食源性致病菌是以食物为载体导致人类发生疾病的一大类细菌，具有来源多样、繁殖迅速的特点，其中沙门氏菌是导致食源性疾病的第二大病原菌，该菌在食品及水中存活时间长达5个月至2年之久，食品被污染后没有明显的感官变化，极易被人或动物食用，造成感染性疾病。因此，对活性沙门氏菌的快速准确检测，是预防和控制沙门氏菌感染及保障食品安全的有效手段。

目前，沙门氏菌的检测方法主要包括常规培养法、免疫法、聚合酶链反应法(Polymerase chin reaction method,PCR)和基因芯片技术等[1]。常规生化鉴定需4～7 d，耗时费力、效率低，无法满足快速检测的市场需求[ 2-3]。免疫法基于抗原与相应抗体之间的特异性结合，检测前需长时间的增菌，操作中洗板不彻底易出现假阳性结果[4-5]。PCR是一种特异性的DNA扩增技术，但实际检测致病微生物的种类较少，分辨率低，且引物之间可能存在干扰，检测结果存在一定的假阳性或假阴性现象[6-7]。基因芯片检测技术具有准确、高通量且自动化程度较高的特点，但其在探针的合成与固定、分子的标记、数据的读取与分析等方面存在技术成本较高、重现性较差等不足[8-9]。此外，还有以传统方法为基础、多学科交叉发展起来的新型检测技术，如传感技术[10-11]、纳米技术[12-15]等，此类技术大大缩短了检测时间，有望成为未来检测技术的主流发展方向，但该类方法存在检测成本昂贵、技术要求高等问题。

金属有机骨架材料是由金属离子或金属簇和有机配体通过自组装而形成的一类新型纳微结构功能材料，具有结构可设计性与可调控性、低晶体密度以及高比表面积等特征，其中，镧系金属、镉、锌、铪、钇、锆等金属有机骨架材料具有优越的荧光猝灭特性。另外，材料中的配体通常含有共轭π电子系统和大量的孔隙，允许DNA分子与之结合和重构。

《企业年金试行办法》规定，企业和员工自愿建立补充养老制度。现实是：企业年金在国有企业实施较为充分，但建立企业年金的私营企业数量较少，企业都是以营利为目的，有几个私营企业会自愿？但我们见到的是与之相对应的公务员的职业年金已经实行，有人戏称：公务员使用的是纳税人的钱，应发尽发，应缴尽缴；而企业对员工的福利是，能不发就不发，能少缴就少缴。

图1 基于金属有机骨架材料-适配体构建的 荧光传感器检测沙门氏菌的原理图 Fig.1 Principle of the biosensor based on metal organic frameworks and aptamer to detect salmonellae

本研究基于合成的Uio-66-NH2材料构建了荧光生物传感器，并将其用于食品中沙门氏菌的检测(图1)。首先，选用5′端修饰有荧光素的沙门氏菌适配体作为传感器特异性识别目标物的信号响应部分；其次，均匀分散在溶液中的MOFs材料通过静电吸附作用将适配体吸附到材料表面并猝灭荧光素的荧光；当存在沙门氏菌时，沙门氏菌与其适配体结合并从MOFs材料表面脱附，适配体上的荧光素荧光恢复。

2.3.2 适配体浓度 适配体捕获目标菌种的效率与适配体本身的浓度有关，当适配体浓度较低时，捕获到的目标菌种的数量相应较少；反之，则能捕获到较多数量的目标菌种。为了考察最适宜的适配体浓度，先向200 μL Tris(pH 7.4)溶液中加入30 μL的Uio-66-NH2材料(50 μg/mL)，待分散均匀后再加入不同浓度的适配体溶液(0、20、40、60、80、100、120、150 nmol/L)，30 min后再与105 cfu/mL沙门氏菌在37 ℃条件下孵育1 h，离心后吸取上清液测定其荧光。结果显示，当适配体浓度从0 nmol/L增至100 nmol/L时，荧光强度呈增大趋势，继续增大适配体浓度时，荧光强度不再增大，因此适配体的适宜浓度为100 nmol/L。

相比之下，OM-D E-M1 II在参数上略逊G9，而且缺乏了重要的60fps 4K视频拍摄能力。不过，我们仍然认为E-M1 II是一台更加适合摄影爱好者的相机。它小巧的机身具备绝佳的便携性。奥林巴斯出色的定焦镜头群是这台相机的绝配，完全可以满足日常拍摄需求。而当你需要拍摄运动、野生动物题材时，这款相机也可以做得极为出色。考虑到大多数用户的使用习惯，我们认为E-M1 II是更好的那一台。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

2.3.1 材料用量 当材料用量不够时，适配体上的FAM不能被完全猝灭进而导致体系的背景信号较高，不利于提高传感器的灵敏度；相反，若材料过量则会阻碍沙门氏菌与其适配体特异性结合，影响传感器的检测范围和稳定性，所以对材料用量进行优化显得尤为重要。向200 μL 100 nmol/L的适配体(pH 7.4的Tris体系)中加入不同体积的Uio-66-NH2材料(50 μg/mL)猝灭荧光素的荧光，当加入30 μL Uio-66-NH2材料时，体系的荧光猝灭效率达85.89%，继续增加材料用量并未出现较大的猝灭效率，因此选择Uio-66-NH2材料体积为30 μL。

沙门氏菌适配体DNA序列[16]：5′-TTTG GTCC TTGT CTTA TGTC CAGA ATGC TATG GCGG CGTC ACCC GACG GGGA CTTG ACAT TA-3′。

收到短信的彭伟民将信将疑，没给妻子任何回复，而是直接打了个电话给欧阳锋。彭伟民在电话中说你应该清楚我是谁，昨晚发生的事情你必须尽快给个交待。

1.2 实验步骤

1.2.3 溶液的配制 称取Uio-66-NH2材料2.0 mg分散在4.0 mL水中，持续超声30 min，此时材料能均匀分散在水溶液中，备用。适配体溶液(10 μmol/L)在4 ℃保存，取200 μL用水稀释至2.0 mL，此时适配体溶液浓度为1 μmol/L，避光放置，备用。

1.2.5 沙门氏菌生物传感器 在20 μL适配体溶液(100 nmol/L)中加入30 μL的Uio-66-NH2材料溶液，再加入100 μL Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.4)，待适配体上的荧光素荧光猝灭后加入不同浓度目标物沙门氏菌溶液50 μL，于37 ℃条件下孵育，振摇适宜时间后离心，吸取上清液测定其荧光。

图2 Uio-66-NH2材料的FESEM形貌图(A)和XRD表征图(B) Fig.2 FESEM image(A) and XRD pattern(B) of Uio-66-NH2 material

图3 基于MOFs构建的沙门氏菌生物传感器的可行性研究 Fig.3 Feasibility study of biosensor to detect salmonellae based on metal organic frameworks a：aptamer;b：aptamer +50 μL MOFs +104 cfu/mL salmonellae；c：aptamer +50 μL MOFs +102 cfu/mL salmonellae；d：aptamer +50 μL MOFs;excitation：480 nm,emission：520 nm

1.2.1 Uio-66-NH2的合成 根据文献[17]合成Uio-66-NH2材料：称取0.42 g的ZrCl4溶于50 μL水中，然后加入邻氨基对苯二甲酸 0.3 g，将混合物溶解在40 mL的DMF中，超声10 min后，利用磁力搅拌器搅拌30 min，搅拌结束后将混合溶液转移至45 mL的聚四氟乙烯反应釜中加热至100 ℃，反应24 h。之后自然冷却，将反应后的溶液利用砂芯漏斗过滤得到黄色产物，最后利用丙酮和水分别清洗3次，于120 ℃真空干燥3 h。

城乡关系最终发展成为城乡二元结构是生产力发展和社会分工的产物。马克思一语道破资本空间与其他空间矛盾、城乡空间分裂失衡的根本原因：资本逻辑下社会资源由农村向城市集聚，乡村社会关系断裂碎片化为城市化发展的附庸，社会矛盾集中于城市，空间对立与矛盾压力逐步加大的情况下，城市进一步向农村索取社会资源、转嫁社会压力。而资本空间拜物教时刻将空间资本化的冲动，更是直接催生城乡社会空间和主体的分裂对抗。经济、社会空间和主体的排斥，演变为文化礼俗习惯之间的对立，以至于滕尼斯直言，城乡空间排斥对立就是礼俗社会与法制社会之间的矛盾对立。

1.2.4 Uio-66-NH2猝灭修饰有FAM的适配体的荧光 在适配体溶液(0～200 nmol/L)中加入一定体积(0～50 μL)的材料溶液，用Tris-HCl(50 mmol/L，pH 7.4)稀释至200 μL，振摇不同时间后离心，吸取上清液测定其荧光。

1.2.2 菌种的活化与处理 将沙门氏菌接种到经高压灭菌的LB(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化钠10 g/L，pH 7.4)液体培养基中培养，37 ℃轻微振荡活化至OD600达到0.3，收集菌液于4 ℃下以3 000 r/min离心5 min，去除上清液，用1×结合缓冲溶液(1×BB)(50 mmol/L pH 7.4的Tris-HCl，5 mmol/L KCl，100 mmol/L NaCl，1 mmol/L MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。

2 结果与讨论

2.1 Uio-66-NH2材料的表征

Uio-66-NH2材料的结构形貌与反应时间和溶剂有关，图2A为本实验合成的Uio-66-NH2形貌图，Uio-66-NH2具有规则的立方体结构，与文献相符[17]。另外，对该材料进行了XRD分析(图2B)，可观察到Uio-66-NH2有两个窄而高的特征峰：2θ=7.34°和2θ=8.48°，与文献报道相符[17]。

2.2 传感器的实验原理

为验证MOFs-适配体荧光法检测沙门氏菌的可行性，先测定FAM标记的适配体溶液的荧光(图3a)，再向适配体溶液中加入Uio-66-NH2材料溶液，反应30 min后，离心取上清液测定其荧光(图3d)，之后向体系中加入浓度分别为102 cfu/L和104 cfu/L的沙门氏菌，作用40 min后离心取上清液测定此时的荧光(图3曲线c、b)。曲线d的荧光相比曲线a有较大程度的猝灭，猝灭效率EQuench=90.93%，随着沙门氏菌的加入，体系荧光出现了不同程度的恢复，且沙门氏菌的浓度越大，荧光强度越大，说明该传感器的设计可行。

2.3 实验条件对响应信号的影响

沙门氏菌ATCC 14028、金黄色葡萄球菌ATCC 29213、单增李斯特菌 ATCC 19115、阪崎杆菌ATCC 12868和大肠杆菌ATCC 25922均由深圳市出入境检验检疫局食检中心提供。氯化锆(ZrCl4)、邻氨基对苯二甲酸和N,N-二甲基甲酰胺(DMF)均购自Sigma Aldrich公司，三羟基甲基氨基甲烷(Tris)和修饰有荧光素(FAM)的沙门氏菌适配体由上海生工生物科技有限公司提供。适配体冻干粉末均保存在-20 ℃，使用前配成10 mol/L的溶液于4 ℃保存。沙门氏菌冻干粉末保存在-20 ℃，使用前用水配成溶液于4 ℃保存。其它化学品为分析纯及以上纯度试剂，未进一步纯化。实验用水为Milli-Q系统净化的超纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm)。

本研究克服了现有致病菌检测技术特异性不高、灵敏度低，操作繁琐耗时、假阳性率高等不足，利用金属有机骨架材料的荧光猝灭特性以及对核酸适配体的吸附性，结合核酸适配体的高亲和力与高特异性识别能力，建立了一种快速、准确可靠、灵敏、特异性高的沙门氏菌检测方法。

2.3.3 实验温度 温度不仅影响适配体的构型和FAM的荧光效率，同时也影响沙门氏菌的活性。考察了不同温度(25、30、35、40、45、50 ℃)下Uio-66-NH2材料-适配体-沙门氏菌体系的荧光强度，结果显示随着温度升高，荧光强度呈先增大后减小的趋势，40 ℃时荧光最强。在维持较大荧光信号的前提下，兼顾沙门氏菌的活性，故选择人体正常温度37 ℃作为最佳工作温度。

图4 传感器响应时间优化图 Fig.4 Time optimization of biosensor A：fluorescence quenching of aptamer(100 nmol/L) in Tris-HCl buffer by Uio-66-NH2(50 μg/mL)as a function of time;B：fluorescence restoration of aptamer-MOFs in Tris-HCl buffer by salmonellae(102 cfu/mL) as a function of time;excitation：480 nm,emission：520 nm

2.3.4 荧光体系的响应时间与稳定性考察 Uio-66-NH2材料对适配体的吸附以及适配体结合沙门氏菌后从材料表面脱附的过程均需一定的时间，加之沙门氏菌与其适配体的结合也需一定的时间。如果作用时间过短，材料尚未完全吸附适配体或沙门氏菌还未与其适配体充分结合，将会严重影响传感器的灵敏度和稳定性；若作用时间过长，适配体在材料上吸附很牢固，加入的沙门氏菌需要更长的时间脱附，不能满足传感器快速检测和现场检测的需求，所以非常有必要对传感器的响应时间进行优化。实验对传感器的两个响应阶段进行了时间优化，分别对应适配体在材料上的吸附阶段(图4A，猝灭阶段)，以及适配体结合沙门氏菌从材料上脱附的阶段(图4B，恢复阶段)。结果表明：当材料与适配体反应20 min后体系的荧光值达到最低，此时体系的荧光猝灭效率EQuench=89.76%，继续延长作用时间，体系的荧光猝灭效率未增大，所以猝灭阶段的适宜时间为20 min；当吸附在材料上的适配体与沙门氏菌孵育30 min后，体系荧光的恢复开始趋于平台期，此时荧光恢复效率为ERecover=285.7%。由此选定恢复阶段的响应时间为30 min。

将含有Uio-66-NH2材料-适配体的Tris-HCl缓冲体系密封避光储存在4 ℃的冰箱中，2 d后检测，荧光信号无显著变化；5 d后，荧光强度下降5.5%，表明该体系具有良好的稳定性。

图5 传感器对沙门氏菌检测的线性考察 Fig.5 Linear study of biosensor for detecting salmonellae A：fluorescence spectra after incubation with varying concentrations of salmonellae(a-e)：101,102,103,104,105 cfu/mL;FAM-aptamer=100 nmol/L,Uio-66-NH2=50 μg/mL； excitation：480 nm,emission：520 nm；insert:plot of fluorescence intensity versus the logarithm of salmonellae concentration

2.4 线性范围与检出限

在优化实验条件下，利用设计的传感器对沙门氏菌进行检测，不同浓度的沙门氏菌对体系荧光具有不同程度的恢复，当沙门氏菌在101～105 cfu/mL浓度范围内时，荧光强度(y)与浓度对数(x,cfu/mL)呈线性相关(y=58.31x+56.79，r=0.997 8)，检出限(S/N=3)为7 cfu/mL(图5)。与沙门氏菌其它检测方法的对比结果(表1) 表明，本方法将适配体的特异性识别与MOFs荧光猝灭特性相结合，具有较高的灵敏度和分析效率。

所有荧光光谱均在F4600(HITCHE F4600)荧光光谱仪上采集(激发波长为480 nm，发射波长为520 nm)；场发射扫描电镜(FESEM)图谱通过美国FEI公司Nova Nano SEM 250型仪器测得；X射线衍射(XRD)数据通过日本理学株式会社Rigaku-mini flex600型仪器测得；超声分散均在KQ-50B型超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)上完成；Tris-HCl的pH值调节借助Bante920精密pH/ORP计(上海般特仪器有限公司)；微量电子天平Sartorius BT25S(德国赛多利斯集团)。

2.5 特异性研究

本方法的特异性取决于所用适配体对沙门氏菌的特异性结合能力。本实验分别考察了该方法对其它4种致病菌(金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎杆菌、大肠杆菌)的检测结果，检测步骤与沙门氏菌一致。结果显示，与目标菌沙门氏菌所引起的荧光强度相比，这4种致病菌在浓度10倍于沙门氏菌的情况下，荧光强度是沙门氏菌信号的五分之一甚至更低，表明本方法对沙门氏菌具有高特异性检测，对其它致病菌不具有特异性。

表1 沙门氏菌常用检测方法对比 Table 1 Comparison of detection methods for salmonellae

MethodSampleResponsing durationDetection limit(cfu/mL)Linear range(cfu/mL)ReferenceTradional methodLive stock meat and poultry meat 4～7 d--[3]ImmunoassayBeef and chicken meat～6 h70103～106[4]PCRChicken meat～24 h1.01～105[6]DNA microarrayBeef,fish and milk～1.5 h5.0×102-[8]Electrochemical immunosen-sorEggs,chicken meat～40 min3.0×103104～109[10]Microfluidic nano-biosensorChicken extract～2 h103103～106[12]Surface plasmon resonance immunosensor-～1.5 h141.4×101～1.4×109[13]MOFs-aptamerShrimp samples～50 min7.0101～105This method

2.6 实际样品的分析

将20 g冷冻的新鲜虾肉绞碎，与230 mL含3% NaCl的碱性蛋白胨混合均质5 min，室温下静置30 min，待沉淀大颗粒和悬浮物后，取上清液作为实际样品，测定其中的沙门氏菌。取5份虾肉样品平行检测。

罗爹爹是老寒腿，天一凉就要拄拐棍，走路奇慢。阿里先是跟在他的身后，突然记起姆妈的话。姆妈说过，罗爹爹腿疼，要去搀他。阿里便嘟着嘴，上前了几步，把自己的胳膊递给罗爹爹。

传统的财务管理体系，难以应对企业合并重组过程中所产生的财务风险。因此财务部门应统一各环节的财务管理目标，以降低财务风险。例如，财务部门首先要建立起财务交接制度，在该制度中物资变化都应得到责任人的确认。当盘点中出现物资缺失的情况时，责任人将承担赔偿责任。其次，财务部门应在合并重组的过程中，成立闲置资产处置小组。该小组可对企业的产能进行有效评估，从而确定出闲置设备。同时该小组也应当在市场中了解这部分设备的公允价值，并依据市场环境设置浮动范围。若出售价格高出公允价值，处置人应当得到相应的奖励。

纸张加工就是对纸张进行处理来产生肌理效果，把纸揉皱，利用了纸张的折列痕迹的渗透来产生肌理效果，使画面具有朦胧、苍古的美感。在纸张加工的方法中，揉纸是最为常见和简单的一种肌理技法。揉纸法可以分为“干揉法”和“湿揉法”。

向5份虾肉样品的上清液中分别注入不同浓度的沙门氏菌(1.0×103～ 5.0×103 cfu/mL)，每个浓度均经平板计数法证实，37 ℃条件下孵育后对样品中的沙门氏菌再次检测。检测结果如表2所示，5份虾肉样品中均未检出沙门氏菌，加标实验的相对标准偏差(RSD)为5.9 %～7.8 %，回收率为90.0%～108.0%。由此可见，本方法具有较高的准确度和精密度，适合实际样品分析。

表2 Uio-66-NH2材料-FAM标记适配体荧光检测虾肉样品中沙门氏菌 Table 2 Detection of salmonellae in shrimp samples by fluorescence based on Uio-66-NH2 material and FAM labelled apatmer

SampleConcentration of salmonellae(1.0×103 cfu/mL)Found before addingSalmonellae addedFound after adding**Recovery(%)RSD(%)1-*1.00.9 ± 0.0690.06.72-2.02.1 ± 0.13105.06.23-3.02.9 ± 0.1796.75.94-4.04.1 ± 0.29102.57.15-5.05.4 ± 0.42108.07.8

*not detection ;**the average ± the standard deviation(n=5)

3 结 论

本研究合成的Uio-66-NH2可以均匀分散于水溶液中并稳定存在，对核酸适配体具有较强的亲和力，基于这种MOFs构建了特异性识别沙门氏菌的新方法，荧光信号与沙门氏菌浓度的对数在101～105 cfu/mL范围内呈良好的线性关系，检出限为7 cfu/mL。该传感器在虾肉样品中的加标回收率为90.0%～108.0%，RSD为5.9%～7.8%，并具有良好的稳定性和选择性。该传感器稳定，制备简单，适用于多种生物分子的检测，具有良好的应用前景。

参考文献：

[1] Yang L,Hu W Z,Jiang A L,Feng K,Wang X.Sci.Technol.Food Ind.(杨柳，胡文忠，姜爱丽，冯可，王馨.食品工业科技)，2016,37：372-379.

[2] GB4789.4-2010.National Food Safety Standard.Food Microbiological Examination：Salmonellae.Ministry of Health of the People's Republic of China(食品安全国家标准 食品微生物学检验：沙门氏菌检验.中华人民共和国卫生部)，2010.

[3] Lü S L,Wei C Y,Yao X T,Li X G.Appl.Prevent.Med.(吕素玲，韦程媛，姚雪婷，李秀桂.应用预防医学)，2012,18(3):137-141.

[4] Herzig G P D,Aydin M,Dunigan S,Shah P,Jeong K C,Park S H,Ricke S C,Ahn S.J.Food Saf.,2016,36(3)：1395-1401.

[5] Pandey S K,Vinayaka A C,Rishi D B,Rishi P,Suri C R.Anal.Chim.Acta,2014,(841)：51-57.

[6] Alves J,Hirooka E Y,de Oliveira T C R M.LWT-Food Sci.Technol.,2016,72：175-181.

[7] Li J J,Zhai L G,Bie X M,Lu Z X,Kong X H,Yu Q,Lv F X,Zhang C,Zhao H Z.Food Control,2016,(60)：230-236.

[8] Li Y J.Anal.Sci.,2016,32(2)：215-218.

[9] Deng X L,Zhang Y Y,Yuan H J,Liu S S,Chen Y Y,Gao W L,Zhou H B,Jia C P,Zhao J L,Bian X J.J.Instrum.Anal.(邓雪蕾，张苑怡，袁浩钧，刘松生，陈莹莹，郜晚蕾，周洪波，贾春平，赵建龙，卞晓军.分析测试学报)，2017，36(10)：1191-1196.

[10] Fei J F，Dou W C，Zhao G Y.Microchim.Acta，2015，182(13/14)：2267-2275.

[11] Sheikhzadeh E,Chamsaz M,Turner A P F,Jager E W H,Beni V.Biosens.Bioelectron.,2016,80：194-200.

[12] Kim G,Moon J H,Moh C Y,Lim J G.Biosens.Bioelectron.,2015,67：243-247.

[13] Liu X,Hu Y X,Zheng S,Liu Y,He Z,Luo F.Sens.Actuators B,2016,230：191-198.

[14] Zhao B,Cui F Y,Xu Y,Zhao X F,Li Z Q.J.Instrum.Anal.(赵斌，崔飞云，徐溢，张晓凤，李泽全.分析测试学报)，2017,36(11)：1318-1324.

[15] Brandäo D,Liébana S,Pividori M I.New Biotechnol.,2015,32(5)：511-520.

[16] Joshi R,Janagama H,Dwivedi H P,Kumar T M A S,Jaykus L A,Schefers J,Sreevatsan S.Mol.Cell Probe,2009,23：20-28.

[17] Kandiah M,Nilsen M H,Usseglio S,Jakobsen S,Olsbye U,Tilset M,Lillerud K P,Larabi C,Quadrelli E A,Bonino F.Chem.Mater.,2010,(22)：6632-6640.