爱德万甜，化学名为N-{N-[3-(3-羟基-4-甲氧基苯基)丙基]-L-a-天冬氨酰}-L-苯丙氨酸-1-甲酯，分子式为C24H30N2O7·H2O，由香兰素和阿斯巴甜经化学反应制得[1]。欧洲食品安全局和美国食品药品管理局均对爱德万甜的每日允许摄入量作了规定，分别为不超过5 mg/kg·bw和32.8 mg/kg·bw[2]。2017年10月20日，国家卫生计生委发布《关于爱德万甜等6种食品添加剂新品种、食品添加剂环己基氨基磺酸钠(又名甜蜜素)等6种食品添加剂扩大用量和使用范围的公告》，允许爱德万甜作为新品种的食品添加剂添加至部分食品中，同时规定了限量。因此，开发食品中爱德万甜的检测方法可为食品监管及时提供技术支撑，促进食品安全健康发展。

2.1 两组早产儿的机体生长发育情况比较 干预前两组早产儿的机体生长情况差异无统计学意义(均P>0.05)；干预后，观察组早产儿在不同时间段的头围、身长、体重及MDI、PDI评分均高于对照组早产儿，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

目前，国内外关于甜味剂如安赛蜜、糖精钠、甜蜜素和阿斯巴甜等的研究较多，分析方法有高效液相色谱法[3-5]、液相色谱-串联质谱法[6-7]、气相色谱法[8]等，其中液相色谱-串联质谱法由于价格昂贵，难以在一般实验室普及，而气相色谱法需衍生后测定，前处理较复杂，且很少有关于爱德万甜检测方法的报道。本文根据爱德万甜的物理特性和化学性质，建立了食品中爱德万甜的高效液相色谱测定方法。该方法前处理简单、分析快速，准确度高，干扰因素少，适用于饮料、发酵乳和糕点中爱德万甜的测定。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1260型高效液相色谱仪配有G1329B自动进样器，G1311C四元泵、G1316A柱温箱，G1315D二极管阵列检测器(美国安捷伦科技有限公司)；KQ5200DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；CT140台式高速离心机(上海天美生化仪器设备工程有限公司)。

GTM即旋转剪切试验机，将搓揉、压实、剪切等结合一体，最大程度地实施路面最大接触压强，将沥青混合料预压到汽车轮胎作用于路面所产生的最终密实度[2]，通过理论推导进行力学分析与设计，其主要设计指标如下：

爱德万甜(≥97.0%，HPLC级，Sigma公司)；甲醇(≥99.9%，色谱纯，德国Merck KGaA公司)；乙酸铵(≥98.0%，分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。实验用水为Millipore Intergral 3超纯水仪制备的超纯水。

越人利用水生动植物来装饰越瓷，除了器型装饰美观之外，更重要的是对后人有很大生态道德教育意义。一个地域有其独特的自然环境，人类只有尊重生命、善待自然，才能确保自然环境良性发展，同时，合理开发、积极改造自然环境，适度消费自然资源，不仅能使人地之间关系变得更为和谐，还能使人类的物质财富变得更加丰富，让人类过上更加美好的生活。

1.2 色谱条件

爱德万甜标准品不溶于水，需加入适当比例的甲醇溶液才会溶解，所以提取样品溶液必须采用一定比例的甲醇-水溶液。考察了体积比为30∶70、40∶60、50∶50、60∶40的甲醇-水溶液作为提取剂的效果，结果发现随着提取液中甲醇比例的提高，提取率相应升高，但差距甚微，采用体积比为30∶70和40∶60的甲醇-水提取样品时提取液较浑浊，可能是因为低比例甲醇沉淀蛋白质的效果不佳，而采用高比例(60∶40)甲醇-水提取样品时，可能会提取更多的干扰物。综合考虑提取率和蛋白质沉淀效果，最终采用体积比为50∶50甲醇-水溶液提取样品。

1.3 实验方法

精确称取饮料样品5.0 g(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶中，加纯甲醇溶液稀释，并定容至刻度，于10 000 r/min离心5 min，过0.45 μm滤膜，待测。

C18色谱柱是实验室最常见的色谱柱，适用于中性、极性、酸性和碱性以及螯合化合物的分离。爱德万甜是中等极性物质。因此本实验选择最常用的Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱分离目标化合物。

精确称取爱德万甜标准品50.0 mg(精确至0.01 mg)于100 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50，体积比)溶解，配制成质量浓度为500.0 mg/L的标准储备液，冷藏储存。临用时，用水逐级稀释成适当浓度的标准工作液。

精确称取糕点样品2.0 g(精确至0.1 mg)于50 mL离心管中，加20 mL甲醇-水(50∶50)溶液超声提取10 min，于10 000 r/min离心5 min，取上清液至25 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50)溶液定容至刻度，过0.45 μm滤膜，待测。

骨架曲线反映了构件的强度、刚度、延性、耗能以及抗倒塌能力，也是确定恢复力特征的重要依据.骨架曲线是研究钢骨混凝土抗震性能的另一个指标.将各影响因素下得到的骨架曲线进行对比，如图6—图8所示，其中纵轴T为每次循环得到的最大扭矩，横轴θ为扭转角.

图1 加标样品(1.0 mg/mL)的色谱图和爱德万甜(100.0 mg/L)的光谱图 Fig.1 Chromatograms of spiked sample(1.0 mg/mL) at different wavelengths and spectrum of advantame(100.0 mg/L) a.230 nm;b.280 nm

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

最终确定采用Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱在柱温为35 ℃时，以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵(53∶47)为流动相，对爱德万甜进行分离测试。

精确称取发酵乳样品2.0 g(精确至0.1 mg)于50 mL离心管中，加8 mL甲醇-水(50∶50)溶液超声提取10 min，于10 000 r/min离心5 min，取上清液至10 mL容量瓶中，加甲醇-水(50∶50)溶液定容至刻度，过0.45 μm滤膜，待测。

考察了甲醇-水和甲醇-0.02 mol/L乙酸铵两种流动相体系，结果发现，爱德万甜在甲醇-0.02 mol/L乙酸铵流动相体系中峰形尖锐且对称，无拖尾现象，因此实验采用该流动相体系。实验进一步考察了不同体积比(80∶20、70∶30、60∶40、50∶50、40∶60)的甲醇-0.02 mol/L乙酸铵流动相对分离结果的影响。结果发现，目标化合物的保留时间随着有机相比例的减少而增大，且变化显著，响应值随着有机相的减少而变小。当流动相比例为60∶40时，目标化合物保留时间在10 min内，流动相比例为50∶50时，保留时间在15 min左右，而当比例为40∶60时，则保留时间在20 min以后，已不适合食品的批量分析；而目标化合物的保留时间在10 min内可能会受到其他物质干扰。因此实验选择体积比为50∶50的甲醇-0.02 mol/L乙酸铵并进行比例微调(50∶50、51∶49、52∶48、53∶47、54∶46)，对色谱图进行比较后，最终确定流动相甲醇-0.02 mol/L乙酸铵的最佳比例为53∶47。

图2 爱德万甜在不同柱温下的色谱图 Fig.2 Chromatograms of advantame at different column temperatures a.40 ℃;b.35 ℃;c.30 ℃;d.25 ℃

如图3所示，36号化合物对Bcap-37，MCF-7和A549细胞存活均表现出抑制作用，且随浓度的增加，抑制细胞存活的作用增强。作用48h，抑制3种肿瘤细胞存活的IC50分别为22.4±0.8，35.7±1.2和（30.1±2.9）mg·L-1。选取存活率受36号化合物影响最大的Bcap-37细胞作为后续实验细胞，初步探索36号化合物可能的作用机制。

采用二极管阵列检测器全波长扫描模式，在190～400 nm波长范围内对爱德万甜进行紫外扫描，发现爱德万甜在230 nm和280 nm处有最大吸收峰，考虑到低波长下较多物质均有吸收，可能干扰目标化合物测定，且230 nm采集的色谱图基线明显高于280 nm采集的色谱图基线(见图1)，故选择280 nm为检测波长。

2.2 前处理方法的优化

色谱柱：Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)；柱温：35 ℃；流动相：甲醇-0.02 mol/L乙酸铵(53∶47,体积比)，等度洗脱；检测波长：280 nm；进样量：10 μL。

考察了柱温(25、30、35、40 ℃)对目标化合物分离的影响(图2)。结果表明：目标化合物的响应值随柱温的升高而增强，保留时间则减小。由于色谱柱一般在40 ℃以下工作能够达到最佳使用寿命，同时兼顾最佳响应值，选择柱温为35 ℃。

可以培养无机化学兴趣小组，在课后实验室可以向兴趣小组开放，增加无机化学的探索实验，培养兴趣小组认真细致的实验态度，娴熟的操作技巧，为以后专业操作课打下坚实的基础[5]。同时也可以适当安排兴趣小组的同学协助实验准备教师准备实验试剂，在协助老师的同时，他们的操作技能也得到了提升。

2.3 方法的检出限、定量下限与线性范围

将分别按“1.3”实验方法处理的饮料、酸奶和蛋糕空白样品溶液稀释爱德万甜标准储备溶液至1.0 mg/L，采用优化的色谱条件测定，以信噪比S/N≥3计算得检出限分别为0.6、1.5、9.0 mg/kg，以S/N≥10计算定量下限分别为2.0、5.0、30.0 mg/kg。配制质量浓度分别为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、500.0 mg/L的爱德万甜标准溶液，采用高效液相色谱分析，以质量浓度(x，mg/L)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标绘制标准曲线。结果表明：爱德万甜在1.0～200.0 mg/L质量浓度范围内呈良好的线性，回归方程为y=3.9x-5.7，相关系数(r)为0.999 8。

2.4 方法的回收率与精密度

分别取饮料、酸奶和蛋糕的空白样品进行加标回收实验，添加低、中、高3个浓度水平的爱德万甜标准溶液，每个浓度平行实验5次，根据测定结果计算回收率和相对标准偏差(RSD)。结果表明，不同加标浓度下爱德万甜的回收率为90.9%～103.4%，RSD为1.1%～4.5%(见表1)，说明方法具有较高的准确度和精密度，可满足实验要求[9]。

表1 爱德万甜的回收率与相对标准偏差(n=5) Table 1 Recoveries and relative standard deviations of advantame(n=5)

SampleSpiked(mg/kg)Found(mg/kg)Recovery(%)RSD(%)Beverage2.0,4.0,20.01.970,3.989,19.7898.5,99.7,98.92.3,1.1,3.6Yoghourt5.0,10.0,50.04.732,9.689,46.9294.6,96.9,93.82.2,1.2,1.3Cake30.0,60.0,300.030.06,62.06,272.6100.2,103.4,90.92.1,4.5,1.9

同时选取低、中、高浓度的加标溶液进行精密度连续测试实验，每个浓度重复测定5次，同时选取一浓度的加标溶液进行日内精密度测试，测定7次，进行日间精密度测试，连续测定5 d。结果表明，连续测定峰面积的精密度(RSD，n=5)为0.5%～2.4%，日内RSD(n=7)为0.9%，日间RSD(n=5)为0.6%，定量重复性≤3.0%；保留时间的连续精密度(RSD，n=5)为0.1 %～0.2%，日内RSD(n=7)为0.7%，日间RSD(n=5)为0.9%，定性重复性≤1.0%，表明仪器具有良好精密度，满足实验要求[10]。

图3 干扰实验色谱图 Fig.3 Chromatograms of interference tests a.advantame(2.0 mg/L)；b.sodium cyclamate and aspartame (20.0 mg/L)；c.new red,erythrosine and indigo(20.0 mg/L)； d.lemon yellow,sunset,amaranth,carmine and light blue (20.0 mg/L)；e.acesulfame K,soluble saccharin,benzoic acid,sorbic acid and dehydroacetic acid(20.0 mg/L)

2.5 干扰实验

GB2760-2014《食品添加剂使用标准》允许部分食品添加剂可用于饮料、发酵乳和糕点的生产加工，因此本文考察了质量浓度均为20.0 mg/L的苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、阿斯巴甜、柠檬黄、日落黄、苋菜红、胭脂红、新红、赤藓红、亮蓝、靛蓝15种食品添加剂对爱德万甜(2.0 mg/L)测定的影响。结果发现，使用本方法测定爱德万甜，以上15种物质均不干扰测定(图3)。

2.6 实际样品的测定

采用本方法对市售的12个饮料样品、7个发酵乳样品和6个糕点样品进行测定，结果表明，25个样品均未检出爱德万甜(饮料<0.6 mg/kg、发酵乳<1.5 mg/kg，糕点<9.0 mg/kg)，未发现超范围、超限量添加爱德万甜的情况。

3 结 论

本文采用甲醇-水(50∶50)超声提取样品，以甲醇-0.02 mol/L乙酸铵(53∶47)为流动相，Agilent TC-C18(2)(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱分离爱德万甜，二极管阵列检测器检测，外标法定量。实际样品测定和干扰实验结果显示，目标化合物保留时间处无干扰。方法学验证参数均符合GB/T27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的要求。该方法具有良好的准确度、精密度且操作简单。

参考文献：

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[10] JJG 705-2014.Liquid Chromatography.Regulation of Metrological Verification of the People’s Republic of China(液相色谱.中华人民共和国国家计量检定规程).