多发性硬化(multiple sclerosis, MS)是一种常见的神经系统疾病，以中枢神经系统白质脱髓鞘为主要病理特征[1]。MS一般可累及脑室周围的白质、小脑、脑干和脊髓等，常反复发作，合并多神经功能缺损，症状可逐渐加重。其发病机制尚不明确，目前认为与自身免疫密切相关。CD4+ T细胞的分化在MS的发病机制中占有核心地位。近期研究提示，CD4+ Th1/CD4+ Th2细胞轴、CD4+ Th17/CD4+ Treg细胞轴功能失调对MS的发生、发展具有重要意义[2-4]。临床研究认为，中医药治疗MS具有一定的优势，可以改善临床症状，有效缓解复发[5]。临床观察及前期研究认为，补肾解毒法对多发性硬化具有良好效果[6]，可能与其调节免疫功能有关，但其机制尚不明确。本研究利用MS的经典模型——实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis，EAE)模型，采用免疫组织化学和流式细胞仪检测炎性指标及Th1、Th2、Th17、Treg细胞等CD4+ T细胞亚群，探讨补肾解毒法对中枢神经炎症及外周血Th1/Th2细胞轴、Th17/Treg细胞轴的影响，从而探讨补肾解毒法改善MS临床症状的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6雌性小鼠由南方医科大学实验动物中心提供，生产许可证号为SCXK(粤)2011-0015,共48只，6～8周龄，体质量18～20 g，分笼饲养于南方医科大学实验动物中心，室内温度20～25 ℃，标准饲料及饮水，标准光照和黑暗节律12 h/12 h。

1.2 药物 补肾解毒汤(熟地黄24 g,山茱萸、山药各12 g,泽泻、牡丹皮、茯苓、黄连各9 g)按常规方法煎煮，委托南方医科大学附属南方医院制剂室进行加工，收集滤液并用文火煎煮浓缩制成2 g/mL的水提物，对pH值、比重、卫生学指标等进行检测，冷藏，用前加温、摇匀。醋酸泼尼松片(广东华南药业集团公司，国药准字 H44020682)，用磁力恒温搅拌器搅拌均匀，用去离子水配制成0.39 mg/mL溶液。

2 方法

2.1 模型复制 使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白35-55(myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55，MOG35-55)免疫C57BL/6小鼠。将等容积MOG35-55水溶液(MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,上海吉尔生化公司合成)与完全弗氏免疫佐剂(F5881 10 mL,Sigma)混合，使用玻璃注射器抽打，使其混合、乳化，制备成油包水的抗原乳剂。于免疫动物当日记为第0天，在小鼠背部脊柱中线两侧分4点皮下注射，每只0.2 mL MOG35-55抗原，然后给每只小鼠腹腔内注射0.1 mL百日咳毒素溶液(含400 ng PTX， Sigma)，诱导小鼠产生EAE。48 h后(第2天)再次腹腔内注射0.1 mL PTX溶液1次。

2.2 分组与给药 模型复制后将C57BL/6小鼠随机分为正常组，模型组，泼尼松组，中药低、中、高剂量组，每组8只。模型复制后第7天开始灌胃给药，每日1次。泼尼松组予泼尼松7.8 mg/(kg·d)灌胃，各中药组每日分别以7.2、3.6、1.8 mL/kg的中药溶液配合相应容积(2.8、6.4、8.2 mL/kg)蒸馏水灌胃，正常组及模型组每日给予生理盐水(1 L/kg)灌胃1次，持续灌服30 d。

I am quite lucky that I have husband, a father, and a friend.

3.2 各组小鼠脾细胞CD4+ T细胞亚群比较 与模型组比较，中药高剂量组、泼尼松组Treg比例升高，Th1和Th17比例降低，差异均有统计学意义(P<0.05)；而中药高剂量组、泼尼松组Th2比例与模型组相当，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.5 ELISA法检测培养脾细胞上清液中细胞因子 向上述研磨的脾脏细胞中加入5 mL RMPI 1640培养液，置于培养箱中培养24 h，采用ELISA试剂盒(武汉华美生物有限公司)检测上清液中IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17A水平。

2.6 统计学方法 使用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析，对连续型变量使用“均数±标准差”表示。多组均数总体比较使用单因素方差分析，方差齐时均数多重比较使用LSD法,方差不齐时使用Dunnett’s T3法。P<0.05为差异具有统计学意义。

中国马铃薯土壤速效钾丰缺指标与适宜施钾量研究………………………………… 孙洪仁，冮丽华，张吉萍，吕玉才，王应海（58）

3 结果

入库河道沿线污染物主要包括点源工业污染、农业面源污染、生活污染和养殖污染。其中农业面源污染和养殖污染是影响水环境的主要污染来源。污染物随水流汇入河道，河道水流再汇入水库。所以入库河道是污染物进入水库的最主要通道。

2.3 小鼠大脑组织炎症及脱髓鞘评分 在模型复制后第30天取小鼠脊髓组织，每组8只。使用10%水合氯醛麻醉，打开胸腔从心内插管，放入多聚甲醛灌注内固定，取小鼠大脑组织和腰髓(腰膨大部分)，后常规脱水、石蜡包埋，石蜡切片机对组织连续切片，常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和髓鞘染色，光镜下观察摄像。①炎症评分标准：没有炎症，计0分；炎性细胞只浸润血管和脑脊膜周围，计1分；少量炎性细胞浸润脑或脊髓实质，计2分；中量炎性细胞浸润脑或脊髓实质，计3分；大量炎性细胞浸润脑或脊髓实质，计4分。②髓鞘脱失评分标准：正常脑或脊髓白质，计0分；点状脱髓鞘，计1分；小片状脱髓鞘，计2分；血管周围融合的或者单纯脱髓鞘，计3分；累及半侧脊髓的广泛脱髓鞘，计4分；累及整个脊髓的广泛脱髓鞘，计5分。

2.4 流式细胞检测脾CD4+ T细胞亚群 将小鼠处死后，右侧卧位，将左侧腹部皮肤剪开，分离取出暗红色脾脏，细胞筛上将脾脏研碎，反复冲洗、离心，加入5 mL RMPI 1640培养液。每个流式样管中加入100 μL脾脏细胞悬液，细胞数约为1×106，细胞表面染色，重悬，固定后先染APC-Cy7-CD3、BV510-CD4、PerCP-Cy5.5-CD8，4 ℃孕育30 min，固定破膜剂重悬细胞，再染FITC-IFN-γ-Th1、PE-IL-4-Th2、PE-IL-17A-Th17、Alexa Fluor 647-Foxp3-Treg，缓冲液重悬细胞，上流式细胞仪检测。

注：A.正常组；B.模型组；C.泼尼松组；D.中药低剂量组；E.中药中剂量组；F.中药高剂量组

图1 各组小鼠脊髓形态学变化(HE染色，10×10倍)

应用SPSS19.0软件进行统计学分析。两组患者一般资料比较采用卡方检验。两组患者术前年龄、视力、眼压、散光值比较采用独立样本t检验。两组患者的视力、SIA、波前像差、眼前节参数值比较采用配对t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

3.1 各组小鼠脊髓和髓鞘组织形态学变化 正常组小鼠脊髓和髓鞘未见明显病理变化；模型组小鼠脊髓和髓鞘可见大量炎性细胞浸润，其中以中性粒细胞和淋巴细胞为主；与模型组比较，中药高剂量组和泼尼松组小鼠脊髓和髓鞘的炎症评分和脱髓鞘评分均显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图1、图2、图3和图4。

3.3 各组小鼠脾细胞中细胞因子水平比较 与正常组比较，模型组小鼠脾细胞中IL-4、IL-10水平显著降低，IFN-γ、IL-17A水平显著升高，差异均具有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，泼尼松和中药高剂量组小鼠脾细胞中致炎因子IFN-γ、IL-17A显著降低，抑炎因子IL-4、IL-10显著升高，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2。

注：A.正常组；B.模型组；C.泼尼松组；D.中药低剂量组；E.中药中剂量组；F.中药高剂量组

图2 各组小鼠脊髓的髓鞘染色(HE染色，10×10倍)

注：B.模型组；C.泼尼松组；D.中药低剂量组；E.中药中剂量组；F.中药高剂量组；与模型组比较，*P<0.05

图3 各组小鼠脊髓和髓鞘炎症评分比较(n=8)

注：B.模型组；C.泼尼松组；D.中药低剂量组；E.中药中剂量组；F.中药高剂量组；与模型组比较，*P<0.05

图4 各组小鼠脊髓和髓鞘的脱髓鞘评分比较(n=8)

表1 各组小鼠脾细胞CD4+ T细胞亚群比较

组 别nTh1/%Th2/%Th17/%Treg/%正 常83．09±0．652．36±1．650．97±0．465．69±1．84模 型85．19±1．62∗1．58±0．754．23±1．41∗2．68±1．22∗泼尼松83．58±1．05#2．01±1．181．55±0．74#4．58±1．93#中药低剂量84．83±1．401．64±0．633．62±0．963．06±1．38中药中剂量84．82±1．281．72±1．033．58±0．913．20±1．69中药高剂量83．67±1．35#2．02±1．161．52±0．88#4．56±2．31#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05

表2 各组小鼠脾细胞中细胞因子水平比较

组 别nIFN⁃γ/(pg/mL)IL⁃4/(pg/mL)IL⁃10/(pg/mL)IL⁃17A/(pg/mL)正 常8220．77±102．20#61．03±6．98#38．55±11．15138．69±21．21模 型8780．71±267．83∗22．18±8．11∗21．43±10．74∗261．18±77．56∗泼尼松8321．30±141．95#42．35±13．09#35．61±14．51#161．98±94．39#中药低剂量8677．81±215．07△27．56±10．84△24．59±12．09205．69±67．57中药中剂量8519．31±239．0531．86±11．9024．75±9．38180．96±102．43中药高剂量8325．33±179．15#◇45．23±13．46#◇34．80±10．67#163．19±84．42#

注：与正常组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05；与中药低剂量组比较，◇P<0.05

4 讨论

MS当属中医学“痿证”“痹证”等范畴。病位在脑髓，涉及脾、肝、肾等。“脑为髓海”，脑髓失养，脑功能失常，神机失用，肢体失主，痿病乃生，而肾主骨生髓，肾气充足，髓海得养则脑功能健全，肾气不足则脑髓失养，因此MS发病与肾关系密切[7-9]。毒邪是MS发病和复发的主要病理因素，既可以是外来之热、湿、毒邪侵袭，也可以是内生之湿、痰、浊、瘀。MS急性发作期邪毒侵袭人体，上犯于脑，损伤脑髓而发病。补肾解毒法符合MS肾虚为本、邪毒为标的病机认识，补肾解毒法在临床上被认为是有效的治疗MS的中医治则[8,10]。MS的急性期有多种细胞因子的激活，以自身免疫炎性反应为主要临床表现。本研究所采用的补肾解毒方药，是在补肾的经典方药——六味地黄汤的基础上加清热解毒中药黄连而成，取其补肾解毒之功效。

T淋巴细胞向中枢神经系统的迁移及浸润是实验性MS的关键[11]。自身反应性CD+ Th细胞是启动EAE病理过程的主要效应性T淋巴细胞[12]。辅助性T细胞亚群(Th)根据细胞因子分泌模式的不同，CD4+ T细胞可分为Th1细胞、Th2细胞、Th17细胞、Treg细胞等亚群。Th1细胞亚群分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α、TNF-β等促炎因子，促进炎性反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-10、IL-6、IL-5等抑炎因子，能延缓或阻止病情，IL-4是初始CD4+ T细胞向Th2细胞进行分化的关键因子，在EAE模型中可减轻免疫性脱髓鞘[13]。经典的理论认为Th1/Th2细胞轴的平衡是控制和缓解MS的有效途径[4]。Th17细胞是有广泛生物活性的炎性细胞因子[14]，可产生IL-17,具有粒细胞募集、调节免疫、介导信号转导等多种功能，可刺激成纤维细胞及内皮细胞分泌各种细胞因子，促进补体C3产生，进而诱导炎性反应，促进MS的发病[15]。研究认为，IL-17在MS患者脑脊液和外周血单核细胞中表达升高，课题组前期研究也发现血清IL-17A水平和MS的残疾程度呈正相关[16-17]。Treg细胞是一群具有免疫调节作用的CD4+ T细胞，Foxp3是其关键的转录因子。Treg细胞可产生IL-10等细胞因子抑制EAE模型的自身免疫炎性反应，限制过度和错误的免疫应答，Treg的功能失活可导致MS的病情更加严重[18]。综上所述，Th1/Th2细胞轴、Th17/Treg细胞的分化偏移是MS发病的核心免疫学机制。

糖皮质激素多用于MS急性期治疗，但其长期疗效并不确定，可能存在严重不良反应及使用禁忌证。中医药在治疗自身免疫性疾病中已取得较好治疗效果，可以作为治疗的选择之一。现代药理研究证实，中药可从不同方面调节免疫和内分泌功能[6]。中药可能具有类皮质激素样的作用，可拮抗皮质激素反馈性脑垂体的抑制作用，且能够改善微循环，降低血黏度，在免疫应答阶段的T细胞识别阶段识别抗原早期，激素可以对细胞免疫功能和T、B细胞增生产生抑制作用，减轻自身免疫反应[19-20]，常作为对照药物用于研究中医方剂的免疫调节作用。

本研究表明，补肾解毒法可显著减轻EAE模型的炎性反应，减少脱髓鞘病灶。在细胞因子水平，补肾解毒法同样可以下调Th1细胞相关因子IFN-γ和Th17细胞相关因子IL-17A的水平，从而减轻炎性反应；另一方面促进Th2相关细胞因子IL-4和Treg细胞相关因子IL-10的表达，高剂量组作用更明显，和泼尼松强度相当。从脾脏细胞亚群结果分析发现，高剂量补肾解毒方药可以抑制Th1、Th17的分化，增强Treg的免疫调节作用，该作用与醋酸泼尼松的作用相当。本实验采用组织形态学检测法、免疫组织化学法和流式细胞仪等方法证明补肾解毒法能够调节EAE模型Th1/Th2细胞轴、Th17/Treg细胞轴平衡，降低炎性反应，促进髓鞘修复。因此，调节Th1/Th2细胞轴、Th17/Treg细胞轴可能是补肾解毒法作用的重要途径。

就在那一刹，我不知怎么突然间想到了两个月前掉在腹中的那颗假牙，连忙说：老婆，你忘没忘两个月前我掉过一颗假牙，我气管里能不能是那颗假牙？老婆说：我哪知道。都两个多月了，你没屙出来吗？我说：我上完卫生间，就直接冲马桶了，也没注意瞅过呀。老婆说：你也太粗心了，自己的事儿都不知道用心。你快去问问段主任呀。

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