烯丙孕素(altrenogest)又名四烯雌酮，是一种人工合成的甾类促孕激素，属于19-去甲睾酮类化合物[1]。烯丙孕素是一种口服有活性的孕激素，其药理活性已在多种动物模型中得到了证实。类似于其他的类固醇，烯丙孕素可凭借其脂溶性穿透靶细胞，与特定受体结合[2]。烯丙孕素通过降低内源促性腺激素(LH和FSH)的血浆浓度而起作用。低促性腺激素浓度诱导大卵泡(> 5 mm)消退，并且使卵泡生长无法大于3 mm，使得动物在给药期间不会无法发情和排卵。给药结束之后，LH血浆浓度增加，使得卵泡能够生长和成熟[3-5]。之后，动物同步开始发情周期。在兽医临床烯丙孕素已被欧盟和美国批准用于母猪和母马的同步发情。本试验在国内外现有研究基础上建立优化了一种测定猪血浆中烯丙孕素的超高液相串联质谱(UPLC-MS/MS)检测方法，为烯丙孕素口服液制剂在猪体内的药动学研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 烯丙孕素对照品，批号160415，纯度为99.2%，由宁波第二激素厂提供；睾酮对照品，纯度为99.5%，由宁波第二激素厂提供；甲酸铵，色谱级，上海安谱实验科技股份有限公司产品；乙腈，色谱纯，美国天地有限公司产品。

颖春报到上班那天晚上，我把一纸离婚协议摆在了她的面前，颖春愣了好久，但这次她没有哭，而是轻轻地问，没有挽回的余地了？我点了点头，然后，我看到颖春在那上面很轻松地签了字。

长期以来，西方普遍认为人类社会走向现代化的路径只有西方制度模式这一条道路，可以将其归结为西方文明发展演进逻辑。中国对发展道路的探索、捍卫、坚持和发展，向世界证明中国特色社会主义也是一条可以实现现代化的路径。这条路径不仅为世界上那些既希望加快发展又希望保持自身独立性的国家和民族提供了全新选择，而且为解决人类问题贡献了中国智慧和中国方案。“新的路径”“全新选择”和“中国智慧和中国方案”，就是中国文明自信演进逻辑。

四是推动溱湖生态经济区特色发展。该区域以国家5A级溱湖旅游度假区为核心区域，自然风光秀美、水乡特色鲜明。我们把“特色”贯彻始终，有序推进溱潼城市副中心与姜堰城区联动呼应，依托得天独厚的康养资源，大力发展全域旅游、大健康产业、农产品深加工、生态农业，持续完善基础设施、畅通河网水系，带动周边省级现代农业园区等协同发展，努力建设重要的生态经济区、保护区。

1.1.2 试液的配制 烯丙孕素标准储备液：精密称取烯丙孕素标准品约10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，即配成浓度为1 mg/mL烯丙孕素标准储备液，放置于-20℃下保存备用，有效期6个月。

1.2.1.3 标准曲线的制备 准确吸取适量烯丙孕素标准储备液，依次用流动相(初始比例)稀释成1 000、750、500、250、100 、50、25、10 ng/mL系列标准工作液。准确吸取空白血浆450 μL加入10 mL离心管中，再分别依次加入50 μL上述系列工作液，另用100 μL移液器精密量取100 ng/mL 的内标工作液25 μL分别置于上述离心管内。分别制得100、75、50、25、10、5、2.5、1 ng/mL烯丙孕素空白血浆系列添加浓度。空白血浆添加样品混匀后按1.2.1.2项下所述方法处理后，取上清液于2 mL自动进样瓶中供UPLC分析。不同时间重复考察5批烯丙孕素空白血浆系列添加浓度，共制备5个平行标准曲线。将所得烯丙孕素和内标(睾酮)的峰面积比(area ratio)为纵坐标，浓度(ng/mL)为横坐标作线性回归，求出回归方程和相关系数，并绘制标准曲线。

烯丙孕素标准工作液(1 μg/mL)：准确吸取适量烯丙孕素标准储备液用流动相(5 mmol/L甲酸铵水溶液∶乙腈=60∶40)稀释成1 μg/mL烯丙孕素标准工作液即可。现用现配。

内标物睾酮标准储备液：精密称取睾酮标约准品10 mg置于10 mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容，即配成浓度为1 mg/mL睾酮标准储备液，放置于-20℃下保存备用，有效期6个月。

内标物睾酮标准工作液(100 ng/mL)：用100 μL移液器准确吸取适量睾酮标准储备液用流动相(5 mmol/L甲酸铵水溶液∶乙腈=60∶40)稀释成100 ng/mL睾酮工作液即可。现用现配。

甲酸铵溶液：准确称取甲酸铵0.315 g至1 000 mL容量瓶中，用超纯水溶解并定容，混匀后经0.22 μm滤膜过滤，超声处理脱气即成。流动相现配先用。

1.1.3 主要仪器 AB SCIEX 三重四级5500系统：含串联(TQ)四级杆Mass检测器和Analyst软件,AB SCIEX公司产品；超高效液相色谱仪Waters ACQUITY UPLC 超高效液相色谱，Waters公司产品；色谱柱Inertsil C4(3.0×150 mm，5 μm)，购自扬州华明仪器设备有限公司；Pacific RO 纯水仪,购自北京五洲东方科技发展有限公司；超生波清洗器,德国Elma Elmasonic P 专业级产品；Organomation Nitrogen Evaporator 氮吹仪,美国Organomation公司产品；Genius23010、ABN2ZA氮气发生器,英国Peak Scientific公司产品；Eppendorf 5810R Centrifuge 高速冷冻离心机,购自上海肯强仪器有限公司；SI可调速漩涡混合器 VORTEX-GENIE2,上海思伯明仪器设备有限公司产品；电子分析天平,感量0.000 1 g，德国赛多利斯天平公司产品；可调微量移液器,20 μL～200 μL、100 μL～1 000 μL，德国Eppendorf公司产品；指形管(10 mL、2 mL),扬子化工玻璃仪器有限公司产品。

1.2 方法

1.2.3 稳定性试验

根据得分函数和精确度函数的定义，易证明得出梯形模糊数的排序方法。设和为两个梯形模糊数，则二者的排序规则为：

1.2.1.1 试料的制备 取新鲜或解冻的供试样品,作为供试试料；取新鲜或解冻的空白样品,作为空白试料；取新鲜或解冻的空白样品,添加适宜浓度的对照溶液，作为空白添加试料。

1.2.1.2 样品预处理 准确吸取0.5 mL新鲜或冻融的血浆样品于10 mL刻度离心管中涡旋2 min混匀后静置10 min，加入2 mL乙腈，涡旋振荡10 min，4 000 r/min离心5 min。上清液移至10 mL刻度离心管中，40℃氮吹至干。残渣用0.5 mL流动相(初始比例)溶解，涡旋振荡2 min，4 000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液转移至高效液相色谱系统的自动进样器中供UPLC分析。全程避光操作。

流式细胞学检测结果为阳性者55例，阳性诊断符合率为91.67%；免疫组化检测结果为阳性者57例，阳性诊断符合率为95.00%；流式细胞学以及免疫组化检测的阳性诊断符合率相比,无统计学差异(P>0.05)。

1.2.1.4 检测限与定量限 制备5个平行空白血浆，按照1.2.1.2项下的血浆样品处理方法处理后，上机测得平均基线噪音值。取信噪比S/N≥3时样品的最低浓度为检测限(LOD)，以信噪比达到S/N≥10时样品的最低浓度为最低定量限(LOQ)。

在0.5 ng/mL浓度添加水平时，烯丙孕素的定性和定量离子的信噪比是5.1，大于3，且相对离子丰度符合要求；在1 ng/mL浓度添加水平时，烯丙孕素的定性和定量离子的信噪比是16.8，大于10，且相对离子丰度符合要求。因此本方法的检测限和定量限可分别确定为0.5 ng/mL和1 ng/mL。

1.2.1.6 测定

①色谱条件 色谱柱：Inertsil C4(3.0×150 mm，5 μm)；流速0.4 mL/min；柱温30℃；进样量10 μL；流动相A为5 mmol/L甲酸铵水溶液，B为乙腈，梯度洗脱程序为0 min～4 min为A∶B=60∶40，4 min～8 min为A∶B=10∶90，8.1 min～10 min为A∶B=60∶40，流速为0.4 mL/min。

②质谱条件 离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：质谱多反应监测(MRM)模式；检测器：串联(TQ)四级杆Mass检测器；去簇电压：126.8 U/V；喷雾电压：5500.0 V；气帘气压力：20.0 Psi；碰撞室压力：8 Psi；离子化(离子源)温度：550.0℃。烯丙孕素的定量离子对为311.1>227.2，辅助定性离子对为311.1>199.1；睾酮的定量离子对为289.2>109.1。

③定量测定 将血浆样品按“1.2.1.2”项下血浆样品处理方法处理后，再按“1.2.1.6”项下的色谱条件进行UPLC分析，测出待测物和内标物的峰面积，按内标法以峰面积比计算，并代入当天随行的标准曲线，算出血浆中烯丙孕素的含量。

1919年5月6日，北京爆发反帝反封建的“五四”运动的消息传到浙江。经亨颐与刘大白立即以浙江教育会名义拍电报致国务院和教育部，要求立即释放“五四”运动中被捕的学生，并于当日召开全校师生紧急大会，动员师生立即响应。又以教育会名义召集各校校长商议办法，成立“杭州学生联合救国会”，动员杭州各校师生立即参加到声援北京学生的爱国斗争中去。从而，浙江一师成为江南新文化运动的中心。魏金枝说：“‘五四’运动在北京爆发，全国响应，浙江省立第一师范学校就成为当时中国东南部文化运动的重镇。”⑤这时，魏金枝成了一个学生运动的热中者。

1.2.2 检测方法的性能测试

1.2.2.1 专属性或特异性 通过分析6份不同来源的猪空白血浆样品考察内源性干扰对方法专属性的影响。对来自6份不同来源的猪空白血浆样品，烯丙孕素和IS保留时间上应不存在任何内源性杂质的显著干扰。如存在干扰，则通过对3份加标水平为LOQ的血浆样品按照前述样品预处理方法进行提取，确定烯丙孕素在LLOQ水平及内标物(IS)在相应浓度时的参考峰面积，应用下列公式测定干扰程度(%)：

干扰(%)=A(空白)/A(LLOQ)×100%

对于烯丙孕素，如存在干扰，干扰峰面积应低于LLOQ水平峰面积的20%；对于内标，如存在干扰，干扰峰面积应低于IS峰面积的10%。

1.2.3.4 样品室内短期放置稳定性 分别制备浓度为1、50、100 ng/mL的3个空白血浆添加样品，每个浓度制备6个平行样品。按“1.2.1.2”项下血浆样品预处理方法处理后，将滤液移至自动进样瓶后放置自动进样器内(4℃)约8 h，分别于0 h、8 h时按照“1.2.1.6”项下的色谱与质谱条件进行测定，以考察提取液样品室内短期放置稳定性。

On Different Standards for Indoor Vibration Caused By Subway Trains……………ZHOU Xingmin， WANG Qiaoyan(2·1)

1.2.2.3 基质效应 基质效应是指在样品测试过程中，由待测物以外的其他物质的存在，直接或间接影响待测物响应的现象[6-7]，基质效应分为绝对基质效应和相对基质效应[8-10]。

1.2.1.7 空白试验 除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。

绝对基质效应的评价：制备2组待测样品。①将烯丙孕素和睾酮溶于乙腈溶液，并稀释成相对应的浓度；②提取空白血浆基质，用流动相甲酸铵溶液∶乙腈(60∶40)稀释烯丙孕素和睾酮，加入复溶的空白基质中。将①和②放入系统进行分析，得到烯丙孕素和睾酮的峰面积，其中烯丙孕素或睾酮在②和①中峰面积的比值为绝对基质效应，用基质效应因子(matrix factor，MF)来表示，烯丙孕素与睾酮MF的比值称为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)。

相对基质效应的评价：相对基质效应大小可以用 IS-normalized MF 的变异系数(CV)来判断。选择6个不同来源的猪空白血浆，测得烯丙孕素和睾酮的MF，(待测物浓度通常选择一个低浓度即可，其浓度应在3×LOQ以内)，并计算内标归一化基质效应因子，利用获得的6个内标归一化基质效应因子计算变异系数，其值应小于15%。

1.2.1 测定步骤

蒙脱石可结合带正电的阳离子（如镁、钙、钾、钠等），具有开放结构，有利于离子交换，负载对人体安全并具有抗菌活性的纳米级锌、钛等金属离子，可有效抑制口腔中的有害菌，预防和减轻牙龈炎症，保护口腔健康；锌、钛离子能够与口腔细菌和有机物中的巯基（-SH）和氨基（-NH）官能团发生反应，分解产生异味的有机分子，快速消除口腔异味。

1.2.3.1 储备液稳定性 将制备烯丙孕素和内标储备液于-20℃下冻存放置6个月，期间分别于0、1、3和6个月时按照“1.2.1.6”项下的色谱与质谱条件进行测定，以考察储备液冻存期间稳定性。分别制备添加浓度为1、50、100 ng/mL的3个空白添加样品，每个浓度制备6个平行样品。分别进行储备液冻存(在-20℃放置6个月)、预处理样品(制备后的待测滤液)放置自动进样器内(4℃放置约8 h)、样品长期冷存(在-20℃放置3个月)和反复冻融(反复冻融处理3次)条件下的稳定性考察。当同一浓度水平至少5个稳定性样品测定值与真实值的相对误差百分率在±15%范围内时，则表明相关样品在相应条件下放置可稳定保存。

1.2.3.2 样品冻存稳定性 分别制备浓度为1、50、100 ng/mL的3个空白血浆添加样品，每个浓度3个平行，在-20℃放置3个月，分别于0和3个月时按照“1.2.1.2”方法处理，按照“1.2.1.6”项下的色谱与质谱条件进行测定。

1.2.3.3 样品冻融稳定性 分别制备浓度为1、50、100 ng/mL的3个空白血浆添加样品，每个浓度3个平行，在-20℃反复冻融3次。每次按照“1.2.1.2”方法处理，按照“1.2.1.6”项下的色谱与质谱条件进行测定。

1.2.2.2 记忆效应(残留效应) 精密吸取500 μL猪空白血浆，按照“1.2.1.2”项下样品预处理方法处理后制得空白基质样品，共制备4份空白基质样品。在同一次运行期间，在标准曲线最高浓度点(100 ng/mL)后进行空白样品进样测定。在同一次分析运行内使用3个LOQ平行质控样品进样，测定烯丙孕素在LOQ以及IS在相应浓度时的参考峰面积。用空白基质样品分析物的残留峰与最低定量下限(1 ng/mL)分析物峰面积比，考察LC-MS/MS系统的记忆效应。

2 结果

2.1 标准曲线及线性范围

标准曲线测定结果见图1。结果表明，烯丙孕素在1 ng/mL～100 ng/mL范围内线性关系良好，相关系数达到0.999以上。

2.2 检测限与定量限

1.2.1.5 准确度和精密度 将一定浓度的烯丙孕素标准工作液各50 μL加至450 μL空白血浆中，分别制得1、50、100 ng/mL 3个浓度的烯丙孕素空白血浆添加样品，另用100 μL移液器精密量取100 ng/mL 的内标工作液25 μL分别置于上述离心管内。混匀后按“1.2.1.2”项下血浆样品预处理方法处理后，滤液供UPLC分析，确定其峰面积。每个浓度水平设6个平行(日内)，共重复考察3批(日间)，据此分别计算出日内和日间变异系数。

做法：1.鸡翅中处理干净，用刀尖在每个翅上各戳几下，放入保鲜盒，加盐、胡椒粉、料酒、生抽、干红椒段拌匀，盖上盖，放入冰箱，腌渍6 h以上。

2.3 准确度和精密度

准确度和精密度测定结果见表1和表2。结果表明，烯丙孕素在低(1 ng/mL)、中(50 ng/mL)及高(100 ng/mL)下的批内平均回收率均大于80%，变异系数均小于15%。批间平均回收率均大于85%，变异系数均小于9%。

2.4 检测方法的性能测试

2.4.1 检测方法的特异性 通过考察至少来自6只不同猪的空白血浆的测定结果表明，血浆中的内源性杂质不干扰样品中待测物的测定，空白血浆、空白血浆添加烯丙孕素和IS(睾酮)的典型色谱图见图2～图7。在本试验建立的色谱检测条件下，烯丙孕素和内标物均能与血浆中其他基质组分完全分开，且峰形良好。内标物(睾酮)和烯丙孕素的出峰时间分别约为4.38 min和4.77 min。

桥本甲状腺炎是自身免疫甲状腺炎的主要类型，其起病隐匿，进展缓慢，临床表现甲状腺肿，甲状腺功能可以是正常、亢进或减退。有研究显示，碘摄入量是影响本病发生发展的重要环境因素，碘摄入量增加可以促进患者出现甲状腺功能异常。因此，自身免疫甲状腺炎患者要适当限碘，可以食用加碘食盐（6克/天），但适当限制海带、紫菜、海苔等富碘食物的摄入。

终于，天葬师停了下来。天葬台上的尸体仍旧完整，然而细看，才能发现尸身上分布着密密麻麻的纤细刀口，横竖斜捺，密如蛛网。

图1 标准曲线

Fig.1 Standard working curve

表1 血浆中烯丙孕素的添加回收率

Table 1 The recovery rate of altrenogest in plasma

添加浓度/(ng·mL-1)Added concentration回收率/% Recovery rate123456x±SD196.696.989.590.096.688.993.1±3.985085.295.889.688.8100.496.692.7±5.7510088.984.291.091.784.692.888.9±3.69

表2 血浆样品精密度测定

Table 2 Determination of plasma sample precision

添加浓度/(ng·mL-1)Added concentration回收率/% Recovery rate123456批内/%Intra-runx±SDCV批间/%Inrer-runx±SDCV96.696.989.590.096.688.993.1±3.984.27183.986.186.489.190.982.986.6±3.033.5089.4±7.92 8.8693.670.097.295.699.874.988.5±12.714.3585.295.889.688.8100.496.692.7±5.756.205079.289.887.284.689.484.085.7±3.984.6486.9±6.097.0186.080.681.485.479.480.282.2±2.823.4388.984.291.091.784.692.888.9±3.694.1510084.884.683.981.789.986.785.3±2.783.2785.0±4.345.1181.777.779.683.879.983.281.0±2.332.88

图2 烯丙孕素质谱图

Fig.2 Mass spectrum of altrenogest

图3 睾酮质谱图

Fig.3 Mass spectrum of testosterone

图4 空白血浆总离子流图

Fig.4 Total ion flow diagram of blank plasma

图5 烯丙孕素对照品(1 ng/mL)加内标(睾酮)总离子流图

Fig.5 Total ion flow diagrams of altrenogest(1 ng/mL)and testosterone in standard sample

图6 空白血浆添加烯丙孕素(1 ng/mL)与内标(睾酮)总离子流图

Fig.6 Total ion flow diagrams of altrenogest(1 ng/mL)and testosterone in blank plasma

2.4.2 记忆效应 结果表明，烯丙孕素的记忆效应均在最低定量下限的20%以内，且内标物(睾酮)不超过定量下限内标峰面积的5%。在后续真实样品分析中，仍然会考察每一批样品的UPLC-MS/MS系统的记忆效应。

表3 记忆效应检测

Table 3 Memory effect detection

加标浓度/(ng·mL-1) Added concentration峰面积 Peak area1空白基质Blank matrix面积比/%Area ratio1.28e49.40e27.34烯丙孕素 Altrenogest1.20e4N/AN/A1.23e4N/AN/A4.98e42.40e34.82睾酮 Testosterone5.24e42.53e34.834.78e4N/AN/A

注：N/A为检测不到。

Note:N/A means can't be detected.

2.4.3 基质效应 基质效应测定结果见表4。由表4可知，烯丙孕素在猪空白血浆添加水平为1 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的浓度时基质效应在109.23%～114.65%，定量下限相对基质效应的CV 为 8.05%，小于 15%，符合 EMEA 指导原则的规定。结果表明，猪的空白血浆对烯丙孕素测定的基质效应不明显。

2.5 稳定性试验测定结果

2.5.1 储备液稳定性 烯丙孕素和内标物储备液的稳定性测定结果分别见表5。结果表明，烯丙孕素和内标物在-20℃冻存条件下放置6个月仍可保持稳定。

2.5.2 样品贮存稳定性 血浆样品贮存期间稳定性测定结果见表6。结果表明，血浆样品在-20℃冻存条件下放置，待测物至少可保持稳定3个月。

2.5.3 上样液在分析室中的稳定性 上样液在分析室中的稳定性测定结果见表7。结果表明，上样液中待测物烯丙孕素和内标物睾酮在分析室内分析期间可保持稳定性达8 h。

表4 基质效应对待测药物的影响

Table 4 Effect of matrix effect on tested drugs

加标浓度/(ng·mL-1)Added concentrationMF/%烯丙孕素 Altrenogest睾酮 TestosteroneIs-normalized MFCV/%基质效应/%Matrix effect15010052.9048.811.0852.3747.691.1050.1041.301.2148.8338.521.278.0545.7244.651.0249.7941.751.1944.6144.631.0047.3542.301.12 42.9238.301.1242.0840.101.05 44.2738.121.16 42.1238.171.10 44.9839.611.1447.7741.391.1545.7339.431.1643.1239.601.0943.2238.811.1144.2137.981.16114.65109.23113.59

表5 -20℃储存下烯丙孕素储备液的稳定性测定结果

Table 5 Stability determination of altrenogest stock solution at -20℃

加标浓度/(ng·mL-1)Added concentration实测浓度/(ng·mL-1)Measured concentration01个月1 month 3个月3 months6个月6 monthsCV/%5048.6247.7153.7053.70 52.4853.0253.2051.65 46.6755.9447.8753.61 51.1049.8852.8951.80 49.9843.3546.8553.40 51.1452.8649.8855.47 5.98

表6 血浆样品在-20℃冻存下待测物的稳定性测定结果

Table 6 Stability determination of altrenogest in plasma after freezing at -20℃

加标浓度/(ng·mL-1)Added concentration实测浓度/(ng·mL-1) Measured concentration03个月(-20℃)3 monthsCV/%1501000.8250.8090.8350.710.7540.870.790.810.8590.940.7571.0143.142.140.945.741.349.943.343.740.351.440.641.983.087.679.893.080.997.285.499.081.295.584.782.69.938.257.86

表7 分析室内(4℃)放置8 h后上样液中烯丙孕素 的稳定性测定结果

Table 7 Stability determination of altrenogest in plasma after sample room(4℃) for 8 h

加标浓度/(ng·mL-1)Added concentration实测浓度/(ng·mL-1) Measured concentration08 hCV/%1501000.7961.010.8640.7990.8380.9350.8050.7100.8090.8400.8781.0140.249.345.649.344.339.142.939.245.542.842.741.297.378.710288.791.577.588.282.097.898.591.610410.47.969.65

2.5.4 反复冻融下的稳定性 经3次循环冻融后血浆样品中烯丙孕素的测定结果见表8。结果表明，循环冻融对血浆样品中烯丙孕素的稳定性无影响。

表8 3个冻融循环(+25℃/-20℃)后血浆样品中烯丙孕素的稳定性测定结果

Table 8 Stability determination of altrenogest in plasma after three freeze-thaw cycles(+25℃/-20℃)

加标浓度/(ng·mL-1)Added concentration实测浓度/(ng·mL-1) Measured concentration0冻融3次Three freeze-thaw cyclesCV/%1501000.8990.9170.8390.9790.8361.010.8491.040.9081.060.9711.0343.253.748.746.945.552.145.65451.048.348.950.690.410285.710494.110293.599.986.710294.699.28.576.896.52

3 讨论

目前国内外有关烯丙孕素在猪血浆中含量测定方法未见报道。鉴于烯丙孕素在猪血浆含量很低，因此本试验采用了UPLC-MS/MS定量分析方法对用药后猪血浆中的含量进行定量分析。在提取剂的选择方面，分别考察了文献报道中的乙腈和乙酸乙酯提取剂[11]，结果发现乙腈在提取回收率和除蛋白的能力强于乙酸乙酯，故选用乙腈作为提取剂。在色谱柱的选择上，曾试用过Kromasil C8(2.0×50 mm，5 μm)色谱柱，流动相为5 mmol/L甲酸铵水溶液和甲醇，但存在峰拖尾现象，在调试过流动相pH值、流动相比例、梯度洗脱程序、甲酸铵水溶液浓度后没有明显改善，最后采用了C4色谱柱。在流动相的选择上，在试验过程中曾试用过乙醇和甲酸铵水溶液流动相，但系统压力过大，不利于系统运转，也曾试过甲醇和甲酸铵水溶液流动相，但峰形不好看，分离效果不好。在洗脱程序上，试过等度洗脱，但峰宽过宽，且峰形不好看，最后确定采用梯度洗脱。在内标法定量的选择上，优点是测定的结果较为准确，在一定程度上消除了操作条件等的变化所引起的误差。在内标物睾酮的选择上，睾酮和烯丙孕素都是激素类，且在色谱图能相互分开，不受彼此影响，故选用睾酮作为内标物。关于线性范围，烯丙孕素高于100 ng/mL后，线性关系不再良好，且容易造成系统的记忆效应，因此将线性范围定为1 ng/mL～100 ng/mL。从准确度、精密度和稳定性试验结果可以看出，试验误差比较小，采用内标法可精准定量。本试验建立的猪血浆样品中烯丙孕素提取和含量测定方法，具有快捷有效、操作简单、专属性强、高灵敏度等优点，适用于猪血浆中烯丙孕素含量的定量分析，可用于烯丙孕素药物代谢动力学及生物利用度的研究。

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