植物内生真菌是指在植物的部分或全部生长史中，生活在健康植物组织和细胞间，但又不引起任何病症的真菌[1]。近年来，对内生真菌的研究提示，内生真菌具有促进宿主植物的生长以及增加宿主抵抗逆境的能力，甚至还能促进宿主活性成分的合成和积累[2-4]，这些内生真菌特殊的生物学特性表明内生真菌在药材的生长以及道地性形成中具有至关重要的作用[5]。此外，内生真菌还表现出生长区域专属性，即不同产地的同一种药材其内生真菌群落分布具有差异性[6]，这使得内生真菌成为研究药材道地性形成的重要因子。

霍山石斛(Dendrobium huoshanense)又称米斛，是安徽省道地药材。本研究以不同产地以及不同栽培方式下的霍山石斛为样本，运用DNA分子标记技术，在确定各样本均为霍山石斛(Dendrobium huoshanense)同属种的基础上，探讨在不同生境下霍山石斛内生真菌群落分布的特征性，以期能够从内生真菌角度，为建立新的药材道地性鉴别模式奠定科学基础。绿盾测序(Green Shield Sequencing，GSS)是由Illumina高通量测序技术改进的最新测序技术，其不仅具有高通量、高灵敏度、高准确性和低运行成本的特点，还可以从源头上消除宿主植物样本中叶绿体和线粒体序列带来的干扰，还原样本中微生物群体的真实比例。这为更全面地探讨霍山石斛内生真菌的分布提供了技术保障。

1 材料

霍山石斛样品来源：六安霍山(盆栽)，六安霍山(地栽)，六安霍山(树栽)，安徽中医药大学药园(盆栽)和宣城泾县(盆栽)，共5种来源，每种来源平行采集3份样品。LP0、LP1、LP2：六安霍山(盆栽)；LD0、LD1、LD2：六安霍山(地栽)；LS0、LS1、LS2：六安霍山(树栽)；HP0、HP1、HP2：安徽中医药大学少荃湖校区药园(合肥，盆栽)；JP0、JP1、JP2：宣城泾县(盆栽)。以上样品均采集于2017年8月。

2 霍山石斛样品种质鉴定

2.1 样品处理 将每种来源采集的霍山石斛样品各取一份，编号分别为LP0、LD0、LS0、HP0、JP0，送至中国中医科学院中药资源中心，采用DNA分子标定技术并以中国中医科学院中药资源中心内控标准——霍山石斛的特异性PCR鉴别法为执行标准进行鉴定。每份样品取0.1 g，置球磨粉碎仪中充分研磨粉碎加适量液氮研磨至能过五号筛。

2.2 DNA提取 取待测霍山石斛样品粉末0.05 g于2.0 mL微量离心管中，加入1 000 μL已灭菌的前处理缓冲液、0.02 g PVP 40、10 μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65 ℃水浴1 h，期间轻摇2～3次；结束后取出冷却至室温(25 ℃)，12 000 ×g离心10 min，弃上清；加入1 000 μL已灭菌的CTAB提取缓冲液、0.02 g PVP 40、10 μL β-巯基乙醇充分振荡混匀，65 ℃水浴30 min，结束后取出冷却至室温(25 ℃)；加入900 μL氯仿-异戊醇(容积比24∶1)，充分振荡混匀，12 000 ×g离心10 min；转移750 μL上层清液至另一新的2.0 mL的微量离心管中，加入750 μL氯仿-异戊醇(容积比24∶1)，充分振荡混匀，12 000×g离心10 min；转移500 μL上层清液至另一新的2.0 mL微量离心管中，加入330 μL异丙醇溶液，置-20 ℃放置1 h；取出，12 000×g离心10 min，弃上层清液，加入70%乙醇 500 μL漂洗1 min，12 000×g离心5 min，弃上清；再加入70%乙醇 500 μL漂洗1 min，12 000×g离心5 min，弃上清；加入无水乙醇500 μL漂洗1 min，12 000×g离心5 min，弃尽上清；将具有DNA沉淀的微量离心管水平放置于37 ℃孵箱30 min挥干乙醇，加入50 μL灭菌水溶解沉淀，-20 ℃保存。

2.4 凝胶电泳 取PCR扩增产物，加入5 μL 6倍上样缓冲液混匀后，取5 μL于GelRed染色的2%琼脂糖凝胶电泳检测，阳性对照为23-17(霍山石斛，太平畈)；阴性对照：TPSH-01(铁皮石斛，安徽泾县)；空白对照(双蒸水)。电泳结束后，取凝胶片在凝胶成像仪上以DL 2 000 DNA作为分子量标准(应含有100、250、500、750、1 000 bp条带)观察、成像。

2.3 聚合酶链式反应 霍山石斛特异性鉴别引物：HSSH-210正向引物序列: 5′-TTGATTGGATTGAGCCTTG-3′和HSSH-210反向引物序列：5′-GGTTTTTAGCTACTAACGTAACAC-3′。在200 μL的PCR管中依次加入10×PCR缓冲液2.5 μL、dNTP混合液(总浓度为10 mmol/L)1 μL、鉴别引物溶液(含正向和反向引物)各0.25 μL、Taq DNA聚合酶1 U、模板DNA 1 μL，用无菌双蒸水补足反应容积至25 μL。将反应液振荡混匀，瞬时离心。将PCR管置PCR仪内进行PCR反应。反应参数：95 ℃预变性 5 min，循环反应 35次 (95 ℃ 20 s, 60 ℃ 20 s, 72 ℃ 30 s), 72 ℃延伸 7 min，获得扩增产物。取出PCR管，对反应产物进行检测或置4 ℃下保存。

因此，可以使用多种数据展示方法观测样本在不同分类水平上的群落结构或组成差别。将多个样本放在一起比较时，还可以观测群落组成在一定条件下的变化情况。

3 霍山石斛内生真菌的检测

汽车电子学发展非常迅速,知识更新快,在教学内容的选择上注意追踪学科领域前沿发展变化,将新的研究成果和技术及时吸纳并且融入到教学中来。例如:用两个学时介绍汽车电子系统领域的高级驾驶辅助系统(ADAS)的最新成果;讲解汽车电子总线的时候,不仅介绍目前普遍使用的CAN、LIN、MOST总线,也介绍代表未来方向的正在研发中的FLEXRAY总线。

3.2 DNA提取 使用环境样本DNA提取试剂盒进行基因组DNA抽提后，用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA。

3.3 PCR扩增 按指定测序区域，合成带有Barcode的特异引物ITS3 (5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′) 和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)对样本的ITS区域进行扩增，每个样本进行3次重复，每个PCR反应终止于线性扩增期，PCR结束后将同一样本的PCR产物混合后用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，使用QIAquick凝胶回收试剂盒(QIAGEN公司)切胶回收PCR产物，TE缓冲液洗脱回收目标DNA片段。对PCR产物进行定量并均一化，构建ITS测序文库，利用Illumina平台进行高通量测序，测序试剂盒使用Illumina公司MiSeq Reagent Kit v2。

3.4 数据分析

3.4.1 生物信息学分析 Miseq测序得到的PE reads首先使用FLASH3进行拼接，同时对序列质量进行质控，在去除低质量碱基及接头污染序列等操作过程后完成数据过滤，得到可供后续分析的高质量目标序列。在97%的相似性水平上使用UPARSE算法进行操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTU)聚类，统计样品每个OTU中的丰度信息，OTU的丰度初步说明了样品的物种丰富程度。

3.4.6 热度图(Heatmap) Heatmap用于表示一个或多个组的样品在某一分类水平上的群落组成和丰度。丰度用颜色深浅来表征，颜色越偏红表明该种的丰度越高，越偏蓝表明丰度越低。

3.4.3 群落组成分析 根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样本在各分类水平上的分类学比较情况。在结果中，包含了两类信息：①样本中含有何种微生物；②样本中各微生物的序列数，即各微生物的相对丰度。

3.1 样品处理 将余下的10份霍山石斛样品(LP1、LP2、LD1、LD2、LS1、LS2、HP1、HP2、JP1、JP2)洗净，并对其表面进行无菌操作：75%乙醇漂洗1～2 min，3.5%次氯酸钠漂洗3 min，75%乙醇漂洗30 s，最后用无菌水冲洗4～6次，再用无菌滤纸吸干表面水分，分别装入无菌样品袋中，低温保存。

随着我国社会经济的快速发展，各行各业对电力的需求量也越来越大，这就需要国电力部门对电网进行合理的规划，以满足社会对电力的需要。在电网规划工作中，电力负荷预测发挥着巨大的作用，电力负荷预测的准确性关系着电网规划的质量。传统的电力负荷预测方法有电力弹性系数法、外推法等，在运用过程中，这些预测方法对预测人员的原有经验依赖太大，并且缺乏一定的精确度。在电力事业快速发展的今天，这些传统的电力负荷预测方法已经显得“ 力不从心”

在刘剑文看来，按照此前的个税法案，拥有多项收入的人显然比单项收入的人享受更多优惠，而综合所得征税解决了“看收入不看纳税人”的状况，即收入多的人少交税，收入少的人多交税的问题，体现了对公平的重视。而改变部分劳动性所得的征收模式后，综合性征税的项目会按年汇总综合征税，有利于解决不同收入群体在征税过程中的横纵向不平衡问题。

3.4.4 Alpha多样性分析 通过样本的Alpha多样性分析可以反映微生物群落的丰度、均匀性及多样性等，这其中包括一系列生态统计学分析指数，如Chao1指数、Simpson指数、香农-维纳指数(Shannon-Wiener index)、系统发育多样性指数(Phylogenetic diversity，PD)等，以上丰度指数计算用Mothur 1.30.1软件完成。

3.4.5 Venn图 在OTU分析中，Venn图用于表示多个组样品的OTU共有和独有的情况。

3.4.2 分类学分析 采用uclust分类法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，得到每个OTU对应的物种分类信息。

传统新闻编辑只需要合理管理好信息资源就可以了，这也就是说，之前的新闻编辑就是各个方面信息的控制者，向大众传播怎样的新闻信息的控制权、决定权都在新闻编辑的手上。但是，在媒体融合时代下，这一垄断的局面被打破了，新闻编辑对于新闻信息的控制权极大地被削弱。如果新闻编辑一直保持原有的信息管理理念，那么对新闻信息的控制力很有可能会彻底失去。

4 结果

2、来稿应论点明确，数据可靠，文字精练，各栏目稿件均需附中、英文题名摘要（应详细叙述来稿的研究目的、实验方法和主要结果及数据），并在其后列出3～5个关键词，请附作者简要介绍，每篇稿件请指定一位通讯联系人。

注：M. DL 2000 plus DNA分子量标准；P.霍山石斛阳性对照；1. 样品LS0；2. LD0；3. JP0；4. LP0；5. HP0；N. 阴性对照(铁皮石斛)；B. 空白对照

图1 霍山石斛样品16 S rDNA的PCR产物凝胶电泳图

4.2 霍山石斛样品内生真菌群落组成分析 图2从属水平(Genus)展示了不同生境以及同一生境下霍山石斛内生真菌的群落组成。六安霍山(盆栽)的霍山石斛样本其内生真菌主要分布于Xenopolyscytalum、Botryotinia、Alternaria、Zasmidum、Cystofilobasidium、Oidiodendron、Chalara、Pestalotiopsis等中；六安霍山(地栽)的霍山石斛样本其内生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Pestalotiopsis等中；六安霍山(树栽)的霍山石斛样本其内生真菌主要分布于Xenopolyscytalum、Bot-ryotinia、Alternaria、Cystofilobasidium、Oidiodendron、Chalara、Pestalotiopsis等中；安徽中医药大学药园(盆栽)的霍山石斛样本其内生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Rosellinia、Pestalotiopsis等中；宣城泾县(盆栽)的霍山石斛样本其内生真菌主要分布于Glomerella、Alternaria、Zasmidum、Cystofilobasidium等中。这表明处于不同生境下的霍山石斛其内生真菌群落组成具有一定的差异性。另外，同一来源(即同一生境)下平行的两个霍山石斛样本其内生真菌的相对丰度相差较大，但群落组成基本相同。

图2 样品内生真菌群落分布图

4.3 不同生境下霍山石斛内生真菌的Alpha多样性分析 由图3可知，在内生真菌丰度方面(Chao 1表示)，来源于六安霍山(树栽)的霍山石斛的内生真菌丰度最高；在多样性方面(Shannon指数以及Simpson指数表示)，来源于六安霍山(盆栽)的霍山石斛的内生真菌多样性最高。这表明随着生长环境的改变，霍山石斛内生真菌的丰度以及多样性随之产生了变化。图中同一来源的两个平行霍山石斛样本之间内生真菌的Chao 1、Shannon和Simpson等分析指标并不处于同一水平上，表明同一来源的两个霍山石斛内生真菌的丰度以及多样性亦具有一定的差异性。

4.1 霍山石斛样品种质鉴定 使用聚合酶链式反应法进行鉴别，样品LS0、LD0、JP0、LP0和HP0的PCR产物电泳结束后，其凝胶电泳图谱中，与阳性对照凝胶电泳图谱相应的位置(250～500 bp)有单一的DNA条带，阴性对照和空白对照相应位置上无条带(见图1)。结果说明本研究所采集的石斛样品与生物学意义上的霍山石斛具有一致性，为正品霍山石斛。

4.4 同一来源两个平行霍山石斛样本间的Venn图 由图4，通过分析每个OTU对应的物种分类信息，将这些OTU归属至种类水平上后，发现虽然样本LD1总OTU数405个中特有的OTU占186个，但特有的在物种水平上仅占总物种数的2.62%。同样，样本LD2中总OTU有376个，特有的OTU有157个，但仅占总物种数的1.8%。而两个样本共有的OTU有219个，却占了总物种数的95.58%。

南水北调受水区是全国地下水超采最严重的地区。因此，应按照水利部《南水北调受水区地下水压采总体方案》，根据压采目标，采取不同的压采措施和保障措施，严格控制地下水开采。对严重超采区、重点保护区尤其要严格控制开采量，主要是压缩地下水开采量。同时要充分利用南水北调来水、雨季洪水、再生水、微咸水和咸水等替代水源，减少地下水开采量。

图3 样品的Alpha多样性分析

图4 六安霍山(地栽)两个霍山石斛 样本间的Venn图

同时，对LP1(OTU 540个)/LP2(OTU 390个)、LS1(OTU 621个)/LS2(OTU 601个)、HP1(OTU 423个)/HP2(OTU 462个)和JP1(OTU 392个)/JP2(OTU 394个)4组共有的OTU进行分析，发现在样本LP1/LP2组中，两个样本共有的OTU有189个，占总物种数的84.22%；在LS1/LS2组中，两个样本共有的OTU有246个，占总物种数的94.52%；在样本HP1/HP2组中，两个样本共有的OTU有214个，占总物种数的93.59%；在样本JP1/JP2组中，两个样本共有的OTU有213个，占总物种数的94.05%。

以上OTU分析结果表明，同一来源的两个霍山石斛样本间的内生真菌种类具有一定的差异性，这验证了Alpha多样性分析的结果。但通过分析每个OTU对应的物种分类信息，并将这些OTU归属至种类水平上后，发现同一生境下霍山石斛(Dendrobium huoshanense)的内生真菌OTU数以及物种数量虽然存在着较大差异，在物种水平上却显示其内生真菌分布无明显的差异性，表明同一生境下的霍山石斛内生真菌群落组成基本相同，这也验证了由图2所得的结果：同一来源(即同一生境)下平行的两个霍山石斛样本其内生真菌的相对丰度相差较大，但群落组成基本相同。

推荐理由:十九大以来，我国水环境治理工作迈入新的历史发展阶段。本书全面系统地总结了近20年以来我国河道治理过程中的经验和成绩，并以杭州市为例，形成了杭州特色的水环境治理理论和技术体系，应用新技术、新方法，建立全国示范工程。本书案例丰富、新颖，图文并茂。正因为杭州市在水环境治理方面一直引领全国，本书旨在更大范围内共享先进治水理念与经验。

4.5 热度图 由图5可知，在种水平上，两个六安霍山(盆栽)的霍山石斛中丰度最高的为二孢炱科(Pleosporales)的一个未知种Pleosporales sp.，两个六安霍山(地栽)的霍山石斛中丰度最高的为小丛壳属(Glomerella)的一株内生真菌Glomerella cingulata，两个六安霍山(树栽)的霍山石斛中丰度最高的为二孢炱科(Pleosporales)的一个未知种Pleosporales sp.，两个安徽中医药大学药园(盆栽)霍山石斛中丰度最高的为小丛壳属(Glomerella)的一株内生真菌Glomerella cingulata，两个宣城泾县(盆栽)霍山石斛中丰度最高的为座囊菌(Dothideomycetes)的一个未知种Dothideomycetes sp.。这表明不同生境下霍山石斛的优势内生真菌会随生长环境以及地域的改变而产生变化，且同一生境下两个独立的霍山石斛其优势内生真菌相同。同时，同种栽培方式3个不同产地下的霍山石斛其优势内生真菌不同，表现出一定的地域专属性。

图5 种水平高丰度类群热度图

5 讨论

以往在研究药材内生真菌的过程中，多有讨论不同产地或不同生境下药材内生真菌的差异性[7-8]，却鲜有对同一产地或生境下的药材内生真菌的菌落分布情况进行探讨。本研究利用GSS高通量测序技术对不同生境下霍山石斛的内生真菌差异性进行探索，同时又对同一生境下采集的两个平行的霍山石斛样本的内生真菌组成进行研究，旨在探讨同一生境下两个独立的霍山石斛的内生真菌菌落是否具有相同性，以期为“从内生真菌角度建立起霍山石斛道地性鉴别新模式”这一假设奠定科学的基础。所得结果发现虽然同一生境下的两个独立的霍山石斛样本的OTU数以及物种数量存在着较大差异，但在物种水平上显示其内生真菌群落组成基本相同。

另外，根据同种栽培方式下3个产地的霍山石斛优势内生真菌表现出一定的地域专属性并结合同一生境下两个霍山石斛样本的优势内生真菌相同这一结果，表明“从内生真菌角度建立起霍山石斛道地性鉴别的新模式”这一假设具有一定的科学性，同时也为后期能够从内生真菌角度建立起药材道地性鉴别的新模式奠定科学的基础。

参考文献：

[1] PETRINI O. Fungal endophytes of tree leaves[M]//Microbial ecology of leaves.ANDREWS J H, HIRANO S S. New York: Spring-Verlag, 1991: 179-197.

[2] 陈颐辉,滕斌,罗志祥,等.化感水稻6173内生真菌发酵产物对水稻和稗草苗期生长及生理生化特性的影响[J].核农学报,2017, 31(5):946-953.

[3] 陈水红,曹莹,陈泰祥,等.内生真菌提高禾草抗盐碱性研究进展[J].生物技术通报,2017,33(12):1-6.

[4] 宝艳儒,刘悦,解生旭,等.内生真菌对药用植物活性成分影响研究进展[J].人参研究,2017,5:40-45.

[5] 崔晋龙,郭顺星,肖培根.内生菌与植物的互作关系及对药用植物的影响[J].药学学报,2017,52(2):214-221.

[6] 梁雪娟,张水寒,张平,等.不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析[J].中国中药杂志,2014,39(2):204-208.

[7] 王萌.道地产区丹参内生真菌组成及其功能的初步研究[D].成都:成都中医药大学,2013.

[8] 梁雪娟.杜仲皮有效成分与其内生真菌的相关性研究[D].长沙:湖南中医药大学,2014.