外伤性癫(post-traumatic epilepsy，PTE)是颅脑损伤后常见的并发症，具有发病率高、损伤性大等特征，且治疗困难，易转化为难治性癫。目前，这种反复发作的癫，已成为巨大的医学和社会问题。既往研究表明，PTE人脑组织中B细胞的淋巴瘤-2(B cell lymphoma-2，bcl-2)基因表达下调，半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶-10( cysteinylaspartate specific proteinase-10，caspase-10 )基因表达上调，提示细胞凋亡参与PTE的形成[1-2]。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)实质上是一种糖蛋白，且这种糖蛋白之中含有一定量的唾液酸。从表达方面，其目前几乎涵盖在所有的脊椎动物体内。EPO最大的价值体现在“保护”上，包括对炎症损伤的保护、对兴奋性毒性的保护、对创伤的保护、对缺血的保护等[3-4]。刘健等[5]发现，EPO可通过抑制神经丝蛋白降解，从而达到对颅脑损伤大鼠的保护作用。对于临近坏死的组织，EPO能在某种程度上延缓其凋亡速度。是否EPO可通过下调PTE大鼠皮层脑组织中bcl-2的表达，上调caspase-10的表达，抑制癫发作，目前未见相关报道。为进一步证实EPO的促表达特征，本实验借助于大鼠铁离子致模型，并以其为参考，对比各组间bcl-2、caspase-10的mRNA和蛋白表达以及行为学差异，探讨EPO在铁离子致模型大鼠皮层脑组织中能否上调bcl-2的表达、下调caspase-10的表达，并由此减轻癫发作，对颅脑损伤起到保护作用。

材料与方法

1 研究对象

体重为(250±15)g左右的30只雄性SD大鼠作为本文的研究对象。并按照随机数字表法分成实验组、模型组以及对照组3组，每组各10只。本次实验，采用购于美国Sigma公司的FeCl3溶液；1500IU/0.5mL重组人促红细胞生成素(r-HuEPO)注射液购于沈阳三生制药股份有限公司；美国Proteintech Group公司的caspase-10兔多克隆抗体，Abcam公司的bcl-2兔单克隆抗体；日本TaKaRa公司的逆转录试剂盒、Trizol RNA抽提试剂；北京六合华大基因科技公司合成的PCR引物、北京中杉金桥公司β-肌动蛋白(actin)鼠多克隆抗体。

2 FeCl3外伤性癫模型的制作及观察

根据Golden等[6]实验方法，采用浓度为3.5%、剂量为10mL/kg的水合氯醛麻醉大鼠，于立体定位仪上固定，备皮、消毒并切开头皮。在左侧冠状缝后1mm、矢状缝旁2mm处钻开颅骨，暴露脑组织。进针深度3mm，注射浓度为100mmoL/L的FeCl3溶液5μL，匀速注射(在5min内)，并留滞针头数分钟以防溶液外溢。注意切勿钻穿硬脑膜伤及皮层脑组织，以免引起颅脑创伤出血干扰实验结果。对照组在同样位置注射5μL 0.9%NaCl。伤后30min，实验组大鼠腹腔注射rHuEPO 5 000U/kg，模型组大鼠腹腔注射等量生理盐水。麻醉苏醒后观察行为学表现，癫发作评分参照改良Racine法(0分为无癫发作；1分为愣神发作；2分为口面部痉挛、点头；3分为一侧前肢阵发性抽搐；4分为两侧前肢痉挛及持续性点头；5分为前肢阵挛、强直或跌倒；6分为发作衰竭致死)。本组将≥3分的行为学改变定义为癫发作，符合条件者认定为成功。对于造模失败者，补齐动物，重新造模。

普京倡议并落实的一系列政改法令虽颇有成效但也无可避免的在政党的多元发展和群体意见表达方面产生了负面效应。在执政实践中，俄罗斯政党政治存在的、在运行中显露出的许多问题也引发着国内民众、执政当局的反对党派及西方的诸多批评与质疑。而在种种严峻的政治环境现状与社会现实情况之中，俄中产阶层的成长壮大及随之引发的自由与民主诉求大幅攀升，也预示着俄罗斯原有的精英政治模式将日益受到更为艰巨的挑战。

3 标本采集

伤后24h，通过腹腔注射水合氯醛的方式，对大鼠进行麻醉，断头取脑，然后对左侧大脑皮层注射区域标本进行分离。从构成上看，各个标本都涉及两部分内容，都需要进行3次冲洗，分别是DEPC水和4℃ PBS缓冲液。冲洗后，将标本置于-80℃的环境下进行保存。

4 实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测bcl-2和caspase-10 mRNA表达

模型组共给11只大鼠注射FeCl3，其中10只观察到上述性发作；实验组共给13只大鼠注射FeCl3，其中10只观察到上述性发作；对照组未观察到癫发作。主要表现为自动症(面部肌肉颤动、规律性点头、湿狗样抖动)、上肢抖动并发展为向对侧翻滚以及严重而持续的边缘运动性惊厥(全身性强直-阵挛发作)，未见发作严重而死亡的大鼠。伤后6h内发作最为频繁，局灶性发作多见。发作间期进食、活动减少。统计伤后6h内发作情况，实验组与模型组比较,大鼠发作次数和单只每次发作时间减少(P<0.05)。见表2。

表1 实时定量PCR引物序列

基因引物序列bcl⁃2上游引物5′⁃GGATGCCTTTGTGGAACTGT⁃3′下游引物5′⁃GGTGCTTGGCAATTAGTGGT⁃3′caspase⁃10上游引物5′⁃TCTCAGGATCACTGGGCTCT⁃3′下游引物5′⁃ATGAAGGCCTTAACCACAGG⁃3′β⁃actin上游引物5′⁃ACGGTCAGGTCATCACTATCG⁃3′下游引物5′⁃GGCATAGAGGTCTTTACGGATG⁃3′

5 Western blotting检测bcl-2和caspase-10蛋白表达

对总蛋白质按照说明书标准进行提取，同样地，对其浓度情况用BCA法进行检测。以β-actin为内参蛋白，选取一些蛋白样品进行如下操作，将水煮沸，将已经经过变性缓冲液冲洗的样品放入其中，继续蒸煮5min；紧接着，再进行5min的10 000r/min离心，并在此基础上上样。电泳、转膜后，在4℃封闭环境中，将经过5%脱脂牛奶处理过的硝酸纤维膜放置并过夜；在此基础上，再加入3类不同的抗体孵育过夜，即抗β-actin抗体、抗caspase-10抗体、抗bcl-2抗体。在实验中，主要通过Image J来检测蛋白定量情况。

6 统计学分析

模型组和实验组bcl-2的mRNA表达均较对照组下降，实验组较模型组增高(P<0.05)。模型组和实验组caspase-10的mRNA表达均较对照组增高，实验组较模型组下降(P<0.05)。见表3。

结 果

1 行为学观察

取约80mg脑组织标本，参照说明书提取总RNA(Trizol法)，微量分光光度计(美国BIO-RAD公司)检测RNA样品浓度(A值)及纯度(A260/A280值在1.7～2.0)并进行标化。逆转录合成cDNA为模板，β-actin为内参照进行实时定量PCR反应(美国BIO-RAD公司的IQ5 RT-PCR仪)。25μL反应体系中包含12.5μL SYBR GREEN，10μLPCR水，0.25μL上游引物，0.25μL下游引物和2μL cDNA。引物序列见表1。反应条件如下：50℃ 2min，95℃ 5min；95℃ 20s，55℃ 20s，72℃ 30s，40个循环。PCR结果采用Ct值比较相对定量法，β-actin为内参照。

因为存在k不等于整数的情况，所以随机抽样时先对k取整.根据首次入侵发起时间点t1(0≤t1

2 RT-PCR结果

应用SPSS 17.0统计软件进行分析。进行单因素方差分析及两独立样本t检验，计量资料以表示。检测水准α=0.05。P<0.05为差异有统计学意义。

尽管国内外一直在探索简单易行、标准化程度较高的客观鉴定方法来表征粉条的品质，但主观评价跟客观评价相结合仍旧是当前甚至未来国内外粉条品质评价的主要方法[21]。对于食品的品质评价方法，严格的感官评价是一种传统的、具有明确含义的测定手段，其结果具有一定的说服力。由表7的感官评价结果可知，甘薯淀粉/魔芋胶质量比为 8.5：1.5制备的粉条的消费者可接受性最高，当甘薯淀粉/魔芋胶质量比为8.0：2.0时可接受性显著降低，这可能是由于魔芋胶添加量过大，使制品稍带异味、色泽变暗[22]。因此综合考虑，制备粉条的最佳复配比例为甘薯淀粉：魔芋胶=8.5：1.5。

3 Western blotting结果

模型组和实验组caspase-10的蛋白表达均较对照组增高，实验组caspase-10的蛋白表达较模型组下降(P<0.05)。见表3、图2。

3.有人认为脂肪有抑制胃酸分泌的作用，因此饭前吃些奶油、奶酪加工食品，有预防“烧心”作用。“烧心”已经出现，

模型组和实验组bcl-2的蛋白表达均较对照组下降(P<0.05)，实验组bcl-2的蛋白表达较模型组增高(P<0.05)。见表3、图1。

表2 大鼠癫发作行为学表现

组别n平均发作次数(次)平均每次持续时间(min)模型组108 83±1 472 14±0 57实验组103 62±1 05∗1 24±0 17∗

经t检验，与模型组比较：*P<0.05

表3 大鼠皮层bcl-2、caspase-10 mRNA和蛋白的表达水平

组别nbcl⁃2mRNA蛋白caspase⁃10mRNA蛋白对照组109 17±0 723 26±0 173 07±0 122 42±0 11模型组105 13±0 12∗1 55±0 13∗11 16±0 54∗6 15±0 08实验组107 26±0 38∗#2 35±0 04∗#8 21±0 23∗#3 73±0 15∗#P值<0 05<0 05<0 05<0 05

经LSD-t检验，与对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05

图1 Western blottin显示bcl-2蛋白的表达。

1.对照组；2.模型组；3.实验组

图2 Western blottin显示caspase-10蛋白的表达。

1.对照组；2.模型组；3.实验组

讨 论

神经细胞的凋亡是颅脑损伤后主要病理损害之一，凋亡抑制因子bcl-2和凋亡促进因子caspase-10的表达与受损神经细胞的转归密切相关。bcl-2属于凋亡抑制基因，其对凋亡信号的转导，主要是通过控制细胞内、核内浓度的大小来实现的。在颅脑损伤早期能观察到bcl-2的表达[7]，而且伴随着bcl-2表达的下降，常伴有细胞凋亡性死亡增多的现象。在凋亡流程当中，caspase-10位居上游，线粒体和细胞表面是其主要的作用部位，在识别和激活下游caspase过程中起重要作用。caspase-10通过形成死亡诱导信号复合物，将自身的蛋白酶活性激活，并将凋亡信号传递出来。本组研究数据显示，铁离子致大鼠皮层脑组织的caspase-10的mRNA及蛋白表达较对照组升高，bcl-2的mRNA及蛋白表达降低，充分说明颅脑损伤后细胞凋亡与PTE有关，颅脑损伤后神经元凋亡可能是导致早期外伤性癫发病原因之一。

经过大量的临床实践证实，神经细胞可自主分泌EPO，表达其受体的行为也是自主的[8]。近些年来，EP0在神经系统方面的保护价值逐渐凸显出来。研究显示，促红细胞生成素对神经组织具有直接的保护和营养作用，对早产儿使用促红细胞生成素可有效改善其预后，降低脑损伤后遗症的发生[9]。EPO的神经保护作用主要与抑制细胞凋亡[10]、上调抗凋亡基因[11]、抑制炎症反应和减轻一氧化氮介导的损伤及直接的抗过氧化效应等有关。裘银虹等[12]指出，EPO对海马神经细胞凋亡具有很好的抑制效果，而这会对神经系统产生直接的保护效果。本组行为学观察发现，腹腔注射EPO可显著减少铁离子致大鼠早期性发作频率及单次发作时间。进一步研究发现，早期PTE大鼠伤侧皮层脑组织bcl-2的mRNA表达较对照组下降，注射EPO后bcl-2的mRNA表达升高；bcl-2蛋白在伤后也明显下降，注射EPO后蛋白表达升高。同时，RT-PCR检测发现伤后caspase-10的mRNA表达较对照组显著升高，注射EPO后表达下降；Western blotting检测显示caspase-10蛋白在伤后也明显升高，注射EPO后蛋白表达下降。充分说明EPO对早期外伤性癫大鼠具有脑保护作用。文献报道，酪氨酸蛋白激酶2(Janus tyrosine kinase-2,JAK2)首先在EPO-β受体的作用下而得以成功激活，此后参与到核转录因子kβ与促分裂原活化蛋白激酶磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidyl inositol 3 kinase,PI3K)当中，引起蛋白激酶B (Akt)的磷酸化，即所谓的第二信使途径。最后，凋亡相关基因bcl-2家族成员会因这些第二信使而引起某种表达[13]。史志勤等[14]发现，rHuEPO通过PI3K/Akt途径对线粒体凋亡途经的相关调控因子进行调控，进而介导线粒体凋亡途经，发挥抗凋亡的神经保护作用。结合本组研究结果，笔者推测，EPO可通过PI3K/Akt途径，上调抑制凋亡基因bcl-2在PTE大鼠皮层脑组织中的表达水平，下调促进凋亡基因caspase-10的表达水平，抑制神经元凋亡，减轻癫发作。

本组实验观察到，虽然文献报道神经细胞可分泌EPO，但铁离子致伤后大鼠仍有明显的癫发作。而在铁离子致伤后及时进行腹腔注射EPO的干预，可显著减轻性发作，同时检测发现这种保护作用与bcl-2的上调、caspase-10的下调有关。这可能与大脑在铁离子致伤后EPO合成不足有关，以致不能及时发挥神经保护作用，而补充外源性EPO能及时发挥抗凋亡机制，减轻颅脑损伤，起到一定的保护作用。

综上所述，本组实验结果提示bcl-2的低表达和caspase-10的高表达与大鼠早期PTE发作密切相关。铁离子致伤后可能通过抑制细胞凋亡的bcl-2的低表达和促进凋亡的caspase-10的高表达，导致细胞凋亡发生，最终诱发PTE。促红细胞生成素可上调bcl-2在PTE大鼠皮层脑组织中的表达水平，下调caspase-10的表达水平，抑制神经元凋亡，减轻癫发作，对早期PTE的脑损伤具有保护作用。但具体信号转导通路，尚需进一步实验研究发现。

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