牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)，又称牛病毒性腹泻-黏膜病病毒或黏膜病病毒[1-2]。近年来，牛病毒性腹泻(BVD)疫情呈现再次暴发趋势，该病毒能自然感染多种偶蹄类动物，临床表现主要为腹泻、发热、流产、急性、慢性黏膜性疾病以及持续性感染和免疫耐受、免疫抑制等，主要引发母畜流产、产死胎等。该病在全世界范围内广泛传播，尤其是在养牛产业比较发达的国家和地区[2-3]，给我国和世界上多国家和地区的畜牧业造成了巨大危害。所以,研制安全高效的BVD疫苗是当前我国对该病的主要研究方向。BVDV包括4种结构蛋白(C/p14、E0/gp48、E1/gp25、E2/gp53)和8种非结构蛋白(p20/Npro、p7、p125/(NS2-3/NS3)、p10/NS4A、p30/NS4B、p58/NS5A、p75/NS5B)[4]，其中gp48又称E0或Erns，有其特有的RNase活性，但该活性在瘟病毒增殖及致病过程中所起的作用尚不清楚[5]，对E0 RNase活性的研究有可能为BVDV防控找到新的途径。E0是BVDV编码蛋白中保守性很高的蛋白，其上有中和表位，刺激机体产生的中和抗体具有中和BVDV和猪瘟病毒(CSFV)的能力[6]。氨基酸序列分析结果表明，在这一蛋白内有一高度保守结构域，它可用于研究基因工程亚单位疫苗，也可作为基因工程诊断抗原[7]。

3.2 患者版目标管理对冠心病患者二级预防知识及行为的影响 有效的二级预防行为管理，将有助于减少冠心病多种危险因素，改善冠心病患者心功能，促进患者预后，提高患者生活质量[9]。本研究结果显示，观察组干预后二级预防知识及二级预防行为评分均高于对照组(P<0.01)，考虑可能由于患者版目标管理手册让患者参与了目标及相关措施的制订，并结合自身具体现状对最终进行阶段性规划，使当前目标及措施符合患者，提高患者健康意识，促使患者建立健康行为，进而提高患者二级预防行为及知识水平。

骆驼属动物体内存在缺失轻链的天然重链抗体，这种抗体只包含1个重链可变区VHH和2个常规的CH2与CH3区，用噬菌体文库筛选和单克隆表达获得VHH单域抗体，也称为纳米抗体(nanobody,Nb)[8-9]。纳米抗体的大小仅是普通IgG 抗体的1/10，具有高稳定性、高亲和力及容易标记等优点。通过20余年的研究，纳米抗体作为诊断、治疗等特有的工具已应用于多个研究领域[9]。本研究利用BVDV的保守蛋白E0接种羊驼，将羊驼体内抗 BVDV的纳米抗体基因片段与噬菌体特定蛋白融合表达于噬菌体表面，构建噬菌体展示抗BVDV的纳米抗体文库，以期为诊断和防控牛病毒性腹泻奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

pACNR/NADL由石河子大学人兽共患病实验室保留；羊驼1只，雄性，2岁左右，饲养于石河子大学动物医院。pCANTAB5E由新疆大学李江伟教授惠赠；限制性内切酶SfiⅠ、总DNA提取试剂盒、DNA Marker均购自TaKaRa公司；Trizol购自Invitrogen公司；高纯度质粒DNA小提试剂盒和快速凝胶回收试剂盒购自北京康为世纪生物有限公司；弗氏完全佐剂和不完全佐剂均购自Sigma公司；M13KO7辅助性噬菌体购自GE公司；其余试剂均为进口或国产分析纯。

上述规定反映出非全日制用工形式的突出特点是灵活性，因相应的劳动者可以随时工作、随时休息，所以，此类用工不适用年休假的相关规定。因此，按照法律规定，洪小芳无法享受跟其他员工一样的待遇，公司以此为由拒绝其要求不违反法律规定。

1.2 方法

1.2.1 E0基因原核表达载体的构建 根据GenBank中公布的E0基因序列(登录号：NC-001461.1)，用Primer 5.0软件设计2对引物，上、下游引物分别引入BglⅡ、SalⅠ限制性内切酶位点，E0基因上游：5′AGATCTGGAAAACATAACACAGTGG 3′，下游：5′GTCGACAGCGTATGCTCCAAAC 3′下划线部分分别为BglⅡ、SalⅠ酶切位点。引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。以pACNR/NADL质粒为模板，PCR扩增E0，扩增体系如下：ddH2O 9.7 μL，上、下游引物各0.4 μL,模板2.0 μL,Mix 12.5 μL。反应条件为：95℃ 5 min，94℃ 30 s，61℃ 35 s，72℃ 90 s，30个循环；最后72℃延伸7 min，4℃结束反应。10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收产物备用。

通过限制性酶切位点BglⅡ、SalⅠ将载体pET-32a(+)双酶切，DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒回收上述酶切产物。将目的片段E0与回收的载体pET-32a(+)按摩尔比3∶1用T4 DNA连接酶16℃过夜连接，转入大肠埃希菌DH5α感受态细胞，涂布于含100 μg/mL 氨苄青霉素的LB(LB-Amp)平板37℃过夜培养。采用双酶切进行验证，将阳性克隆送生工生物工程(上海)有限公司测序。

引物设计主要参考文献[10]，并稍作修改,Primer 1： 5′-CTTGGTGGTCCTGGCTGC-3′；Primer 2： 5′-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC-3′；Primer 3：5′-CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCCAGKTGCAGCTCGTGGAGTCNGGNGG-3′(划线为SfiⅠ酶切位点); Primer 4：5′-CATGCCATGACTCGCGGCCTCGGGGGCCGGGGTCTTCGCTGTGGTGCG-3′(划线为SfiⅠ的异裂酶酶切位点)。第1次PCR用于获得VHH基因：用淋巴细胞cDNA作为PCR模板，加入Primer 1、Primer 2引物，dNTP Mix，高保真DNA聚合酶进行PCR反应，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，按照DNA凝胶回收试剂盒说明书对VHH基因条带回收并测定胶回收DNA浓度。第2次套式PCR用于插入酶切位点：用Primer 3和Primer 4作为引物，引物中插入酶切位点SfiⅠ和SfiⅠ的异裂酶酶切位点，取少量PCR产物用20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定结果，并按照说明书用DNA回收试剂盒。

1.2.3 羊驼免疫血清中抗VHH基因的获得 用1 mg BVDV-E0重组蛋白免疫羊驼2次，每次间隔10 d，获得抗血清80 mL，利用淋巴分离液从全血中分离出淋巴细胞，用Trizol法提取淋巴细胞RNA，经过反转录获得cDNA。

1.2.2 BVDV-E0诱导表达与纯化 将测序验证正确的重组表达载体pET32a(+)-E0转入大肠埃希菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含100 μg/mL氨苄青霉素的LB(LB-Amp)平板培养(37℃过夜); 挑取单菌落接种于20 mL LB-Amp液体培养基中培养(37℃过夜);1%比例接种于 500 mL LB-Amp液体培养基中，37℃摇床振荡培养至OD600 nm值为0.6～0.8;加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG转至15℃摇床振荡诱导培养过夜。将诱导物5 000 r/min离心10 min。弃上清，收集菌体; 菌体沉淀加入菌体裂解剂(每200 mL菌加5 mL)重悬;在液氮和37℃水浴锅中反复冻融3次之后超声破碎，蛋白纯化仪纯化。

The effective Hartree potential VH, i(z) in Eq. (1) arises from the ionization generated by the interaction of electrons and conforms to the generalized Poisson equation[15]

1.2.4 VHH基因与噬菌体载体pCANTAB5E的连接、转染和文库的表达 将第2次PCR获得的DNA产物和pCANTAB5E噬菌体表达载体，分别用SfiⅠ限制性内切酶进行酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，再用DNA连接酶将DNA和pCANTAB5E载体置于16℃水浴中过夜连接。将重组质粒转化到TG1大肠埃希菌感受态细胞中，取少量菌液涂布在LB-Amp固体培养皿表面，于37℃培养箱中过夜培养，根据平板上的菌落数计算库容量，随机挑选单克隆，进行PCR扩增，经过10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定确定噬菌体展示文库的插入率。

用E0重组蛋白作为抗原免疫羊驼获得淋巴细胞。首先提取淋巴细胞RNA经反转录获得cDNA；用反转录产物为模板进行第1轮PCR扩增,扩增结果出现2个条带，分别为900 bp和600 bp左右；回收600 bp片段，作为模板进行第2轮扩增，并加入插入SfiⅠ和SfiⅠ的异裂酶酶切位点的下游引物进行PCR，经琼脂糖凝胶电泳鉴定少量PCR产物大约为400 bp(图5)；用SfiⅠ限制性内切酶，酶切PCR产物和pCANTAB5E噬菌体表达载体，将2个酶切产物过夜连接后获得带有VHH外源基因的pCANTAB5E噬菌体表达载体(图6)；最后将含有VHH基因的pCANTAB5E载体通过电转染，转入TG1大肠埃希菌感受态细胞，获得噬菌体表达文库。对TG1的克隆计数可知，文库的容量为1.3×1011 cfu/mL，对随机挑选的单克隆进行插入率检测可知，成功构建了插入率为86%的噬菌体展示文库。

1.2.5 生物淘筛 在96微孔板中分别包被或者不包被BVDV-E0重组蛋白，标记为“+”或“-”，随后将噬菌体文库分别加入96微孔板中37℃孵育。第1轮生物淘筛用10 mL/L PBST缓冲液洗涤多次后，去除不能与BVDV-E0结合的噬菌体，剩下能够与BVDV-E0结合的噬菌体，使用Gly-HCl溶液将其洗脱下来并与辅助噬菌体同时感染TG1宿主菌，经过夜培养后，进入下一轮新的筛选，过程同上。

1.2.6 ELISA法检测生物淘筛富集率 用脱脂奶粉封闭BVDV-E0包被的ELISA平板，分别加入第1、第2、第3轮生物淘筛的噬菌体培养液，随后加入辣根过氧化物酶anti-M13-HRP抗体，37℃孵育1 h，最后加TMB显色液，采用酶标仪测定OD450nm值，计算每一轮淘筛的BVDV-E0噬菌体富集率。

重组原核表达质粒载体pET32a(+)-E0用BglⅡ和salⅠ进行双酶切验证(图1和图2)，双酶切后的E0基因片段大约为700 bp与预期分子质量大小相符，测序表明表达载体pET-32a(+)-E0构建成功。

1.2.8 纳米抗体的大量表达和纯化 用SfiⅠ和SfiⅠ的异裂限制性内切酶对含有纳米抗体基因的pCANTAB5E质粒进行双酶切，将所得目的基因片段VHH插入pET-30a(+)空质粒载体后，转染到BL21(DE3)感受态细胞中。将pET-30a-VHH在1 μL培养基中培养至对数生长期，用IPTG诱导表达纳米抗体，15℃过夜培养后离心收集菌体，菌体采用50 mmol/L Tris(pH8.5)，150 mmol/L NaCl含10 mL/L Triton X-100，1 μg/mL Pepstatin A，1 μg/mL Leupeptin超声裂解，同时以50 mmol/L Tris(pH8.5)，150 mmol/L NaCl缓冲液平衡Ni-IDA亲和层析柱，之后用不同浓度咪唑的平衡缓冲液洗脱目标蛋白，并收集每个洗脱组分进行SDS-PAGE分析检测纳米抗体的纯度和分子质量大小。

1.2.11 纳米抗体活性的分析 阻断ELISA分析纳米抗体的活性。将E0蛋白用包被液稀释至1 μg/mL，100 μL/孔加入酶标板中，4℃包被过夜;用PBST洗涤3次，加入50 g/L脱脂牛奶，200 μL/孔，37℃封闭2 h; PBST洗涤3次，将牛阳性血清(采自克拉玛依某牛场)(10、20、50、100、200倍稀释) 100 μL/孔依次加入酶标板中，37℃孵育30 min，PBST洗涤4次；再加入100 μL/孔生物素标记的纳米抗体(1∶5 000)，每个牛阳性血清浓度重复3次，37℃孵育30 min; PBST 洗涤4次，加入100 μL/孔按1∶5 000稀释的链霉亲和素-HRP，37℃孵育30 min; PBST洗涤4次，加入100 μL/孔TMB底物显色液，37℃孵育10 min;最后，加入 50 μL/孔终止液终止反应，酶标仪测定OD450nm值。

1.2.9 生物素标记纳米抗体 生物素标记纳米抗体参见生物素标记试剂盒(购自碧云天生物技术公司)。

生物淘筛基于ELISA原理，用BVDV-E0重组表达蛋白与噬菌体进行孵育，其目的是通过3轮亲和力筛选，去除不与BVDV-E0蛋白结合的空载噬菌体或低亲和力噬菌体，留下能与抗原结合的噬菌体，使高亲和力噬菌体在连续的筛选过程中获得富集。经鉴定通过3轮生物淘筛，与BVDV-E0结合的噬菌体得到了明显富集(图7)。从噬菌体感染的TG1宿主菌生长平板中随机挑选了96个单克隆，这些TG1单克隆经过PE-ELISA筛选阳性克隆，测OD450nm值，比背景值高3倍以上的克隆为阳性克隆(图8)。并经过测序结果比对鉴定，其中5个单克隆为BVDV-E0阳性单克隆。

与内陆联网主要包括交流输电和柔性直流输电两种方式。由于海岛与内陆距离约60 km，采用海底交流电缆联网输电方案的主要问题包括：

本次共选择污染水井7眼，其中在用4眼，报废停用3眼，所有水井均在娘子关泉域范围内，开采层位均为奥陶系含水层，其污染物必然经过井孔直接进入奥陶系岩溶含水层，对娘子关泉形成污染。经过资料收集、现场勘探、孔内电视对拟治理水井井孔结构、损坏情况、水质污染情况进行统一汇总，召集相关技术人员制定治理(封堵)方案。

（2）减少不必要的人员、机械费用。减少不必要的开支，为企业提供更多的利益，这是成本控制的一种比较好的方案。在不影响路桥质量的情况下把利益最大化。通过良好的工程计量对项目所用的材料等进行估量，以减少材料的浪费。

2 结果

2.1 E0基因表达载体的构建

1.2.7 PE-ELISA法鉴定抗BVDV-E0阳性克隆 从第1、第2、第3轮生物淘筛的TG1细菌培养皿中随机挑选克隆，置于LB培养基培养至细菌处于生长对数期时加入IPTG诱导剂，过夜诱导蛋白表达。第2天去除每个克隆的培养基上清，裂解TG1细胞后将细胞裂解液加入提前用脱脂奶粉封闭过的BVDV-E0包被的ELISA平板，再加入抗E-tag-HRP单克隆抗体，37℃孵育1 h，最后加入TMB显色液，采用酶标仪测定OD450 nm值。对吸光度值高于阴性对照3倍以上的阳性克隆进行测序。

K.空白对照;1～3.E0基因扩增结果；M.DNA标准DL 2 000

K.Negative control; 1-3.PCR products of E0 gene;M.DNA Marker DL 2 000

图1 E0基因PCR扩增结果

Fig.1 PCR amplification result of E0 gene

1.质粒对照；2～5.BglⅡ+SalⅠ双酶切结果.M.DNA标准DL 10 000

1.Plasmid control; 2-5.p0ET-2a-E0 digested with BglⅡand SalⅠ; M.DNA Marker DL 10 000

图2 pET-32a-E0重组表达质粒鉴定

Fig.2 Indetification of the recombinant plasmid pET-32a-E0

2.2 E0蛋白的表达和纯化

将质粒pET32a(+)-E0转化至表达宿主E.coli BL21(DE3)，0.1 mmol/L IPTG诱导表达过夜。菌体超声波破碎，离心后收集上清和沉淀。SDS-PAGE显示， 目的蛋白出现在大约45 ku处，与预期的目标蛋白大小一致，表明BVDV-E0蛋白在大肠埃希菌中实现表达(图3)。经Ni2+-NTA凝胶柱亲和纯化，得到目的蛋白E0 (图4)。

1.大肠埃希菌BL21诱导前；2.大肠埃希菌BL21诱导后；3.pET-32a诱导前；4.pET-32a诱导后；5.pET-32a-E0诱导前；6～9.分别为pET-32a-E0诱导后2 h、4 h、6 h、8 h;M.蛋白分子质量标准

1.Uninduced BL21; 2.Induced BL21;3.Uninduced pET-32a; 4.Induced pET-32a; 5.Uninduce pET-32a-E0; 6-9:Induced pET-32a-E0 at 37℃ for 2 h,4 h,6 h,8 h respectively;M.Protein molecular weight Marker

图3 pET-32a-E0表达产物的SDS-PAGE分析

Fig.3 SDS-PAGE analysis of expressed pET-32a-E0 products

1～2.纯化的E0蛋白；3.纯化E0蛋白之后的液；M.蛋白分子质量标准

1-2．Purified E0 protein；3.Liquid of purified E0 protein; M.Protein molecular weight Marker

图4 E0蛋白的纯化

Fig.4 Purification of E0 protein

2.3 BVDV-E0蛋白纳米抗体文库的构建

水利普查工作“6+2”各项目之间存在数据相互关联的关系，例如：地下水取水井专项与水利工程项目在供水人口、规模饮水工程上的关联；地下水取水井专项普查中的地下水灌溉面积应与同级灌区专项普查中的灌溉面积协调，特别是机电井灌溉数量、井所在灌区的类型、井灌区及井渠结合灌区的划分；地下水取水井专项普查中的地下水取水量应与同级经济社会用水情况调查中的用水量相一致。各专项的关联性及协调性直接影响普查质量，因此在组织各专项普查数据填报时必须做到互相协作和互相检查，对各项目组获得的数据进行比对，才能更好地完成静态和动态数据填报。

M.DNA标准DL 1 000;1～4.VHH基因扩增产物 M.DNA Marker DL 1 000; 1-4.Amplified VHH products

图5 VHH基因PCR扩增结果

Fig.5 PCR amplification results of VHH gene

M.DNA标准 DL 5 000; 1～2.pCANTAB5E-VHH酶切结果

M.DNA Marker DL 5 000; 1-2.pCANTAB5E-VHH digested with SfiⅠ

图6 pCANTAB5E-VHH酶切鉴定

Fig.6 Indetification of plasmid pCANTAB5E-VHH digested with SfiⅠ

2.4 特异性BVDV-E0噬菌体的富集表达和阳性克隆筛选

1.2.10 纳米抗体亲和力的鉴定 用BVDV-E0蛋白包被96孔板，4℃过夜，50 g/L脱脂乳37℃封闭2 h,PBST洗涤1次，随后将生物素标记纳米抗体梯度稀释后加入板孔孵育30 min，再加入链霉亲和素-HRP，最后加入底物进行显色反应，酶标仪测OD450nm。

图7 BVDV-E0 VHHs 富集

Fig.7 Enrichment of BVDV-E0 VHHs

2.5 纳米抗体的大量表达和纯化

为了获得高产量的纳米抗体，需要将纳米抗体基因从噬菌体表达载体(pCANTAB5E)，克隆至带有His标签的原核蛋白质表达载体(pET-30a(+))。克隆结束后，随机挑取BL21(DE3)宿主菌单克隆，用PCR法检测外源纳米抗体基因的插入率为100%，琼脂糖凝胶电泳图显示大小为400 bp的纳米抗体基因条带(图9)。随后对纳米抗体进行大量表达和纯化，对5个纳米抗体在1 μL培养基中的表达量进行对比，结果显示纳米抗体Nb1和Nb2表达量符合后续试验的量。最后对纳米抗体进行蛋白质凝胶电泳和考马斯亮蓝染色验证，结果显示，分子质量为14 ku左右，符合预测纳米抗体的蛋白大小(图10)。

1～64.第3轮挑取的单克隆；BC：空白对照

1-64.Phage clones picked from the third round; BC:Blank control

图8 PE-ELISA 检测噬菌体单克隆

Fig.8 Detection of phage clones by PE-ELISA

2.6 纳米抗体亲和力

用BVDV-E0蛋白包被微孔板，50 g/L脱脂乳封闭2 h，将生物素标记的纳米抗体梯度稀释(1∶2 000,1∶4 000,1∶6 000，1∶8 000,1∶10 000，1∶12 000，1∶15 000),比较5组E0纳米抗体的亲和力，其中Nb1和Nb2的纳米抗体显示较好的亲和力(图11)。

2.7 纳米抗体活性分析

阻断ELISA分析纳米抗体的活性，在阻断ELISA体系中，纳米抗体加入量保持一致，随着加入的牛阳性血清浓度的减少，OD450nm值在不断上升。结果表明，纳米抗体不仅能结合人工抗原E0，而且能够被竞争抗体阻断，显示出良好的特异性(图12)。

曹爽和司马懿之间的对立持续了近十年，眼看小皇帝曹芳到了亲政的年龄，在曹爽主持下，太后迁居永宁宫，司马懿称病不出，曹爽占尽了明面上的优势。

M.DNA标准DL 1 000；1～5.纳米抗体基因片段

M.DNA Marker DL 1 000；1-5.The nanobody gene fragments

图9 纳米抗体基因的插入鉴定

Fig.9 Identification of insertion of the nanobody gene

M.蛋白分子质量标准；1～5.不同浓度咪唑的洗脱组分

M.Protein molecular weight Marker；1-5.The eluting components of different concentrations of imidazole

图10 纳米抗体的纯化

Fig.10 Purification of nanobody

3 讨论

E0是BVDV病毒上的一个保守的结构蛋白，属于病毒的一种囊膜糖蛋白。E0具有9个糖基化位点，其糖基化程度很高。在宿主细胞外也可检测到分泌的囊膜蛋白E0，可能与E1或E2结合形成异二聚体。E0的N末端由多聚蛋白水解而成，裂解后可分泌在宿主细胞外周[11]。在该病毒的结构蛋白中，E0属于保守性很高的蛋白，并且具备一定的免疫原性[12]。E0在同属病毒的致病过程中所起的作用很重要，结构序列分析表明E0含有中和表位，可刺激机体产生针对BVDV与CSFV的中和抗体。通过对E0氨基酸序列的分析，可知E0中含有一段保守较高的结构区域，这使得E0在研究制备基因工程亚单位疫苗以及作为基因工程诊断的抗原中担任重要的角色。本研究成功获得了BVDV-E0纳米抗体，纳米抗体不但可以用于研究E0蛋白的表达和功能，同时还能满足牧场样本检测的需求。

图11 纳米抗体亲和力鉴定

Fig.11 Identification of nanobody affinity

图12 阻断ELISA分析纳米抗体Nb1的活性

Fig.12 Bioactivity analysis of Nb1 by blocking ELISA

本研究使用原核表达体系表达的E0重组蛋白作为抗原，E0蛋白的糖基增强了抗原的免疫原性，通过2次抗原注射诱导羊驼，在此过程中免疫动物体内的浆细胞分泌大量针对E0的抗体。随后分离全血中免疫细胞，并对细胞的RNA进行提取和反转录，通过2次PCR反应确保扩增出编码构建重链抗体的基因。与此同时，还在PCR反应过程中通过引物，在目的基因两端引入酶切位点，便于构建噬菌体表达质粒，获得展示文库。本研究获得了库容为1.3×1011 cfu/mL、插入率为86%的噬菌体展示文库，满足库容标准。

噬菌体文库中的生物淘筛环节，是保证获得特异性结合E0噬菌体的重要步骤。本研究进行了连续3次生物淘筛，淘筛中的洗脱步骤去除不能和E0抗原结合的噬菌体，而能与抗原结合的噬菌体在每一轮淘筛中得到了富集。分别在生物淘筛的细菌培养平板当中，随机挑选48个单克隆，对这些单克隆进行PE-ELISA验证噬菌体与E0抗原的结合能力。本研究以阳性信号/背景信号高于3倍为界限，确保获得高亲和力的阳性克隆。

原核表达载体pET-30a(+)中有一段His-tag表达标签序列，可以方便地进行蛋白质的表达和纯化。因此，本研究用pET-30a(+)载体对pCANTAB5E噬菌体表达载体中的基因进行再次克隆、表达和纯化。结果表明，纯化后纳米抗体的大小为14 ku，符合预期纳米抗体的平均分子质量；蛋白质凝胶中未显示其他杂带说明纳米抗体的纯度较高。最后对5组纳米抗体进行ELISA亲和力测定并获得OD450 nm值，结果证明Nb1和Nb2纳米抗体与E0的亲和力都较高，并且能结合人工抗原E0，还能够被竞争抗体阻断。

纳米抗体技术作为新兴的分子识别抗体技术，拥有特异性高、亲和力强、分子质量小、稳定性好、生物工程潜力良好等特点，而且纳米抗体还具有可大规模发酵生产、价格低廉、免疫原性低、易于普及应用等优势[9]。纳米抗体可以作为高亲和力和靶向性的治疗的工具。目前AblynxTM公司针对肿瘤和自身免疫疾病，研发的靶向IL-6R、TNF-α、IL-17A/F和VEGF/Ang2等的纳米抗体药物已经进入临床研究PhaseⅡ和Phase Ⅲ 阶段。纳米抗体可以作为分子示踪剂使用，如针对血管内皮生长因子(VEGF)、巨细噬胞甘露糖受体(MMR)、人类表皮生长因子受体(HER2)等肿瘤相关分子设计的纳米抗体，在肿瘤的分子影像学研究中有着突出表现[1]。本研究获得的抗BVDV-E0蛋白的Nb1和Nb2可以通过后续不同的标记，如生物素、荧光基团和同位素等，应用于BVDV致病机理的研究及BVD的诊断。

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