拟结果 Table 2 Resluts of TTR-4-OH-BDE-187,TTR-6-OH-BDE-180 and TTR-TBS by molecular docking

AnalyteEIntermolecular(kJ·mol-1)EInternal(kJ·mol-1)ETorsional(kJ·mol-1)EUnbound extended(kJ·mol-1)EBinding(kJ·mol-1)4-OH-BDE-187-31.1814.653.7314.65-27.466-OH-BDE-180-29.386.863.736.86-25.65TBS-28.9215.154.9815.15-23.94

3 结 论

本文采用非变性ESI-MS和分子对接模拟计算研究了TTR与4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS的相互作用，比较了不同结构的配体与TTR结合能力的大小。ESI-MS检测到4-OH-BDE-187、6-OH-BDE-180、TBS与TTR形成的蛋白质复合物峰，其分别形成化学计量比为1∶1的TTR-TBS复合物，以及1∶1和1∶2的TTR-4-OH-BDE-187，1∶1和1∶2的TTR-6-OH-BDE-180复合物。分子对接模拟计算结果显示，3种配体结合位点均位于TTR的ASP-74残基附近，主要以范德华力和氢键与TTR蛋白质结合，与ESI-MS和分子对接模拟的数据相一致，表明此3种配体结合TTR能力的顺序为4-OH-BDE-187>6-OH-BDE-180>TBS。本研究证明了ESI-MS和分子对接模拟在蛋白质复合物研究中的突出优势，有助于溴代阻燃剂及其羟基化代谢产物致毒机理的后续研究。

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