我国既是全球最大的鸡蛋生产国[1]，也是鸡蛋消费大国，随着人们生活水平的不断提高，鸡蛋作为高营养食品，在居民的饮食结构和营养需求中占据重要地位。近年来由于养殖业中的不规范用药，导致畜禽产品中药物残留和病菌耐药性风险上升等问题时有发生，严重威胁人体健康，引起了社会各界的重视[2]。氟喹诺酮类(FQS)药物为人工合成的抗菌药物，具有抗菌谱广、抗菌力强、结构简单、给药方便、价格低廉等特点，在兽医临床上的应用越来越广泛。国内曾有9种FQS药物批准用于畜禽养殖[3]，我国农业部规定自2016年12月31日起在食品动物中停止使用洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星4种兽药，撤销相关兽药产品批准文号[4]，目前被允许在畜禽养殖中使用的FQS药物主要有环丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)、达氟沙星(Danofloxacin,DAN)、恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)、二氟沙星(Difloxacin,DIF)和沙拉沙星(Sarafloxacin,SAR)。2003年，农业部发布的《兽药停药期规定》中规定上述5种FQS药物在鸡产蛋期禁止使用[5]。由于该5种FQS批准在肉禽养殖中使用，为畜禽养殖场的常备药物，因此在鸡蛋中存在较高的药物残留风险。目前，氟喹诺酮类药物的检测方法主要有微生物法[6]、高效薄层色谱法(HPTLC)[7]、酶联免疫吸附法[8]、高效毛细管电泳法(HPCE)[9]、高效液相色谱法(HPLC)[10-11]、高效液相色谱-质谱联用法(HPLC-MS)[12]、荧光分光光度法[13]等，上述检测方法普遍需要较为繁琐的样品前处理过程，费时费力，而且消耗大量的提取溶剂和固相萃取(SPE)小柱，增加了检测成本和环保负担。本文优化了样品前处理过程，建立了一种能同时检测鸡蛋中环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星和沙拉沙星5种药物残留的HPLC法。该方法具有简单、快速、环保、准确度和灵敏度高等特点，适合我国规模养殖企业和市场驻点检测站日常的鸡蛋质量安全监测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪，配荧光检测器(美国Agilent 公司)；DK-8D三孔电热恒温水槽(上海齐欣科学仪器有限公司)；AG-204电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)。

恩诺沙星(99.5%)、盐酸环丙沙星(99.8%)、甲磺酸达氟沙星(94.2%)、盐酸二氟沙星(99.6%)和沙拉沙星(99.6%)5种标准品(中国兽医药品监察所)；磷酸二氢钾(国药集团化学试剂有限公司)、正己烷(广州化学试剂厂)、三乙胺(上海凌峰化学试剂有限公司)、磷酸(江苏强盛功能化学股份有限公司)均为分析纯；乙腈(色谱纯，美国Fisher 公司)；鲜鸡蛋(市售)。

1.2 试剂配制

标准储备液：准确称取相当于环丙沙星、达氟沙星、恩诺沙星、二氟沙星和沙拉沙星各20 mg的标准品，分别置于100 mL棕色容量瓶中，并用0.03 mol/L氢氧化钠溶液稀释定容至刻度线，摇匀，配制成质量浓度各为200 mg/L的标准储备液，于-20 ℃保存。

Isola Wine by Cantine-Balita, an Indonesia-Italy partnership,soon joined the duo in 2012. In addition to Muscat St Vallier and Alphonse-Lavallée, the winery also grows Malvasia Nera and some Syrah. At the moment, only three wines are made: Isola white（Moscato）, Isola Rosé and Isola Red.

准确量取混合标准工作液适量，用流动相溶液稀释，配成系列浓度的混合标准溶液(沙拉沙星质量浓度为4、8、16、40、80、200、400 μg/L，环丙沙星和二氟沙星质量浓度为2、4、8、20、40、100、200 μg/L，恩诺沙星质量浓度为1、2、4、10、20、50、100 μg/L，达氟沙星质量浓度为0.2、0.4、0.8、2、4、10、20 μg/L)，以“1.3”色谱条件重复检测3次，以各药物的质量浓度(x，μg/L)为横坐标，对应峰面积平均值(y)为纵坐标，进行线性回归分析，计算回归方程和相关系数。

鸡蛋可食用部分匀质后呈液态，实验中发现，当采用磷酸盐进行提取，绝大部分的有效成分可被带入提取液中，只剩下少量残渣。实验利用低浓度乙腈结合加热促使蛋白质快速沉淀，分离清液后直接进高效液相色谱仪分析。该前处理方法具有简单快捷、回收率高、重现性好和环境友好等特点，每处理1份样品仅消耗1.25 mL乙腈和2 mL正己烷，产生约7 mL废液，相比其他常用的样品前处理方法，大大减少了有机溶剂用量，且无需使用相对昂贵的SPE小柱进行富集浓缩，从而避免了处理过程中产生大量实验废液。

色谱柱：Agilent TC-C18(2)(250 nm×4.6 mm，5 μm)；流动相：0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液-乙腈(80∶20)，等度洗脱；流速：1 mL/min；柱温：25 ℃；进样量：20 μL；检测波长：激发波长 280 nm；发射波长 450 nm。

二是以学讲话促进绿色发展。垦区贯彻习总书记要坚持绿色、可持续发展的指示要求，全力做好绿色发展和环保工作。为了做好秸秆禁烧工作，垦区各级成立了秸秆禁烧领导小组和督查组，层层签订责任书，采取“局级联动、全面覆盖、包片负责、各司其职”的工作方式和“网格化”管理方式，充分运用行政手段、法律手段、经济手段，对各级党委履行职责情况进行监督，为垦区实现“零火点”目标奠定了坚实基础。同时，为推进绿色发展，垦区大力实施农产品质量追溯体系建设， 推广保护性耕种措施，开展循环农业示范，加强农作物秸秆资源化综合利用，坚持用养结合、综合施策，确保黑土地不减少、不退化。

1.3 色谱条件

我叫他去县城的时候到我那里玩玩。他说，他经常去县城的，现在城里人比乡下人还要重视风水，年纪大的亡故，墓地选择之外要择定下葬的具体时辰；买新房子要看楼盘，选择单元位置；买老房子要问明吉凶，去晦除邪。他说，连不少单位都常常请他去的。有一个单位，20层的大楼，主楼裙楼，围墙花园，建得既豪华又气派，但入住之后不久，两个一把手相继因经济问题而入狱。再后来的继任者怀疑风水出了问题，不知怎么找到了他。他去看了看，叫他们把原来朝南开的大门封掉，改朝东开。小先生所说的这个单位，和我家在同一条路上，当时搞不清好好的南大门，为什么封掉重开，想不到还有这样一段故事。

1.4 标准曲线的制作

混合标准工作液：准确量取适量的上述5种标准储备液，用流动相稀释成适宜浓度的混合标准工作液，其中沙拉沙星、环丙沙星、二氟沙星、恩诺沙星和达氟沙星的浓度比为20∶10∶10∶5∶1，于-20 ℃保存。

1.5 样品前处理方法

鸡蛋去壳，用匀浆机匀质制成供试鸡蛋样品，于-20 ℃保存。称取鸡蛋样品(2±0.02) g，置于15 mL离心管中，加入1.25 mL乙腈，涡旋1 min，用0.1 mol/L磷酸缓冲液定容至刻度，再次涡旋40 s，于55 ℃水浴加热20 min后取出，涡旋使容量瓶中内容物充分扩散，冷却至室温，加入2 mL正己烷，涡旋30 s，13 000 r/min离心10 min，取下层清液过0.22 μm尼龙滤膜，装入进样瓶，供高效液相色谱分析。

0.05 mol/L磷酸/三乙胺溶液：取85%磷酸3.4 mL，加水稀释至1 000 mL，搅拌下加入三乙胺，调至pH 2.4。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件

该方法色谱条件建立的关键在于能否使沙拉沙星和二氟沙星色谱峰有效分离，实验中对比了Supelco Discovery C18、GLsciences Inc Inertsil ODS2 C18、伊利特Hypersil BDS C18、Agilent Extend C18和Agilent(5HC-C18)以及Waters Nova-Pak C18等不同型号的色谱柱。结果发现，Agilent(5HC-C18)色谱柱在等度洗脱条件下对FQS药物有较好的分离效果，使用其他几种色谱柱，沙拉沙星和二氟沙星的色谱峰均未能达到完全分离，而改用梯度洗脱则难以获得相对平稳的基线。在“1.3”色谱条件下，5种药物的保留时间分别为：环丙沙星5.93 min，恩诺沙星6.59 min，达氟沙星7.44 min，沙拉沙星11.12 min和二氟沙星11.74 min，基线平稳，药物峰形对称，空白鸡蛋样品对药物检测干扰较低，检测色谱图见图1。

图1 空白鸡蛋样品(A)、标准溶液(B)、空白鸡蛋添加药物样品(C)的液相色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of five fluoroquinolones in blank egg(A),standard solution(B) and spiked egg(C) concentration of standard solution(B):1:CIP(4 μg/L);2:DAN(0.4 μg/L);3:ENR(2 μg/L);4:SAR(8 μg/L) ;5:DIF(4 μg/L);the spiked concentration of spiked egg(C):1:CIP(10 μg/kg);2:DAN(1 μg/kg);3:ENR(5 μg/kg);4:SAR(20 μg/kg);5:DIF(10 μg/kg)

2.2 样品处理条件的选择

0.1 mol/L磷酸缓冲液：称取磷酸二氢钾6.8 g，加水溶解并稀释至500 mL，用5 mol/L氢氧化钠调至pH 7.0。

实验过程中发现，在常温条件下，要使鸡蛋、牛奶和血浆等生物样品获得较明显的沉淀，液体中乙腈需达到50%以上的浓度，而乙腈浓度明显高于流动相比例的溶液直接进样，容易引起色谱峰的分离度和对称性下降。本方法加入的磷酸盐缓冲液和与流动相浓度相近的乙腈有利于进样溶液中FQS药物(特别是达氟沙星)的稳定，并能保持与标准溶液的色谱峰形一致。

2.3.1 标准曲线、检出限及定量下限 采用优化后的前处理方法以及色谱条件，对“1.4”制备的工作曲线溶液进样分析，以各药物色谱峰的峰面积平均值(y)为纵坐标，对应的标准溶液浓度(x)为横坐标，绘制标准曲线。5种氟喹诺酮类药物在各自浓度范围内线性关系良好，相关系数(r2)均能达到0.999 9。取空白鸡蛋样品添加混合标准工作液，按照本方法对该样品进行前处理并测定，以药物色谱峰的信噪比(S/N)≥3对应的加标浓度为方法的检出限(LOD)，以S/N≥10对应的加标浓度为方法的定量下限(LOQ)，结果见表2。方法的LOD为0.2～4 μg/kg，LOQ为0.5～10 μg/kg，具有较高的灵敏度。

表1 加热时间和温度对于样品溶液蛋白沉淀效果的影响 Table 1 Effect of heating time and temperature on precipitation of protein in sample solution

Heat-treatment time(min)Heat-treatment temperature45 ℃50 ℃55 ℃60 ℃5++++++++++++10+++++++±±15+++±±-20++++---25+++---30++++---

“++++” indicates that solution was extremly tubid;“+++” indicates that solution was very turbid;“++”indicates that solution was slightly turbid;“±” indicates that solution was elementarily clarified;“-” indicates that solution was completely clear

2.3 方法学评价

通过分析对比不同加热温度(40～60 ℃)和加热时间(5～30 min)对上机溶液澄清度的影响(表1)，寻找最佳加热条件。结果表明，当温度高于50 ℃时，蛋白质的凝集效果较好，且温度越高，凝聚速度越快。但过高的温度易造成溶剂挥发或药物分解，影响准确定量。在55 ℃条件下，加热时间超过15 min后，蛋白质能沉淀完全，为获得稳定的实验效果，本实验选用55 ℃水浴20 min作为前处理的加热条件。

1）利用微生物的生理生化特征和分子生物学鉴定，获取的石油烃降解菌分别为球形赖氨酸芽孢杆菌、弯曲芽胞杆菌、门多萨假单胞菌、产碱假单胞菌、苏云金芽孢杆菌、产碱假单胞菌.

表2 5种氟喹诺酮类药物的线性范围、回归方程、相关系数、检出限及定量下限 Table 2 Linear ranges,regression equations,correlation coefficients,LODs and LOQs of five fluoroquinolones

Analyte Linear range(μg/L)Regression equation r2LOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)CIP2～200y=0.297 2x-0.019 20.999 925DAN0.2～20y=3.238 4x-0.014 60.999 90.20.5ENR1～100y=0.567 8x-0.010 00.999 912.5SAR4～400y=0.237 1x-0.021 10.999 9410DIF2～200y=0.519 5x-0.003 40.999 925

2.3.2 准确度与精密度 向空白鸡蛋样品中分别添加不同浓度的标准工作液，制成4组不同加标浓度(分别为1倍、2倍、4倍、20倍LOQ浓度)的样品，每一浓度每批6个平行，重复3批次，样品加标后涡旋30 s，在4～8 ℃放置3 h后按“1.5”方法进行前处理，按“1.3”色谱条件检测，计算加标回收率和批内、批间相对标准偏差(RSD)。5种氟喹诺酮类药物的平均加标回收率为92.2%～107.1%，批内RSD为0.6%～5.8%，批间RSD为1.5%～5.0%(表3)，表明该方法的准确度和精密度较高，重现性好，数据准确可靠，满足我国农业部兽药残留分析方法的要求[14]。

表3 鸡蛋中5种氟喹诺酮类药物的回收率及相对标准偏差(n=6) Table 3 Recoveries，intra- and inter-assay RSDs of five fluoroquinolones in egg(n=6)

AnalyteSpiked(μg/kg)Average recovery/%RSD/%Batch 1Batch 2Batch 3Batch 1Batch 2Batch 3Inter-assayCIP5101.196.197.14.92.83.04.210104.5102.0104.74.62.82.93.520100.894.998.75.61.41.34.210099.0100.197.40.90.81.61.6DAN0.5100.798.298.73.41.82.62.81102.996.597.65.51.62.14.5295.797.494.73.11.31.72.31096.997.594.30.70.91.61.8ENR2.5105.4107.1107.12.02.21.01.9599.696.9104.35.34.42.25.01096.799.3103.85.82.62.04.75096.998.998.40.80.91.71.5SAR1093.892.294.13.82.52.42.920106.1100.796.11.72.31.74.54099.297.395.03.81.40.62.920097.6100.597.70.90.71.71.8

(续表3)

AnalyteSpiked(μg/kg)Average recovery/%RSD/%Batch 1Batch 2Batch 3Batch 1Batch 2Batch 3Inter-assayDIF599.6102.7105.03.42.33.33.610106.799.999.81.61.42.63.720103.698.598.83.31.31.03.210099.6100.198.10.70.71.91.5

根据近期的相关报道，程勇翔等[15]检测得到鸡蛋中6种氟喹诺酮类药物残留的平均回收率为80.52%～101.10%，相对标准偏差为2.99%～10.40%。李宁等[16]得到鸡蛋样品中氟喹诺酮类药物的回收率为78.9%～95.3%，相对标准偏差为5.5%～8.7%。相比而言，本实验采用定容提取的方法，回收率更接近于加标值(回收率100%)，批内与批间相对标准偏差较小，说明方法具有较好的准确度和精密度。为使空白添加样品更接近实际阳性样品，样品在加标后先涡旋30 s，在4～8 ℃放置3 h后再进行前处理，以使药物与组织充分作用。相比上述方法以及国标液相色谱法(农业部781号公告-6-2006[17])，本方法在灵敏度方面也有明显优势，由于前处理便捷，杂质净化彻底，色谱图基线噪音背景几乎与标准溶液相近，5种FQS药物获得较为理想的检测灵敏度，特别是恩诺沙星和达氟沙星，LOQ达到2.5 μg/kg以下，满足测定要求。

2.4 实际样品的检测

分别从广州市天河、越秀、番禺、海珠、荔湾、白云6个区的超市和农贸市场中随机购买50份鸡蛋样品，按本方法进行检测，每份样品测定2个平行样，结果显示除1份样品中恩诺沙星残留量(2.7 μg/kg)略高于方法定量下限外，其余样品均未检出5种氟喹诺酮类药物残留，该样品检出的浓度值按目前国标液相色谱法[17]仍属未检出。

3 结 论

本文建立了环境友好的高效液相色谱法快速测定鸡蛋中5种氟喹诺酮类药物残留。方法的前处理步骤简单、快捷、环保，准确度和灵敏度高，可以满足广大养殖企业和市场驻点检测站日常的鸡蛋质量安全监测需要，也为禽蛋类样品中兽药残留检测的前处理方法提供了技术参考，在保障禽蛋的食品安全方面将发挥重要作用。

从这场论争中我们可以看到，在嘉、万文人对“尊元”理念的修正与完善的过程中，其对元曲的评判标准，明显呈现多样化的格局，教化观念、音乐审美、文辞审美、情节设计等多种因素都参与到评判标准的构成中，而不同曲家对不同因素的重视程度的差别，则导致了面对同样的作品出现了截然不同的价值判定。同时页反映出当时戏曲审美的结构尚在调整，还未在诸多审美要素的排序方面形成一个共识性质的基本趋向。

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