屎肠球菌(Enterococcus faecium)又称粪便肠球菌，是肠球菌的一种，为人和动物胃肠道正常菌群，也广泛分布于土壤、水、食物中，是一种重要的条件致病菌，可引起人兽共患肠球菌病。近年来，随着抗菌药物和免疫制剂的广泛使用和侵入性治疗机会的增加，使得屎肠球菌成为医院感染的重要病原菌之一，可引起人尿道感染、腹腔感染、伤口感染、菌血症[1]。在美国，肠球菌已经成为医院内尿路感染和创伤感染的第2位致病菌，菌血症的第3位致病菌[2]。国内医院分离的病原菌中，肠球菌位居前3位[3]。早在1946年国外就有鸡肠球菌病例的报道[4]。国内报道有关畜禽感染肠球菌报道，多见于哺乳类[5-6]，在养鸡方面，肠球菌主要作为益生菌或微生态制剂应用于养鸡生产[3,7]，关于肠球菌引起鸡感染报道比较少。动物源性肠球菌可通过污染肉、蛋、奶等食物，引起人的感染，并在人和动物之间水平传播，因此，弄清鸡肠球菌感染情况，无论对食品安全，还是对该病防控均具有重要意义。本研究从发病的雏鸡分离了多株菌，经形态学、基因序列比对等方法鉴定为屎肠球菌，经致病力试验和病理学观察，确诊为鸡屎肠球菌感染。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料及菌株 病料为采集某鸡场病雏鸡的肝脏和心脏；相关菌株粪肠球菌、 鸡肠球菌、 禽肠球菌、小肠肠球菌、 坚韧肠球菌、 链球菌菌株来源于河北工程大学禽病研究中心。

1.1.2 主要试剂 2×Taq Mix、DNA Marker DL2000、琼脂糖为索莱宝生物科技有限公司产品；生化发酵罐为广东环凯微生物科技有限公司产品；福尔马林、乙醇、二甲苯等试剂为烟台市双双化工有限公司产品。

这也意味着，教材尤其是高校教材绝不是抄抄写写的简单工作，而是一件复杂而有创造性的工作。甚至，编教材有时候比科研还难，因为写论文只需要明确表达自己的观点就够了，编写教材需要综合考虑多方面的因素，如读者的情趣与能力，教学的要求与师生的要求以及与相关学科的关系等。

营养琼脂培养基、营养肉汤、HE琼脂培养基均来源于北京奥博星生物有限责任公司，按其说明书进行配置，并置于4℃冰箱备用。

采用细菌16S rDNA通用引物，扩增了分离菌16S rDNA部分碱基序列，通过7 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，可看出PCR产物片段为大约800 bp(图4)，与预期片段大小基本一致。

1.1.3 主要仪器 YT-12B生物组织智能脱水机、YB-2L石蜡包埋机、YK-8生物组织摊烤片机均为湖北耀楚医疗器械科技有限公司产品；莱卡组织切片机；Bio-Rad凝胶成像分析系统、Flexigene多功能型PCR仪、电泳仪，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

分离株可利用葡萄糖，不能利用甘油，不产生H2S，对阿拉伯糖、马尿酸盐、蜜二糖、蔗糖发酵不稳定(表1)。

1.2.4 分离株DNA提取 菌株纯培养之后，直接用无菌接种环挑取单个菌落到肉汤培养基中，在37℃、160 r/min摇床培养6 h～8 h。1 mL菌液离心，12 000 r/min离心5 min，弃上清；加100 μL灭菌水之后，置于90℃水浴10 min；12 000 r/min离心2 min，取上清液，保存备用。

精准扶贫第三方评估长效机制建构策略—2020年后中国减贫与发展前瞻探索系列研究之一………………莫光辉 张 菁（113）

1.2.3 细菌培养特性 取肝组织接种在营养琼脂培养基，37℃培养24 h，挑取单个菌落接种在营养琼脂培养基进行纯化培养。挑取菌落涂片，革兰染色；接种在HE培养基，37℃培养24 h，进行选择培养；接种在发酵管中进行生化试验。

1.2.2 病理切片制作 取肝脏等器官用100 mL/L福尔马林固定48 h，修块，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。制备5 μm切片，HE染色，树胶封片，显微镜观察。

1.2.5 16S rDNA的PCR扩增 采用细菌16S rDNA通用引物5′-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3′和5′-GGTTACCT TGTTACGACTT-3′对DNA提取物进行扩增。PCR反应体系：Mix 12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA1.0 μL，加ddH2O补足25 μL。PCR反应条件：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 55 s，共35个循环；72℃ 7 min；4℃终止反应，保存备用。分别取5 μL PCR产物在7 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用全自动免疫凝胶成像分析系统观察结果。引物合成和序列测定均由奥美德诺(北京)基因科技有限公司完成。

建基于16S rDNA基因序列的系统进化树。

1.2.6 目的片段的序列分析 将待测菌16S rDNA基因序列与GenBank中的核酸数据库进行BLAST比对分析，找出与其同源性最高的菌株。然后将得到的序列与近缘属几个种的同类序列一起用DNA Star7.1软件进行比对，并用MEGA6软件构

虽然表1中列举的教育教学督导和评价机制的十种方式里，能够明确给出量化和确定评比结果的只有两项：教学技能大赛和学生评教。前者依赖于评委对参赛教师的评分，后者依赖于学生对任课教师的评分。但是，近年来越来越明显地出现了一个奇怪的现象：那些被学生评教落在最后的教师，以对学生严格要求的教师为主。

1.2.7 特异引物PCR 根据锰超氧化物歧化酶基因(manganese-dependent superoxide dismutase sodA)序列设计屎肠球菌特异引物，上游(GAAAAAACAATAGAAGAATTAT),下游(TGCTTTTTTGAATTC- TTCTTTA)。PCR反应体系：Mix12.5 μL，引物各0.5 μL，模板DNA1.0 μL，加ddH2O补足25 μL。PCR反应条件：95℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 55 s，共35个循环；72℃ 7 min；4℃终止反应，保存备用。分别取5 μL PCR产物在7 g/L琼脂糖凝胶上电泳，用全自动免疫凝胶成像分析系统观察结果。

病死鸡剖检发现肝脏肿大(图1B)，出血，质地较软，有的颜色变浅为土黄色，可见条状出血，其他器官病变不明显。在显微镜下，肝小叶界限明显，肝细胞肿大，胞质疏松，内许多空泡(图1D)，窦状隙变窄，可观察到形状不规则巨噬细胞。心膜结缔组织增生，有炎性细胞浸润。

1.2.8 致病力试验 健康7日龄雏鸡10只，随机分成2组，每组5只，1组为试验组，2组为对照。试验组腹腔接种500 μL菌悬液(1×108CFU/mL)，观察症状及发病情况，并从肝脏分离细菌。

2 结果

2.1 病理变化

目前基本面情况缺乏推动行情变动的新消息，贸易摩擦是近期主导豆粕价格的重要因素。就目前情况，中美会谈正式释放和缓信号，考虑到市场近日已逐步反映对贸易摩擦和解的预期，加之2018/2019年度全球大豆供给充足，国内大豆、豆粕库存偏高的基本面情况，豆粕价格仍有继续下跌的空间。

2.2 分离株形态特征

分离株在营养琼脂上形成灰白、圆形较小菌落，不透明，表面光滑。在HE培养基形成橙黄色菌落，形状与营养琼脂没有差别(图2)。在显微镜下，菌体为圆形或椭圆形，单个、成对或多个相连存在，革兰染色阳性(图3)。

国际工程项目所在国家的人文、宗教会有所差异。每一种人文环境和宗教都会有自己的特点和习俗，比如假期、或者工作时长等。一旦在投标之前没有充分了解这些信息，在施工过程中，势必会遇到原本需要工人干活却没有工人无法干活的尴尬境况，从而影响进度，造成损失。

A.正常肝脏；B.肝脏肿大；C.正常肝脏的显微结构；D.肝细胞空泡状 A.Normal liver ; B.Hepatomegaly; C.Microstructure of normal liver; D.Vacuole hepatocytes

图1 剖检病变及病理组织学观察

Fig.1 Anatomical lesions and histopathological observation

图2 分离株菌落

Fig.2 Colonies of isolate

图3 菌体革兰染色

Fig.3 Gram stain of isolate

2.3 生化特性

1.2.1 样品采集 某鸡场新进雏鸡，从11日龄开始发病，病雏主要表现精神沉郁，羽毛不整，采食减少，少数鸡腹泻，部分病鸡死亡。收集病死雏35只，取肝脏、心脏等器官，分别进行细菌的分离和病料组织观察。

表1 分离株生化特性

Table 1 Biochemical characters of isolates

分离株Isolates阿拉伯糖Arabinose甘油Glycerinum葡萄糖Glucose密二糖D-Melibiose蔗糖Saccharose马尿酸盐水解Hippurate hydrolysisH2S标准株 Standard strain+ + -VV+ -EF1+ -+ + --EF5 --+ + + --EF6 + -+ + -+ -

注：“+”阳性；“-”阴性。

Note:“ +”Positive;“-”Negative.

2.4 PCR产物电泳

赫利森和斯普金斯的研究显示了细胞如何有效地到达脑膜。这些细胞不会穿过血脑屏障，除非脑膜受损。她们的这些研究揭开了其他分子是否使用这些通道以及它们如何影响疾病和免疫反应的诸多问题。

M. DNA标准DL 2 000; 1. 屎肠球菌EF1; 2. 屎肠球菌EF5; 3. 屎肠球菌EF6

M. DNA Marker DL 2 000；1. E.faecium EF1；2. E.faecium EF5；3. E.faecium EF6

图4 分离株16S rDNA基因PCR扩增产物

Fig.4 PCR amplification of 16S rDNA gene of isolated strains

2.5 序列测定结果和系统发育分析

利用DNA Star软件构建屎肠球菌16S rDNA基因分离株及相关菌株进化树(图5)，根据相似率不同，从系统进化树可看出，肠球菌分成禽肠球菌(E.aviumJQ800409、JQ800406 )、屎肠球菌(E.faeciumKY041757、KP771886)、肠道肠球菌(E.hiraeNR114452、AB362590)、坚韧肠球菌(E.duransKC699157、KC699219)、鸡肠球菌(E.gallinarumKX674030、LT223665)、粪肠球菌(E.faecalisJQ322228、JQ800439)以及链球菌(Streptococcus spAB714485、AB714486)。分离株(EF1、EF5和EF6)与GenBank中屎肠球菌同源性为99.6%～98.7%，分离株间同源性为99.7%～99.3%，而与GenBank中其他菌株的同源性均小于97%。按定种依据，同源性大于97%的2株菌，即可确定为同一种，该分离株应为屎肠球菌。

图5 分离株和肠球菌系统进化树

Fig.5 Phylogenetic tree of isolates and enterococci

2.6 特异引物PCR扩增结果

用屎肠球菌特异引物对分离株及相关菌株进行扩增，经琼脂糖电泳后(图6)，发现只有分离株能扩增出条带，其片段大小为215 bp，与预期的片段大小一致，链球菌和其他肠球菌均未扩增出条带，提示引物特异性较好。

M.DNA标准DL 2 000; 1.屎肠球菌EF1; 2.屎肠球菌EF6; 3.粪肠球菌; 4.鸡肠球菌; 5.禽肠球菌; 6.小肠肠球菌; 7.坚韧肠球菌; 8.链球菌; 9.屎肠球菌EF5

M.DNA Marker DL 2 000；1.E.faecium EF1；2.E.faecium EF6；3.E.faecalis；4.E.gallinarum；5.E.avium；6.E.hirae；7.E.durans；8.Streptococcus；9.E.faecium EF5

图6 分离株和相关菌株PCR结果

Fig.6 PCR results of isolates and related strains

2.7 致病力试验的结果

分离株经雏鸡腹腔注射后，3 d开始发呆厌食，7 d病症明显，死亡1只，其他鸡颈部放血致死进行剖检。其临床症状、病理剖检与临床病例基本一致，并从肝脏分离到菌株，经细菌表型和16S rDNA序列比对鉴定为屎肠球菌。

3 讨论

从20世纪70年代开始肠球菌在北美逐渐成为主要的医院感染致病菌之一，临床上以粪肠球菌(Enterococcus faecalis)感染居多，约占85%～90%。近20年内由屎肠球菌(Enterococcus faecium)所引起的感染由原来的不到10%，上升到40%左右[8]。近10年来，国内肠球菌也出现类似现象，并且屎肠球菌所引起的感染上升速度更迅速，卫生部全国细菌耐药监测2006年-2007年度报告屎肠球菌所引起的感染已占肠球菌的40%～50%。2008年以后超过粪肠球菌而占据肠球菌感染的首位[9]。对于屎肠球菌引起的感染在医学临床越来越受到重视，近年来动物感染报道逐渐增多，但还未引起重视。尽管早在20世纪60年代就有鸡感染报道，目前肠球菌主要作为益生菌用于在养鸡业[7,10-11]，有关鸡感染肠球菌鲜有报道。

在生物免疫系统中，选择应答的抗体依据其亲合力进行一定规模的克隆，克隆的数目与其亲合力成正比.基于这一原理，对每个抗体进行克隆操作 ：

本试验从11日龄发病的雏鸡肝中分离得到的3株病原菌，其菌落为圆形较小的菌落，不透明，表面光滑，菌体为圆形或椭圆形，单个、成对或多个相连存在，革兰染色阳性。这与报道的屎肠球菌菌落形态和菌体相一致[7,10]。经16S rDAN基因序列比对，与GenBank的屎肠球菌的同源性为99.6%～98.7%，而与其他相关肠球菌的同源性均不超过97%，按照16S rDAN基因比对的分类标准，同源性大于97%的2株菌，即可确定为同一种[12-13]，再结合菌落和菌体形态结构，该分离株可确定为屎肠球菌。但进一步的生化试验发现与报道的屎肠球菌标准株不完全一致，且3株分离菌的生化试验结果也有差异。这对于分离株是否为屎肠球菌产生了质疑，为此，本试验采用屎肠球菌特异PCR方法，发现只有屎肠球菌扩增出目的条带，进一步验证该分离株为屎肠球菌。Jackson C R等[14]用不同来源肠球菌100株标准株，进行PCR分析和BBL、Vitek及ID32Strep生化鉴定方法进行比较，其与标准株的符合率分别为93%、78%、85%和79%。提示PCR的方法与标准株相符性最高，在不同生化鉴定方法，肠球菌对糖发酵的结果不完全一致。这与本试验分离的3株菌对发酵试验结果类似。分析其原因可能屎肠球菌菌株不同，对糖发酵能力有差异，另外，尽管进行纯化培养，也不能排除菌株不纯的影响。

屎肠球菌为条件致性病菌，存在于正常鸡消化道内，一般不会突破黏膜屏障进入体内，因此不具有致病性。由于抗生素不合理的滥用，导致肠道菌群失调，或者通过致病质粒的水平传播及耐药基因的转座、重组作用[15-16]，获得致病基因或致病作用加强，从而导致屎肠球菌感染的发生。本研究发现感染屎肠球菌的病雏，大体病变主要是肝脏肿大、出血，显微镜下肝细胞胞质内呈空泡状。用分离的屎肠球菌菌株进行雏鸡攻毒试验，复制出相同症状的病例，并从致病试验鸡肝中分离出屎肠球菌，进一步证明屎肠球菌的致病作用。

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