鸡传染性支气管炎(Infectious bronchitis，IB)是由鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)引起的一种急性、高度接触性呼吸道传染病[1]。IBV基因组，尤其是S1基因十分容易发生点突变、缺失、插入和重组，导致病毒的基因组、致病性及免疫原性发生变异，血清型复杂且不同血清型间交叉保护作用强弱不一，给本病的防控带来很大的困难。疫苗接种是IB防控的有效措施，常用疫苗包括H120、Ma5及4/91弱毒苗。研究表明，目前国内大部分IBV流行株发生了变异，而且绝大多数流行株与常用疫苗株血清型不同[2-8]。因此，建立IBV常用疫苗株和地方流行野毒株的鉴别方法非常重要。

研究表明，不同国家、不同地区流行的IBV毒株不同。Han Z X等[9]通过对IBV的血清型、免疫保护型和基因型进行分析，将我国流行的IBV毒株划分为9个型，其中50%以上的IB病例都是LX4型的病毒引起的。其他学者也报道国内IBV存在多个基因型[5-8,10]。本课题组研究表明，广西存在着多种基因型IBV毒株的流行，包括LX4型、CK/CH/LSC/99Ⅰ型、4/91型、Mass型、LDT3型、Taiwan型和新型，其中LX4型为广西主要流行IBV株，疫苗型毒株所占比率较小[5-8]，同时，广西存在多个血清型IBV流行，且大部分流行株的血清型不同于疫苗株[7-8]。广西作为养禽大省，多年来免疫鸡群仍频繁发生IB，给广西养禽业造成很大的经济损失。因此，建立一种可区分IBV疫苗株(Mass型、4/91型)与广西地方流行野毒株(LX4型、LDT3型、Taiwan型、CK/CH/LSC/99Ⅰ型、新型)的快速鉴别诊断方法具有重要的现实意义。

IBV分型方法有多种，其中IBV血清分型方法费时费力，加上IBV各血清型之间存在交叉反应，因此血清学方法难以区别疫苗免疫鸡和野毒感染鸡。其他鉴别方法如S1基因分型方法也常常被采用，但S1基因容易变异，导致某些毒株不能得到扩增[11-12]。因此，这些方法在区分疫苗株与地方流行野毒株方面均有缺陷。鉴于此，本研究利用针对IBV 3′端非编码区和S1基因保守区域的两对特异性引物，对广西IBV流行株与疫苗株进行鉴别，旨在为该病的临床诊断、流行病学调查和了解IBV的变异规律等提供技术支持。

凌薇有着所有大小姐的通病，盛气凌人却又同情心泛滥。安安的贫穷和谄媚极对凌薇的胃口，所以安安轻而易举地成为凌薇的闺蜜。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 疫苗株H120、Ma5、4/91和参考株M41为广西大学养禽与禽病研究所保存，26株广西IBV分离株(GX-C、 GX-XD、GX-G、GX-NN1、GX-NN2、GX-NN3、GX-NN4、GX-NN5、GX-NN6、GX-NN7、GX-NN8、GX-NN9、GX-NN10、GX-NN11、GX-NN12、GX-YL1、GX-YL2、GX-YL3、GX-YL4、GX-YL5、GX-YL6、GX-YL7、GX-YL8、GX-YL9、GX-GL1、GX-LZ1)由广西大学养禽与禽病研究所分离鉴定并保存[5-6]。

用建立的二重RT-PCR鉴别方法，随机选取3株IBV(GX-YL9,GX-YL5,GX-NN8)流行毒株，分别与Mass型毒株H120进行两两混匀，进行扩增后的电泳结果如图2所示。结果显示，IBV均能扩增出预期的特异性片段，即H120与GX-NN8混合后出现约为370 bp(H120)和320 bp(GX-NN8)2个条带。H120与GX-YL5混合后出现约为370 bp(H120)和345 bp(GX-YL5)2个条带。H120与GX-YL9混合后出现约为370 bp(H120)和260 bp(GX-YL9)2个条带。证明了二重RT-PCR方法可以鉴别Mass型IBV和广西流行野毒株的混合感染。

马库什权利要求的修改和部分优先权问题探讨............................................................................................柳 冀 01.92

分别选取IBV毒株H120、GX-NN7、GX-YL5

1.1.3 引物 参考有关文献[13-14]和GenBank中公布的IBV核苷酸序列的保守部位设计合成2对特异性引物。第1对引物序列如下，P1上游引物：5′-GAGAGGAACAATGCACAGC-3′，P2下游引物：5′-CATTTCCCTGGCGATAGAC-3′。P1引物位于N基因3′末端，P2引物位于3′UTR保守序列，扩增产物约为347 bp。第2对引物序列如下，P3上游引物：5′-AAAGTGCCTTTAGGCCTGG-3′；下游引物P4：5′-ATAAACGCCTGCACCCGTA-3′。此对引物扩增区域为S1基因，预期扩增片段为482 bp。引物由上海英俊生物技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 RNA抽提和反转录 疫苗株H120、Ma5、4/91、参考株M41及26株广西IBV分离株分别接种9日龄鸡胚，常规培养72 h后，无菌收集尿囊液，抽提尿囊液中病毒基因组RNA，参照总RNA抽提试剂盒说明书抽提IBV基因组RNA。取抽提的RNA样品14.5 μL，加入随机引物1 μL(25 pmol/μL)，70℃ 5 min，冰浴5 min，然后加入5×RT buffer 5 μL、dNTPs 2 μL、RNasin 0.5 μL、M-MLV逆转录酶1 μL(200 U/μL)，混匀，置42℃ 1 h，96℃ 5 min，即得cDNA。

程序性细胞死亡蛋白4在大鼠脑出血后血肿周围域的表达及作用………………… 沈加兵 季宇腾 周婷婷 等（3）383

的RNA，经核酸蛋白仪测定并作10倍递增稀释，图3电泳结果表明，IBV Mass毒株H120的RNA最低检测量为100 pg，IBV 4/91型毒株GX-NN7的RNA最低检测量为10 pg，IBV广西流行毒株GX-YL5的RNA最低检测量为100 pg。

1.2.4 二重RT-PCR的临床应用 应用所建立的二重RT-PCR对本课题组的IBV攻毒鸡的54份组织样品(气管、肾脏和肺脏各18份)进行检测。所用的攻毒病毒为广西分离株GX-NN2、GX-NN1、GX-C、GX-YL1、GX-G、GX-YL5、GX-NN6和GX-YL9。病料采自14日龄攻毒的小鸡，攻毒后第5天和第13天进行样品采集。

1.2.2 二重PCR扩增 应用2对引物对30株IBV毒株进行PCR扩增，扩增条件如下：94℃ 5 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 55 s，共35个循环；72℃延伸6 min。反应完毕后,取5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳并进行PCR产物的回收纯化。将纯化产物与PMD18-T 载体连接，转化DH5ɑ 感受态细胞，扩大培养后提取质粒进行PCR初步鉴定，阳性重组质粒委托上海英骏生物技术有限公司测序。

2 结果

2.1 二重RT-PCR鉴别方法特异性扩增结果

关于应用RT-PCR技术检测组织病料中的IBV报道[3-4,11-12,15-16]较多，但从病料中检测并鉴别IBV Mass型疫苗株、4/91型疫苗株与流行野毒株的报道很少。IBV血清型众多，即使免疫鸡群抗体水平很高，但因为疫苗株对同型毒株保护力强，对异型毒株只能产生部分或无保护作用，因此常常导致免疫失败[15]。而临床上血清检测又很难进行疫苗毒与野毒的区分，且耗时费力。本研究建立的鉴别方法，不仅可以检测鸡胚增殖的病毒，而且可从攻毒组织病料中鉴别IBV Mass型疫苗株、4/91型疫苗株与流行野毒株，说明本方法不但可用于检测混合感染，也可区分其感染病毒的基因型。本研究建立的鉴别方法在国内外未见报道，具有一定的创新性。

在传统观念下的中高职语文教学中，教师讲解知识，学生则被动地听讲或做笔记，这种满堂灌的教学方法，不利于发挥学生学习的主体作用，会让学生觉得枯燥乏味，影响学生语文学习的效率和效果。因此，在新时期的高职语文教学中，要想提高传统文化教学的效果，就必须以学生为中心，让学生参与传统文化学习的主体作用得到充分发挥，让学生成为传统文化学习的主人。

M.DNA 标准 DL 500; 1.M41; 2.H120; 3.Ma5; 4.GX-NN2; 5.GX-NN7; 6.4/91; 7.GX-NN1; 8.GX-NN5; 9.GX-NN6; 10.GX-NN9; 11.GX-NN10; 12.GX-NN11; 13.GX-NN12; 14.GX-YL1; 15.GX-YL2; 16.GX-YL3; 17.GX-YL4; 18.GX-YL5; 19.GX-YL6; 20.GX-YL8; 21.GX-C; 22.GX-G; 23.GX-XD; 24.GX-LZ1; 25.GX-GL1; 26.GX-NN4; 27.GX-NN3; 28.GX-NN8; 29.GX-YL7; 30.GX-YL9; 31.ALV; 32.MDV; 33.IBDV; 34.NDV; 35.ILTV; 36.阴性对照

M.DNA Marker DL 500; 1.M41; 2.H120; 3.Ma5; 4.GX-NN2; 5.GX-NN7; 6.4/91; 7.GX-NN1; 8.GX-NN5; 9.GX-NN6; 10.GX-NN9; 11.GX-NN10; 12.GX-NN11; 13.GX-NN12; 14.GX-YL1; 15.GX-YL2; 16.GX-YL3; 17.GX-YL4; 18.GX-YL5; 19.GX-YL6; 20.GX-YL8; 21.GX-C; 22.GX-G; 23.GX-XD; 24.GX-LZ1; 25.GX-GL1; 26.GX-NN4; 27.GX-NN3; 28.GX-NN8; 29.GX-YL7; 30.GX-YL9; 31.ALV; 32.MDV; 33.IBDV; 34.NDV; 35.ILTV; 36.Negative control

图1 广西IBV分离株和疫苗株的二重RT-PCR扩增产物电泳图

Fig.1 Electrophoresis of duplex RT-PCR products of Guangxi IBV isolates and vaccine strains

M.DNA标准DL 500; 1.GX-NN8与H120; 2.GX-YL5与H120; 3.GX-YL9与H120; 4.阴性对照

M.DNA Marker DL 500; 1.GX-NN8 and H120; 2.GX-YL5 and H120; 3.GX-YL9 and H120; 4.Negative control

图2 H120与IBV广西分离株二重RT-PCR的电泳结果

Fig.2 Electrophoresis of duplex RT-PCR products of H120 and Guangxi IBV isolates

2.2 二重RT-PCR的敏感性试验结果

1.1.2 试剂 rTaq DNA聚合酶(5 U/μL)、M-MLV逆转录酶(200 U/μL)、RNasin (RNA抑制剂)、随机引物、5×RT buffer、dNTPs (10 mmol/L)、10×PCR buffer (Mg2+)和DNA Marker 500，宝生物工程(大连)有限公司产品；总RNA抽提试剂盒，北京天根生物技术有限公司产品。

1.2.3 二重RT-PCR特异性与敏感性试验 取30株IBV毒株cDNA、本实验室保存的鸡传染性喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis virus，ILTV)、新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、传染性法氏囊病毒(Infectious bursal disease virus，IBDV)、马立克病毒(Marek's disease，MDV)和禽白血病病毒(Avian leucosis virus，ALV)提取的核酸应用上述建立的二重RT-PCR扩增体系进行扩增。随机选取3株IBV(GX-YL9、GX-YL5、GX-NN8)毒株，分别与疫苗株H120进行两两混匀，二重RT-PCR扩增后以检测该方法的特异性。选取IBV毒株H120、GX-NN7、GX-YL5的RNA进行10倍梯度稀释，进行二重RT-PCR扩增，以检测该方法的敏感性。

2.3 二重RT-PCR方法的临床检测结果

应用建立的二重RT-PCR鉴别方法，对GX-NN2、GX-NN1、GX-C、GX-YL1、GX-G、GX-YL5、GX-NN6和GX-YL9攻毒鸡的气管、肾脏和肺脏共54份组织样品进行检测。检测结果表明，18份气管、肾脏和肺脏的阳性分别有17、17和15份为阳性。因此，54份组织样品中49份(90%)检测为阳性。部分病料检测电泳结果见图4。GX-NN2(Mass型毒株)的电泳条带为370 bp；其余7株广西流行野毒株的电泳条带介于345 bp～260 bp。阳性扩增带与预计大小相符。

M.DNA 标准 DL 600; 1～6.GX-YL5的RNA浓度分别为1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng; 7～12.GX-NN7的RNA浓度分别为100 fg、1 pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng; 13～18.H120的RNA浓度分别为1pg、10 pg、100 pg、1 ng、10 ng、100 ng; 19.阴性对照

M.DNA Marker DL 600; 1-6.RNA of GX-YL5 with 1 pg,10 pg,100 pg,1 ng,10 ng,100 ng,respectively; 7-12.RNA of GX-NN7 with 100 fg,1 pg,10 pg,100 pg,1 ng,10 ng,respectively; 13-18.RNA of H120 with 1pg,10 pg,100 pg,1 ng,10 ng,100 ng,respectively; 19.Negative control

图3 二重PCR敏感性试验的电泳结果

Fig.3 Electrophoresis of sensitivity test of duplex PCR assay

M.DNA 标准 DL 600; 1.GX-YL9; 2.GX-NN6; 3.GX-YL5; 4.GX-G; 5.GX-YL1; 6.GX-C; 7.GX-NN1; 8.GX-NN2; 9.阴性对照

M.DNA Marker DL 600; 1.GX-YL9; 2.GX-NN6; 3.GX-YL5; 4.GX-G; 5.GX-YL1; 6.GX-C; 7.GX-NN1; 8.GX-NN2; 9.Negative control

图4 部分IBV感染病料的二重RT-PCR检测结果

Fig.4 Detection results of part IBV infected samples by duplex RT-PCR

3 讨论

应用设计的2对引物对H120、Ma5、4/91疫苗株、参考株M41及26株广西分离株进行二重RT-PCR扩增，并以ILTV、NDV、IBDV、MDV和ALV提取的核酸作为阴性对照，扩增结果如图1所示。结果显示，扩增后M41得到约160 bp的目的片段，Mass型毒株(H120、Ma5、GX-NN2)得到约370 bp的目的片段，4/91型IBV(4/91、GX-NN7)得到约480 bp和345 bp 2条目的片段，其他24株广西分离株得到1条介于260 bp～345 bp的目的片段，ILTV、NDV、IBDV、MDV和ALV均不出现特异性扩增。所有目的条带克隆测序结果通过NCBI的BLAST进行验证，表明均为IBV序列。

应用建立的二重RT-PCR方法对26株广西流行野毒株进行扩增，发现GX-NN2为Mass型毒株、GX-NN7为4/91型毒株与本课题组根据S1基因进行分型的结果相一致[5]。本研究建立了鉴别IBV Mass型(M41、Ma5、H120、GX-NN2)疫苗株、4/91型(4/91、GX-NN7)疫苗株与24株广西流行野毒株的二重RT-PCR方法。该方法仅用2对引物就能从电泳条带的数目和大小准确把IBV Mass型(M41、Ma5、H120、GX-NN2)疫苗株、4/91型(4/91、GX-NN7)疫苗株与24株广西流行野毒株区别开来，且重复性好，敏感性高。方法的实际应用证明了该方法的可行性。当然该方法的通用性还需要收集更多的IBV地方分离株进行验证，但该鉴别方法可将Mass型疫苗株、4/91疫苗株与广西流行野毒株三者区分开，这是常规的血清学方法很难做到的，大大减少因为接种疫苗与感染鸡群血清型不符，造成免疫失败而引起的经济损失。因此，本研究具有很好的临床应用价值。

大法官官邸部文件中也指出，在挑选治安法官时应根据候选人的基本素质，不论种族、性别、宗教信仰、政党，也不论是否残疾。[1]211治安法官应具有代表性，来源于较大范围的背景和职业，只要热心地方公共事务，具备六个基本素质，每个人都有平等的机会被任命为治安法官。

刘思国等[15]利用M41毒株在3′UTR缺失近200 bp的特点，区分M41毒株与其他毒株。澳大利亚学者Mardani K等[13]将澳大利亚疫苗株与分离株相比，其3′UTR缺失了58 bp的片段，也可从电泳片段大小上鉴别澳大利亚疫苗株与分离株。周生等[16]选择IBV M基因以及3'UTR设计2对引物，采用二重RT-PCR对11株四川地方分离株进行检测，从而把M41、疫苗株H52、B48和11个四川分离株区分开来。于静等[12]通过特异性引物设计及酶切分型，可区分M41血清型(M41、疫苗株H52和H120)，但无法区分4/91型。已有研究表明，IBV广泛存在4/91型、Mass型(M41、H52和H120)与野毒株混合感染[5-9,17-21]。因此，临床上将4/91型、Mass型与其他分离毒株区分开，具有重要的现实意义。本研究可以对4/91型、Mass型与广西流行野毒株三者间进行区分，值得推广应用。

再次是经济发展中的生产方式调整。壮拳文化作为壮人的传统身体文化，理应在壮人恋土保守的性格中得以确切传承，但经济发展中的生产方式变了。当壮拳不再是经济洪流中的“枝头俏”，也就面临着被淘汰的境遇。“爷爷教拳要是收徒弟学费，咱家早就是这条街最富的了”“没时间学，学了也不能当饭吃”[27]，恪守古训、弟子五千、曾经风光无限的壮拳大师农式丰在面对当今生产方式改变的情况下也难逃扼腕垂泪、无奈孤独的命运。

本研究建立的鉴别诊断方法还具有快速特点。将本方法应用于IBV攻毒鸡肺脏、脾脏和肾脏组织病料检测，从组织病料研磨、RNA抽提、反转录、PCR扩增至电泳，整个过程仅需5 h～7 h。该方法与传统的血清学相比，具有更快速、敏感和高效的优势；和传统RT-PCR相比，具有既能诊断又能鉴别IBV不同基因型的优势。下一步工作将此鉴别诊断方法应用于更多临床样品的检测。

总之，本研究建立的二重RT-PCR可以很好区分Mass型疫苗株、4/91型疫苗株与广西流行野毒株，但不能将广西优势血清型与其他血清型区分开。因此，建立一种可以区分广西优势血清型与其他血清型的方法有待进一步研究。

参考文献:

[1] 塞 弗Y M.禽病学[M].11版.北京:中国农业出版社,2005:108-130.

[2] Beaudette F R,Hudoson C B.Cultivation of the virus of infectious bronchitis [J].Am J Vet Res,1937,90(1):51-60.

[3] 荣骏弓，康丽娟，谷守林，等.腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,1999,21(2):124-127.

[4] 于申业，刁有祥，杨杰华，等.鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用[J].中国兽医学报,2007,27(4):441-444.

[5] Mo M L,Li M,Huang B C,et al.Molecular characterization of major structural protein genes of avian coronavirus infectious bronchitis virus isolates in southern China [J].Viruses,2013,5(12):3007-3020.

[6] Li M,Mo M L,Huang B C,et al.Continuous evolution of avian infectious bronchitis virus resulting in different variants co-circulating in southern China [J].Arch Virol,2013,158(8):1783-1786.

[7] 张丽华，吴翠兰，张志鹏，等.2012-2013年鸡传染性支气管炎病毒广西分离株S1基因序列分析与血清型鉴定[J].病毒学报,2016,32(1):62-69.

[8] 秦丽莉，李 孟，孙 蓉，等.广西2009-2011年鸡传染性支气管炎病毒分离株的基因分型及血清分型[J].病毒学报,2014,30(2):162-170.

[9] Han Z X,Sun C Y,Yan B L.A 15-year analysis of molecular epidemiology of avian infectious bronchitis virus coronavirus in China [J].Infect Genet Evol,2011,11(1):190-200.

[10] 汪 洋，李俊平，杨承槐，等.鸡传染性支气管炎病毒基因型与血清型相关性初步研究[J].中国预防兽医学报,2011,33(11):845-848.

[11] 徐 雪，高冬生，王川庆，等.IBV肾型毒株与呼吸型疫苗株鉴别方法的建立与应用[J].西北农林科技大学:自然科学版,2011,39(1):8-14.

[12] 于 静，杨承槐，李俊平，等.鸡传染性支气管炎病毒H52、H120和M41株的PCR鉴别方法研究[J].中国兽医杂志,2012,46(11):12-14.

[13] Mardani K,Browning G F,Ignjatovic J.Rapid differentiation of current infectious bronchitis virus vaccine strains and field isolates in Australia [J].Aust Vet J,2006,84(1-2):59-62.

[14] Adzhar A,Gough R E,Haydon D,et al.Molecular analysis of the 793/B serotype of infectious bronchitis virus in Great Britain [J].Avian Pathol,1997,26(3):625-640.

[15] 刘思国，江国托，刘明春，等.鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和中国流行株鉴别诊断的研究[J].中国预防兽医学报,1999,21(3):161-163.

[16] 周 生，王红宁，唐梦君，等.IBV的多重RT-PCR检测及3'端非编码区的测序分析[A]//中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集[C].江苏扬州,2008:507-510.

[17] Liu X L,Ma H J,Xu Q Q,et al.Characterization of a recombinant coronavirus infectious bronchitis virus with distinct S1 subunits of spike and nucleocapsid genes and a 3' untranslated region [J].Vet Microbiol,2013,162(2-4):429-436.

[18] Zhang T T,Han Z X,Xu Q Q,et al.Serotype shift of a 793/B genotype infectious bronchitis coronavirus by natural recombination [J].Infect Genet Evol,2015,32(6):377-387.

[19] Xia J,He X,Yao K C,et al.Phylogenetic and antigenic analysis of avian infectious bronchitis virus in southwestern China,2012-2016 [J].Infect Genet Evol,2016,45(11):11-19.

[20] Zhang Z K,Zhou Y S,Wang H N,et al.Molecular detection and smoothing spline clustering of the IBV strains detected in China during 2011-2012 [J].Virus Res,2016,211(1):145-150.

[21] Han Z X,Zhao W J,Chen Y Q,et al.Genetic,antigenic,and pathogenic characteristics of avian infectious bronchitis viruses genotypically related to 793/B in China [J].Vet Microbiol,2017,203(5):125-135.