鲍曼不动杆菌为非发酵革兰阴性杆菌，广泛存在于自然界，属于条件致病菌[1-2]。研究[3]表明，鲍曼不动杆菌已经成为医院获得性感染的重要病原菌，主要存在于重症监护病房和呼吸科，常引起呼吸系统感染，也可引发菌血症、手术部位感染等。鲍曼不动杆菌感染致死率接近50%。此外，由于细菌耐药的现象愈发严重，鲍曼不动杆菌的治疗变得愈加困难[4]。因此，临床上迫切需要发展针对鲍曼不动杆菌的新疗法和干预策略。

鱼腥草是一种传统中药，其性味辛寒，具有清热解毒、消肿排脓、利尿通淋等功效，可用于治疗肺脓溃疡、肺热咳喘、热痢热淋、水肿、脚气、尿路感染、痈肿疮毒等症，因此鱼腥草往往用于治疗肺病、泌尿系统疾病[5-6]。鱼腥草素是传统中药鱼腥草的主要活性成分，化学名称为癸酰乙醛，现代医学认为其具有抗菌、增强机体免疫力等多种作用[7]。由于该物质不稳定，目前临床上常使用十二酰乙醛的亚硫酸氢钠加成物，即新鱼腥草素钠。本研究通过制备小鼠鲍曼不动杆菌感染的肺炎模型，预先给予新鱼腥草素钠治疗，观察鱼腥草素对鲍曼不动杆菌性肺炎的防治效果。

1 材料

1.1 动物 80只雄性C57BL/6小鼠，8～12周龄，购自空军军医大学实验动物中心(小鼠合格证编号:20150073)，饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，能够自由摄取食物和饮水。

1.2 菌株 陕西中医药大学第一附属医院重症监护病房分离的鲍曼不动杆菌菌株，经过法国生物梅里埃API鉴定系统常规鉴定。

1.3 试剂 小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β， IL-1β) ELISA检测试剂盒：上海润裕生物科技有限公司；新鱼腥草素钠注射液：江西瑞金三九药业有限公司。

“半永久肥肉”是指那些可以短暂消失但最终还是会永久保持在你身上的顽固的肥肉。身上的有些赘肉可能会因为准备考试、熬夜工作、失恋而短暂消失，但你永远也别想摆脱它们，即使减肥也很难减掉。

2.7 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行数据分析。连续型变量采用“均数±标准差”进行统计学描述。数据符合正态分布时，多组均数比较采用单因素方差分析，均数多重比较采用LSD检验；若数据不符合正态分布，采用非参数检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。

2 方法

2.1 菌液制备 将临床分离的鲍曼不动杆菌接种至琼脂糖培养板，放置于37 ℃细菌培养箱中培养过夜，用灭菌牙签挑取单个菌落转接至含5～8 mL LB培养液的摇菌管中，置于摇床中37 ℃、180 r/min振荡培养12 h，取5 mL细菌液4 000 r/min离心10 min，收集沉淀，采用1 mL无菌生理盐水重悬，用比浊法测定并调整菌液浓度为1×108 集落形成单位(colony-forming units， CFU)/mL。

1.对联并非高不可攀，更非古人专利，小孩子也能创作对联，关键是师生是否愿意去做，肯否花时间去琢磨。写对联花费时间不多，在校期间老师也可以抽出点时间，引导学生去尝试练笔。

2.2 模型制备 80只C57BL/6雄性小鼠，体质量为18～20 g，根据随机数字表进行完全随机化分组，分为对照组、肺炎模型组、低剂量(5 mg/kg)新鱼腥草素钠组和高剂量(10 mg/kg)新鱼腥草素钠组，每组20只，各组小鼠于模型制备前4 d和前1 d，通过腹腔注射环磷酰胺(50 mg/kg) ，以抑制小鼠免疫功能，其中低剂量新鱼腥草素钠组和高剂量新鱼腥草素钠组在手术前4 d开始每天通过腹腔注射给予新鱼腥草素钠注射液，持续至实验结束。小鼠经4%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，用注射器将100 μL菌液注入气道，对照组注射等量生理盐水，注射完毕，待小鼠复苏后正常饲养，观察小鼠生存状态，根据文献[8]介绍的方法进行，若小鼠接种后出现明显的呼吸急促、活动减少、反应迟钝、毛发杂乱等表现，表明模型复制成功。

3.1 各组小鼠状态观察 在麻醉、插管、接种等操作过程中无小鼠死亡，对照组小鼠活动、进食无异常。肺炎模型组小鼠接种鲍曼不动杆菌后6 h，出现明显的呼吸急促、活动减少、反应迟钝的表现；接种后24 h，上述症状进一步加重，并出现摄食减少、毛发杂乱、蜷缩、浑身颤抖等病变加重的征象；72 h后小鼠出现严重的呼吸困难、反应迟钝、浑身颤抖、体质量减轻等表现。新鱼腥草素钠组小鼠接种鲍曼不动杆菌后也出现呼吸急促、活动减少的现象，但是与肺炎模型组相比，症状较为轻微。

2.5 支气管肺泡冲洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)炎性细胞检测 每组各取小鼠5只，同样方法麻醉小鼠，切开气管，注入0.5 mL PBS溶液进行支气管肺泡灌洗，反复3次。将回收到的液体混匀，收集BALF中全部细胞，用血细胞计数仪计数，Hema-3染色后用细胞涂片进行细胞分类。

对比2组患者临床治疗总有效率，判断标准[2] ：（1）显效：临床症状全部或大部分消失，指标检查恢复正常；（2）有效：临床症状基本消失，指标检查基本恢复正常；（3）无效：未达到上述治疗效果，部分患者病情恶化。总有效率=显效率+有效率。与此同时，对比两组治疗前后神经功能缺损评分，得分越低说明患者神经功能缺损程度越轻；对比两组不良反应发生情况，做好详细记录与分析。

2.3 细菌学定量 在接种后24、72 h每组分别用颈椎脱臼方式处死5只小鼠，摘除肺组织，加入适量无菌生理盐水后匀浆，通过70 μm孔径的滤膜过滤，用无菌生理盐水10倍稀释后取100 μL样品接种至琼脂培养板进行37 ℃培养过夜，计数鲍曼不动杆菌的菌落数量。

2.6 ELISA检测 每组各取小鼠5只，小鼠处死前通过心脏采血方法收集1 mL血液，分离血清，检测血清中细胞因子TNF-α和IL-1β水平。

还应当看到，人类命运共同体作为一种新思想新理念新实践，还处在不断丰富发展阶段，至少在以下几个方面需要进一步拓展。

“海滨拾荒者”哈蒙德终年都在海上收集浮木，船后已经拖了30多根原木，但他仍然继续在水面上巡视，希望能够发现更多的浮木。这些漂流木中有许多适合制作胶合板的原木，其中最有价值的是雪松，他们打捞到的大多数原木最终都在造纸厂被化为纸浆。只是如今他们收获的浮木数量越来越少，伐木公司在将木材扎成筏子沿河漂流时比以往更加仔细。“曾经这里是世界上最大的原木生产地，到处都是木头，闭着眼睛也可以找到木头。”摩尔说道。

1.4 仪器 BX53M光学显微镜：日本奥林巴斯公司；Appliskan 多功能读数仪：美国赛默飞世尔公司。

2.4 小鼠肺组织病理学观察 每组各取小鼠5只，在接种后72 h处死小鼠，收集右侧肺组织，经4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色，观察比较各组小鼠肺组织病理学变化。

3 结果

1.2.4.1 毛细管的处理 毛细管使用前，按顺序用超纯水、甲醇、超纯水冲洗20、20、3 min，再分别用1 mol/L NaOH活化10 min、0.1 mol/L NaOH活化40 min，最后用超纯水、缓冲溶液分别冲洗5、10 min即可。每次进样前都应分别用0.1 mol/L NaOH冲洗5 min，超纯水冲洗3 min，缓冲溶液冲洗5 min。

3.2 各组小鼠肺内和血液中细菌计数比较 在检测的各个时间点中，对照组小鼠肺组织中未检出细菌，肺炎模型组小鼠肺内和血液中细菌数量显著增加(P<0.05)。新鱼腥草素钠组小鼠肺内和血液中细菌数量明显少于肺炎模型组(P<0.05)，其中高剂量新鱼腥草素钠组治疗效果优于低剂量新鱼腥草素钠组(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠接种鲍曼不动杆菌后肺内和血液中细菌计数

组 别n肺内细菌计数/10624h72h血液中细菌计数/10424h72h对 照50000肺炎模型537．0±9．03200．00±900．00210．0±140．05400．00±1600．00低剂量新鱼腥草素钠55．1±1．7∗26．00±4．00∗12．0±5．0∗420．00±90．00∗高剂量新鱼腥草素钠51．7±0．9∗#0．12±0．04∗#1．8±0．8∗#0．43±0．22∗#

注：与肺炎模型组比较，*P<0.05；与低剂量新鱼腥草素钠组比较，#P<0.05

3.3 各组小鼠肺组织病理观察 肺炎模型组小鼠术后72 h肺组织呈现严重的炎症变化，包括支气管管壁增厚、支气管扩张、单核细胞渗出，肺间质重度充血等典型的肺炎病理改变。在给予新鱼腥草素钠治疗后，小鼠肺部炎症明显减轻，表现为少量的间质充血、水肿和白细胞渗出。而高剂量新鱼腥草素钠治疗的效果更为明显。见图1。

3.4 各组小鼠BALF中炎性细胞水平比较 与对照组相比，肺炎模型组小鼠BALF中炎性细胞明显增加(P<0.05)；与肺炎模型组相比，经过新鱼腥草素钠治疗的小鼠BALF中炎性细胞明显增加(P<0.05)，其中中性粒细胞占白细胞的比例也更高(P<0.05)。见表2。

注：A.对照组；B.肺炎模型组；C.低剂量新鱼腥草素钠组；D.高剂量新鱼腥草素钠组

图1 各组小鼠肺组织学观察(HE染色，10×10倍)

表2 各组小鼠不同时间点BALF中炎性细胞水平比较

组 别n白细胞计数/10424h72h中性粒细胞计数/10424h72h对 照50．092±0．0490．085±0．0360．021±0．0150．023±0．021肺炎模型51．900±0．550△4．100±4．420△1．200±0．640△3．600±1．870△低剂量新鱼腥草素钠542．000±16．500∗55．000±15．100∗26．000±15．400∗31．000±25．300∗高剂量新鱼腥草素钠569．000±10．600∗71．000±11．300∗32．000±12．400∗33．000±11．100∗

注：与对照组比较，△P<0.05；与肺炎模型组比较，*P<0.05

3.5 各组小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比较 与对照组比较，肺炎模型组小鼠TNF-α、IL-1β水平显著升高(P<0.05)；在给予新鱼腥草素钠治疗后，治疗组BALF中TNF-α、IL-1β水平均高于肺炎模型组(P<0.05)，其中高剂量新鱼腥草素钠组又明显高于低剂量新鱼腥草素钠组(P<0.05)。结果提示新鱼腥草素钠对小鼠免疫功能的促进作用具有剂量依赖性。见表3。

4 讨论

随着临床大量抗生素的应用，鲍曼不动杆菌的耐药性愈加严重，鲍曼不动杆菌感染已经成为临床难控制的感染性疾病之一[9-11]。开发新的有效药物控制鲍曼不动杆菌感染是目前研究的重要方向。由于鲍曼不动杆菌是机会致病菌，通常情况下不会导致免疫力正常的人和动物致病。针对这一问题，在本实验中预先给予小鼠环磷酰胺处理。环磷酰胺是常用的烷化剂类免疫抑制剂，常用于器官移植或者自身免疫性疾病[12]，经过环磷酰胺预处理的小鼠体内免疫功能下降，使得鲍曼不动杆菌能够成功感染小鼠。在本研究中，笔者利用临床分离的鲍曼不动杆菌菌株通过呼吸道接种的方式制备了小鼠肺炎模型。鲍曼不动杆菌可以在小鼠肺内增殖并在肺外快速传播，导致小鼠发生菌血症和肺炎。这种模型一定程度上模拟了临床鲍曼不动杆菌感染导致肺炎的病理过程。

表3 各组小鼠BALF中TNF-α和IL-1β水平比较

组 别nTNF⁃1α/(pg/mL)IL⁃1β/(pg/mL)对 照54．65±1．626．22±2．14肺炎模型537．66±9．61△78．65±8．94△低剂量新鱼腥草素钠559．34±5．71∗89．77±1．45∗高剂量新鱼腥草素钠582．79±12．15∗#116．62±34．51∗#

注：与对照组比较，△P<0.05；与肺炎模型组比较，

*P<0.05；与低剂量新鱼腥草素钠组比较，#P<0.05

新鱼腥草素钠在临床上作为重要的辅助用药常用于呼吸系统感染性疾病的治疗，对卡他球菌、流感杆菌、肺炎球菌、金黄色葡萄球菌等有明显抑制作用[13-17]。研究表明，其能够增强机体免疫力，具有抑制病原微生物以及抗肿瘤作用[18-19]。在本研究中，小鼠接种大量鲍曼不动杆菌后，肺和血液中细菌增加，由于自身免疫功能受到抑制，白细胞数量不足，不能够充分激活固有免疫反应，表现为白细胞升高受限，释放细胞因子不足，其结果是不能够快速清除体内细菌，造成肺严重的炎性反应和组织损伤，而经过新鱼腥草素钠治疗的小鼠，肺内和血循环中细菌的数量显著减少，肺组织损伤程度较轻微，BALF中白细胞数量显著高于未给予新鱼腥草素钠治疗的小鼠，TNF-α和IL-1β作为急性炎症过程中重要细胞因子，主要由单核巨噬细胞和中性粒细胞分泌产生，因此这两种细胞因子水平反映炎性反应程度以及单核巨噬细胞和中性粒细胞的功能。肺炎模型组小鼠经过环磷酰胺处理，其炎性反应受到一定程度的抑制，但仍能够增生和活化，而新鱼腥草素钠治疗后，小鼠体内免疫反应能力显著提高，表现为细胞因子水平增加更为明显，说明新鱼腥草素钠能够提高机体免疫力，促进白细胞活化，增加细胞因子分泌。

综上，本次研究结果表明，新鱼腥草素钠能够显著改善鲍曼不动杆菌感染小鼠的免疫力并抑制鲍曼不动杆菌在体内增殖，针对这一现象进行深入研究可望为鲍曼不动杆菌的防治提供更多的实验基础。

参考文献:

[1] YANG J J，WANG J T，CHENG A，et al.Impact of broad-spectrum antimicrobial treatment on the ecology of intestinal flora[J].J Microbiol Immunol Infect，2017.DOI: 10.1016/j.jmii.2016.12.009.

[2] SMILJANIC M，KAASE M，AHMAD-NEJAD P，et al.Comparison of in-house and commercial real time-PCR based carbapenemase gene detection methods in Enterobacteriaceae and non-fermenting gram-negative bacterial isolates[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob，2017，16(1):48.

[3] TORRES R M C，CRUZ M M D，PÉRISSÉ A R S，et al.High HIV infection prevalence in a group of men who have sex with men (MSM)[J].Braz J Infect Dis，2017，21(6)：596-605.

[4] 袁吕江，李学刚，何红梅.辛酰乙醛亚硫酸钠抗菌和对小鼠免疫影响的研究[J].中医药信息，2004，21(6):51-53.

[5] 袁吕江，李学刚，何红梅.鱼腥草素同系物对小鼠免疫影响的研究[J].中医药学报，2004，32(5):25-28.

[6] MATHLOUTHI N，BEN LAMINE Y，SOMAI R，et al.Incidence of OXA-23 and OXA-58 carbapenemases coexpressed in clinical isolates of acinetobacter baumannii in tunisia[J].Microb Drug Resist，2017.DOI: 10.1089/mdr.2016.0306.

[7] YANG H，WANG W S，TAN Y，et al.Investigation and analysis of the characteristics and drug sensitivity of bacteria in skin ulcer infections[J].Chin J Traumatol，2017，20(4):194-197.

[8] 肖舒心，赵旭，郭蓓宁.采用耳窥镜直视下气管插管法构建小鼠鲍曼不动杆菌肺炎模型[J].中华感染与化疗杂志，2015，15(1)：51-56.

[9] TSACHOURIDOU O，GEORGIOU A，NANOUDIS S，et al.Prolonged and high dosage of tigecycline-successful treatment of spondylodiscitis caused by multidrug-resistant Acinetobacter baumannii: a case report[J].Med Case Rep，2017，11(1):186.

[10] 邵兰，于庆海，徐静华，等.合成鱼腥草素对环磷酰胺模型小鼠免疫功能的影响[J].沈阳药科大学学报，2000，17(2):133-135.

[11] 邵兰，于庆海，吴红艳，等.合成鱼腥草素对小鼠免疫功能的影响[J].沈阳药科大学学报，1999，16(3):56-58.

[12] CHENG A，CHUANG Y C，SUN H Y，et al.Should we treat patients with only one set of positive blood cultures for extensively drug-resistant Acinetobacter baumannii the same as multiple sets?[J].PLoS One，2017，12(7):e0180967.

[13] LARCHER R，PANTEL A，ARNAUD E，et al.First report of cavitary pneumonia due to community-acquired Acinetobacter pittii，study of virulence and overview of pathogenesis and treatment[J].BMC Infect Dis，2017，17(1):477.

[14] HENDRA R，KELLER P A.Phytochemical studies on two Australian Anigozanthos plant species[J].J Nat Prod，2017，80(7):2141-2145.

[15] 宋莎莎，杨乐，俞令凯，等.合成鱼腥草素对溃疡性结肠炎小鼠的保护作用[J].长江大学学报(自然科学版)，2014，11(18):67-69.

[16] 楼希文，栾洋，姜宝红，等.鱼腥草素钠对BALB/c小鼠的急性毒性及其对细胞的损伤[J].中国药理学与毒理学杂志，2012，26(5):653-657.

[17] 吴海芬，叶玉娣.鱼腥草素抗菌活性的实验研究[J].中国中医药科技，2012，19(5):418-419.

[18] 杜爱芳，胡松华，鲍伟华.合成鱼腥草素对单核-巨噬细胞吞噬功能的影响[J].中兽医医药杂志，1998(3):7-9.

[19] RODRIGO-TROYANO A，SIBILA O.The respiratory threat posed by multidrug resistant gram-negative bacteria[J].Respirology，2017，22(7):1288-1299.