烟草特有N-亚硝胺(Tobacco-specific N-nitrosamines,TSNAs)是一类存在于烟草及烟草制品中的N-亚硝胺类化合物，包括N-亚硝基降烟碱(NNN)、4-(N-甲基亚硝胺)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)、N-亚硝基新烟草碱(NAT)、N-亚硝基假木贼碱(NAB)等[1]。TSNAs由烟草生物碱亚硝化作用而产生，对肺部、口腔、食道、胃、胰脏、肝脏等部位有较大危害[2]。随着人们对健康的重视，对TSNAs进行准确检测对烟草的降焦减害研究具有重要的指导意义。目前，检测主流烟气中TSNAs较为常用的分析方法主要有气相色谱-热能分析法(GC-TEA)[3-4]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[5-6]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[7-10]和超高效液相色谱-电喷雾串联质谱法(UPLC-MS/MS)[11-12]等。

磁固相萃取技术(Magnetic solid phase extraction,MSPE)是基于具有超顺磁性的磁性材料所发展的新型样品前处理技术，具有富集倍数高、操作简便、有机溶剂用量少、吸附容量大、在外加磁场作用下可实现快速分离等优点，在环境分析和生物医药等领域中已得到广泛应用[13-17]。而目前主流烟气中TSNAs含量极微，一般浓度在ng/支数量级。近些年，随着越来越多低焦油卷烟的上市，以及新型烟草制品的发展，如电子烟、加热不燃烧卷烟等，对复杂背景干扰下低含量TSNAs的检测提出了更高的要求。目前常用的主流烟气中TSNAs的检测方法是将样品萃取液直接上机检测，但对于低含量的TSNAs存在测不出或测不准等问题。本文引入磁固相萃取技术，利用磁性材料富集倍数高、可快速分离等优点，可以更加准确地检测到复杂背景干扰下低含量烟草制品主流烟气中的TSNAs成分。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

参比卷烟3R4F；国内市售卷烟6种；网购注油式电子烟6种。

标准样品NNN、NNK、NAB、NAT、NNN-d4、NNK-d4、NAB-d4、NAT-d4(纯度均>98%，Toronto Research Chemicals,Canada)；实验用水由Milli-Q 超纯水仪制备(18 MΩ·cm)；乙酸、乙酸铵、硝酸、氢氧化钠、氨水(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；甲醇(色谱纯，J.T.Baker,USA)。

1260-6460 型高效液相色谱-串联质谱联用仪(Agilent公司,USA)；RM200转盘吸烟机(Borgwaldt公司,Germany)；SM450直线吸烟机(Cerulean公司，英国)；DF-101S型智能集热式恒温加热磁力搅拌器(上海东玺制冷仪器设备公司)，RW 20 digital 型电动搅拌机(IKA公司,Germany)，DZG-6020型真空干燥箱(上海森信实验仪器厂);0.22 μm水相滤膜(深圳铭科化工有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒的制备 制备由200 mL超纯水、11.68 g FeCl3及4.3 g FeCl2组成的混合液，水浴加热至85 ℃，加入50 mL氨水，机械搅拌30 min，将反应物用磁铁分离。将沉降在底部的颗粒用超纯水洗涤至清洗液呈中性，再用乙醇洗涤，封存备用。

由图1可知，加入添加剂对初始熔化温度有明显降低效果，添加量在2%时，氧化硼和碳酸钠将初始熔化温度由1 050 ℃降至700 ℃左右。添加10%氧化硼则降至400 ℃；硼砂对初始熔化温度降低的影响呈现缓慢降低的趋势，在添加8%时达到最低温度590 ℃。碳酸钠则在10%时达到最低温度691 ℃。

本研究所用益气固本胶囊用于哮喘病缓解期的治疗，具有益气养阴、补肺脾肾的功效。诸药合用达到补肺助其宣降以清痰窠，健脾助其运化以绝痰源，补肾壮其元气以充肺根，从而除伏痰，铲夙根，临床运用多年，有巩固疗效、降低哮喘复发率的作用[12-14]。本研究旨在研究益气固本胶囊是否有可能通过调节免疫失衡而发挥治疗哮喘的作用，观察不同剂量益气固本胶囊对哮喘小鼠CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞数量及IL-33、TNF-α表达水平的影响，丰富其治疗哮喘的理论依据。

将上一步反应得到的Fe3O4投入100 mL无水乙醇中，搅拌均匀后取出50 mL待用。用冰醋酸将150 mL乙醇和50 mL丙三醇的混合液调至pH 4.5，加入8 mL 四乙基原硅酸盐(TEOS)，搅拌均匀后与50 mL Fe3O4的无水乙醇溶液混合，通氩气水浴加热至93 ℃，恒温反应2 h,将反应物用磁铁分离。

需求情况：农业需求方面，秋季市场逐步启动，受原料、出口等利好因素支撑，二铵交投氛围整体向好，下游陆续采购，询价明显增多。出口方面，目前仍处于出口旺季，印度、巴基斯坦和孟加拉等南亚市场需求陆续释放，中国企业出口签单价格保持在418美元/吨FOB。

TSNAs标准系列溶液：各标准品用甲醇溶解后，用10 mmol/L乙酸铵水溶液逐级稀释得6级标准工作溶液，内标质量浓度为2.5 μg/L。配制好的标准溶液和内标溶液于-20 ℃冰箱保存。

2.1.5 洗脱体积的影响 固定乙酸浓度为1 mol/L，考察了乙酸溶液的体积对TSNAs洗脱效果的影响。用10 mg Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒萃取20 mL样品，以1 mol/L乙酸溶液进行多次洗脱，每次洗脱体积为2 mL，取1 mL洗脱液进入HPLC-MS/MS分离检测。结果显示，在经过第2次洗脱后，洗脱液中TSNAs的信号值已基本与空白信号值相当，说明材料吸附的TSNAs已被完全洗脱下来。乙酸溶液的洗脱机理是基于破坏两相之间的离子交换作用，其效果可叠加，因此本方法选择乙酸的体积为4 mL。

图1 Fe3O4@SiO2@MAA的合成原理图 Fig.1 Schematic of Fe3O4@SiO2@MAA

1.2.2 标准工作溶液的配制 内标溶液：配制质量浓度分别为1 mg/L的 NNN-d4、NNK-d4、NAT-d4、NAB-d4的甲醇溶液作为内标溶液。

将230 mL水、120 mL乙醇和300 μL甲基丙烯酸(MAA)充分混匀，置于三口烧瓶中。以50 mg AIBN作为引发剂、2.15 mL三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(TRIM)作为交联剂溶于15 mL 甲苯中，充分溶解后加入50 mL 水和1 g Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒，超声10 min，然后将该混合物逐滴加入三口烧瓶中，通氩气水浴加热至70 ℃，在300 r/min的机械搅拌下恒温反应12 h。反应物用乙醇和超纯水依次洗涤至清洗液呈中性，于60 ℃下烘干。烘干后的Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗沉降速度明显较慢，说明MAA共聚物能很好地键合在Fe3O4@SiO2表面。图1为Fe3O4@SiO2@MAA 的合成原理图。

1.2.3 样品处理及分析 卷烟主流烟气的捕集按照国家标准GB/T 164-2004进行，使用转盘吸烟机抽吸20支低焦油卷烟，用剑桥滤片截留主流烟气总粒相物，剑桥滤片经40 mL 10 mmol/L乙酸铵水溶液超声萃取40 min；电子烟的主流烟气通过直线吸烟机进行捕集，用剑桥滤片截留抽吸100口后的主流烟气中的总粒相物，剑桥滤片经40 mL 10 mmol/L乙酸铵水溶液超声萃取40 min。

取20 mL萃取液于烧杯中，用硝酸或氢氧化钠溶液将样品溶液的pH值调至4.0，向其中加入10 mg Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒，超声萃取4 min。然后将烧杯靠近钕铁硼磁铁，磁性纳米颗粒在磁场的作用下迅速移动至烧杯侧壁，弃去样品溶液，并用滴管吸掉附在壁上的样品溶液。移开钕铁硼磁铁，将磁性纳米颗粒重新分散在4 mL 1 mol/L的乙酸水溶液中，超声解吸12 min用于洗脱吸附在Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒上的TSNAs。最后将1 mL洗脱液经0.22 μm水相滤膜过滤后引入HPLC-MS/MS进行检测。其萃取分离原理图如图2所示,Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒在外加磁场的作用下可实现快速分离，样品溶液澄清，经过简单的过滤即可直接进样。

2.1.2 样品体积的影响 样品体积的大小将直接影响Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒吸附TSNAs的效率。在较大的样品体积中，Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒将分散得更为均匀，与溶液中的TSNAs接触面积更大，从而更有利于萃取效率的提高。本实验固定样品溶液中TSNAs的绝对量为40 ng，考察了样品体积在10～40 mL范围时对TSNAs吸附效率的影响，结果表明，样品体积对TSNAs的吸附无明显影响。为了提高富集倍数，同时考虑到实际样品选用的萃取液体积为40 mL，本方法最终选用样品体积为20 mL。

图2 萃取分析过程 Fig.2 Schematic for extraction

仪器条件：ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(5 μm,4.6 mm×250 mm)，柱温40 ℃，流速0.4 mL/min；流动相:A为10 mmol/L 乙酸铵水溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序：90%A(0～1.0 min),90%～50%A(1.1～3.0 min)，50%～40%A(3.1～8.0 min)，40%～10%A(8.1～9.0 min)，10%A(9.1～10.0 min),90%A(10.1～12.0 min)；进样量5 μL。电离方式：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM，见表1)；鞘气温度：350 ℃；鞘气流速：11 L/min；毛细管电压：3 500 V；驻留时间40 ms。

表1 TSNAs及其内标物的质谱检测参数 Table 1 MS parameters of TSNAs and internal standards

CompoundPrecursor ion(m/z)Product ion(m/z)CE/eVCompoundPrecursor ion(m/z)Product ion(m/z)CE/eVNNN178.1148.1,105.19,17NNN-d4182.1124.1,152.115,9NNK208.1122.1,79.19,9NNK-d4212.1126.1,152.19,7NAT190.1160.1,79.15,33NAT-d4194.1164.1,110.15,9NAB192.1162.1,133.19,21NAB-d4196.1166.1,137.19,21

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 样品溶液pH值的影响 本文所使用的萃取材料为Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒，其表面的功能基团为羧基，能与溶液中呈阳离子形式存在的TSNAs发生离子交换从而实现萃取，因此，TSNAs在水溶液中完全电离成阳离子状态后更有利于萃取。实验考察了样品溶液的pH值在2.0～7.0范围时Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒对TSNAs萃取效率的影响。该萃取体系存在水分子、TSNAs以及Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒表面羧基的电离平衡。随着pH值变小，TSNAs的电离平衡向生成更多阳离子的方向移动，有利于萃取效率的提高，故在pH 4.0～7.0之间，随pH值减小，萃取效率呈增高的趋势；但pH值过小将抑制Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米粒子表面羧基的电离，且溶液中过多的自由氢离子将与呈阳离子状态的TSNAs发生竞争吸附，故pH值在2.0～4.0间时，pH值越小，萃取效率越低。因此实验选择样品溶液pH值为4.0。

试验前后，按照图3对螺栓孔直径ФB、圆弧端齿处直径ФA进行尺寸计量，分析试验前后的尺寸变化，并进行无损检测，检查试验件有无裂纹。

图3 萃取时间对TSNAs萃取效率的影响 Fig.3 Effect of the extraction time on the extraction of TSNAs

2.1.3 萃取时间的影响 Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒的萃取过程是基于平衡萃取的过程，萃取效率在一定的萃取时间后将达到平衡。实验考察了萃取时间为1～8 min时材料对TSNAs吸附效率的影响，由于Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒处于纳米级别，比表面积大，活性位点多，因此萃取过程可在短时间内达到平衡。研究结果显示，萃取4 min后，TSNAs的吸附效率基本不变(图3)。综合考虑分析速度和精密度，本方法最终选用萃取时间为4 min。

2.1.4 洗脱剂浓度的影响 本方法中的TSNAs通过阳离子交换作用吸附在羧基改性的磁性纳米粒子上，溶液中足量的H+或者OH-能破坏材料上的羧基与TSNAs上离子的交换作用，实现对TSNAs的洗脱。常用洗脱液中缓冲溶液的洗脱基于竞争吸附，洗脱效果较差；强酸碱溶液可能会对材料的涂层造成破坏，因此实验选择弱酸碱溶液进行洗脱。结果表明，弱碱性洗脱液(1 mol/L NH3·H2O溶液)会破坏Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒，因此选用弱酸性溶液——乙酸水溶液作为洗脱剂。随着乙酸溶液浓度的增加，溶液的pH值变小，当pHKa(羧基)时，Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒表面的羧基几乎不电离，从而破坏羧基与TSNAs的作用力，实现洗脱。本实验考察了乙酸(HAc)体积分数在2%～16% 范围时对TSNAs洗脱效果的影响，结果显示，HAc 的体积分数大于4%后TSNAs的浓度值维持不变，即0.7 mol/L HAc即可破坏Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒与TSNAs的离子交换作用。为保证洗脱液能够完全解吸Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒表面的TSNAs，并且考虑到洗脱液浓度对洗脱时间的影响，实验选用HAc 的体积分数为6%,即1 mol/L的乙酸水溶液。

爱国主义是共产主义道德的重要规范之一，与国际主义相统一，既从本国人民的利益出发，也从世界人民的共同利益出发。习近平总书记指出：“一个国家要发展繁荣，必须把握和顺应世界发展大势，反之必然会被历史抛弃。什么是当今世界的潮流? 答案只有一个，那就是和平发展，合作共赢。”[注]中共中央宣传部：《习近平谈治国理政》，北京：外文出版社，2014 年，第266页。爱国主义必须要适应当今世界和平发展、合作共赢的潮流，将实现中国梦与建设和谐世界、构建人类命运共同体有机地结合起来。

美丽乡村建设项目的业主单位、设计团队、施工单位和属地村民等各方主体应本着共同参与、配合互动、协商妥协的理念，以美丽乡村规划设计为纲领，通过陪伴式服务（含驻地式指导），采用乡土材料和适用技术，准确、经济、有效地建设美丽乡村。

2.1.6 洗脱时间的影响 考察了洗脱时间(2～18 min)对4种TSNAs洗脱效果的影响。本方法采用超声洗脱的方式，可有效缩短洗脱时间；但由于采用1 mol/L的HAc溶液作为洗脱液，浓度和酸度较低，故洗脱时间相对较长。实验结果表明，洗脱12 min后，TSNSs的浓度值基本达到平衡。因此，为了保证能够完全洗脱吸附在材料上的TSNAs，实验选择洗脱时间为12 min。

2.2 分析性能

2.2.1 工作曲线与检出限 制备4种混合标准品的甲醇溶液，用10 mmol/L乙酸铵水溶液进行逐级稀释得质量浓度为0.05、0.1、0.5、1、5、10、50、100、500 μg/L的混合系列标准工作溶液，标准工作溶液按照本方法进行分析，以各分析物的色谱峰面积与内标峰面积之比(X)为横坐标，各分析物的质量浓度(Y，μg/L)为纵坐标进行线性回归，得标准曲线方程及相关系数(r2)。 将最低浓度的各标样进行10次重复进样分析，计算标准偏差。分别以3倍和10倍标准偏差计算得方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。结果如表2所示，各目标化合物的线性范围分别为NNN 0.10～500 μg/L，NNK 0.17～500 μg/L，NAT 0.42～500 μg/L，NAB 0.48～500 μg/L，LOD和LOQ分别为0.03～0.14 μg/L和0.10～0.48 μg/L。各目标物的标准曲线线性关系良好，方法具有较高的灵敏度。

2.2.2 重复性与回收率 平行处理6份QC样品，以考察方法的重复性，实验结果见表2。结果表明，4种TSNAs的相对标准偏差(RSD)均小于5%。同一样品日内重复进样6次，得日内RSD为2.3%～4.7%；同一样品连续进样4 d，每天重复进样6次，得日间RSD为2.9%～4.6%。将目标分析物的标准溶液加入样品萃取液中，制备加标溶液，4种TSNAs的平均回收率为88.3%～112.8%。可见，本方法重复性和回收率良好，能够满足分析要求，适用于低焦油卷烟和电子烟产品主流烟气中TSNAs的定量分析。

表2 TSNAs的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量下限、重复性及回收率 Table 2 Linear ranges,standard equations，correlation coefficients，LODs,LOQs,repeatabilities and recoveries of TSNAs

CompoundLinear range/(μg·L-1)Standard equationr2LOD/(μg·L-1)LOQ/(μg·L-1)RSD(Intra-day)/%RSD(Inter-day)/%Recovery/%NNN0.10～500Y=0.784 4X+0.189 90.999 70.030.102.32.9112.8NNK0.17～500Y=0.841 3X+0.396 80.999 30.050.172.93.7101.4NAT0.42～500Y=0.531 3X+0.486 00.999 50.120.423.94.194.6NAB0.48～500Y=1.307 4X+0.148 30.999 20.140.484.74.688.3

2.3 实际样品的分析

选择6种市售的低焦油卷烟和6种网购的注油式电子烟按“1.2.3”方法处理后进行检测，结果如表3所示。结果表明，本方法基本满足低焦油卷烟主流烟气中TSNAs的检测要求，并在注油式电子烟产品中检出了NNK。目前，NNK已被国内烟草行业列为卷烟烟气7种有害成分之一。

表3 低焦油卷烟及电子烟主流烟气中NNN、NNK、NAT、NAB的含量测定结果 Table 3 Contents of NNN,NNK,NAT,NAB in the mainstream smoke of low tar cigarette and electronic cigarette w/(ng·cig-1)

No.NNNNNKNATNABL.C-1(ng/支)5.4310.424.780.92L.C-2(ng/支)124.8815.8765.836.41L.C-3(ng/支)86.3712.9744.074.38L.C-4(ng/支)3.893.9215.121.34L.C-5(ng/支)13.936.2437.633.54L.C-6(ng/支)10.963.8714.421.12E.C-1(ng/口)----E.C-2(ng/口)-1.04--E.C-3(ng/口)1.08---E.C-4(ng/口)1.090.731.17-E.C-5(ng/口)----E.C-6(ng/口)--1.14-

L.C：low tar cigarette,E.C：electronic cigarette,-：not detected

3 结 论

本文合成了Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒，并对样品前处理条件进行优化改进，建立了主流烟气中TSNAs的MSPE/HPLC-MS/MS分析方法。Fe3O4@SiO2@MAA磁性纳米颗粒为具有核壳结构的颗粒物，具有分析速度快、吸附容量高以及抗干扰能力强等特点，以此建立的磁固相萃取技术适用于主流烟气中TSNAs的分析。本方法中4种目标分析物的定量下限为0.10～0.48 μg/L，加标回收率及日内、日间精密度高，可满足复杂卷烟烟气背景下痕量TSNAs的检测要求。

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