种子细胞、生长因子、支架材料是组织工程研究的三要素，其中寻找拥有理想生物学性能的种子细胞是首先需要解决的问题。牙周膜干细胞具备高度增殖能力、自我更新能力及多向分化潜能，并且来源相对广泛，作为牙周组织再生、牙再生等研究的候选种子细胞受到越来越多的关注[1]。牙周膜干细胞的体外培养对培养条件要求较高，原代细胞分离方法、基础培养基成分、氧气浓度、培养时间、细胞保存条件、物理和化学刺激等因素对牙周膜干细胞的生长状态及增殖、分化等特性有较大影响。本文结合近年来研究进展，探讨多种体外培养条件对牙周膜干细胞生物学特性的影响，为优化牙周膜干细胞体外培养条件、充分发挥其干细胞多能性提供参考。

1 牙周膜干细胞的基本特性

2004年，Seo等[1]采用单细胞株筛选及免疫磁珠分离技术，首次从人第三磨牙分离出牙周膜干细胞。牙周膜干细胞是一种成体干细胞，主要分布于牙周膜血管周围[2]，可表达白细胞分化抗原族（cluster differentiation，CD）90、CD105、CD146、STRO-1等间充质干细胞表面标志物[3]。牙周膜干细胞有较强的克隆增殖能力，体外培养中比骨髓间充质干细胞、牙髓干细胞拥有更高的增殖率[1]；拥有多向分化潜能，通过适当的诱导可向成骨细胞、脂肪细胞[1]、神经细胞[4]等方向分化，在组织再生领域有广阔的应用前景。

2 体外培养环境对牙周膜干细胞生物学特性的影响

2.1 原代细胞分离方法

多数学者从因正畸拔除的前磨牙或阻生第三磨牙的根面中1/3收集牙周膜组织，再从中分离牙周膜干细胞。常见的牙周膜干细胞分离方法有组织块生长法、酶消化法及这2种方法的结合。有学者[5]对上述3种分离方法进行比较，认为组织块生长法有最高的细胞培育成功率。亦有研究[6-7]认为，酶消化法得到的牙周膜干细胞有更强的增殖能力，表达更多的间充质干细胞特性，如间充质干细胞标记物CD166表达更高、成骨和成脂分化能力更强；而组织块生长法得到的细胞则表现出更多的成纤维细胞样特性，如Ⅰ型胶原α1和Ⅲ型胶原相关基因表达更高。因此，有必要根据实验需要选择更适宜的分离方法。

2.2 基础培养基成分

牙周膜干细胞常用的基础培养基为α-基础培养基（α-minimum essential medium，α-MEM）或Dulbecco 改良基础培养基（Dulbecco’s minimum essential medium，DMEM）。有学者[8]对比这2种培养基，认为长期培养在α-MEM 中的牙周膜干细胞具有更高的增殖率与成骨潜能，α-MEM比DMEM 更适于牙周膜干细胞的培养。

(3)管输环境中具备生成FeCO3、Fe3 S4、FeS所需的 H 2 S、CO2以及水环境。因此，FeCO3、Fe3 S4、FeS可能来自管道自身腐蚀或是上游管道、设备的腐蚀;而S、SiO 2、Fe3 O4则可能来自上游生产流程或管道施工时的遗留物。

除机械力外，其他形式的物理刺激也可改变牙周膜干细胞的生物学特性。例如使用低强度脉冲超声波可以提高牙周膜干细胞的增殖能力，尤其以250 mW·cm-2超声波的促进作用最为显著，而这可能与丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK ）信号通路的改变有关[29]；低强度激光照射可促进牙周膜干细胞的增殖[30]；20Gy 的伽马射线照射可能造成牙周膜干细胞的衰老[31]。在保证生物安全性的前提下，如何科学利用牙周膜干细胞对物理刺激的反应将纳入组织工程研究课题。

随着人们生活节奏的加快，传统的饮食的方式和饮食方法难以满足现代人的生活要求，通过淮山选料、清洗、热烫、去皮、切片、护色、粉碎、干燥、包装[43]等工序，把鲜淮山加成速溶淮山粉。由于速溶淮山粉饮用方便、符合现代人快节奏生活需求，因此，速溶淮山粉具有广阔的市场前景。李强等[44]研究报道，在生产速溶淮山粉时，与热风干燥法相比，喷雾干燥法能节省生产时间、而且喷雾干燥法生产的速溶淮山粉粉末均匀、颜色洁白，复水性好，用温水或热水冲泡可迅速溶解。金金[45]等采用预煮熟化工艺，使淮山块茎中的淀粉达到完全糊化状态，然后将其加工成速溶淮山粉，可改善其冲泡品质。

2.3 氧气浓度

而三部小说中的女性最终还是回归家庭，没有脱离男性独立出来。蔡大嫂最终选择再嫁，伍大嫂最后随丈夫搬家，而龙竹君依然做着自己的黄太太。作者让追求情爱肉欲的女性回归家庭。证明作者虽然认同女性追求情爱和独立自由，但是最终仍然是要回归家庭。封建制度那条长河仍然围绕着她们，浸溺着她们。她们是男权社会下的牺牲品，始终无法摆脱男性的压迫。

随着体外培养时间的延长及传代数的增加，牙周膜干细胞的生物学特性发生改变，表现为细胞的衰老及多向分化潜力的降低。有学者[17]证实，随着传代数增加，牙周膜干细胞内与牙本质方向分化相关的基因表达呈下降趋势，提示其向牙本质方向分化能力逐渐下降。有学者[18]对第2代与第9代牙周膜干细胞内基因表达情况进行对比，发现第9代牙周膜干细胞存在较多免疫调节相关基因表达量的改变，这引发对长期体外培养的牙周膜干细胞应用安全性问题的思考。在保证生物安全性的前提下，适当限制体外培养代数对牙周膜干细胞组织工程研究有较大意义。

2.4 培养时间

除影响增殖、分化能力外，低氧还会促使牙周膜干细胞表达乏氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）-1α、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）-1等因子。对牙周炎患者而言，深牙周袋内自然形成了低氧环境，上述因子表达的升高可以促进相关免疫细胞的浸润，与局部组织炎症反应有一定的关系[16]。

胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）可提供多种天然生长因子促进细胞的贴壁与增殖，往往作为干细胞培养基的重要成分。有研究[9-10]证实，高浓度血清中牙周膜干细胞的生长与增殖速率显著高于低浓度血清中的细胞，且随血清浓度的提高碱性磷酸酶活性增强。作为FBS 的一种可能性替代品，血清化血小板裂解液（serum converted platelet lysate ）经证实可以有效支持人牙周膜干细胞的体外扩增，并维持细胞的免疫调节及多向分化能力，因其有效避免了异种属血清在培养人源性细胞时可能存在的免疫排斥、动物源性疾病等问题而颇具研究前景[11]。另有学者[12]证实，无血清的培养基也可支持牙周膜干细胞的体外扩增，虽然细胞增殖能力下降，但其干性及成骨、成脂、成软骨分化潜能得到了有效的维持。这些研究结果提示，可根据实验目的的不同调节培养基血清含量，在不改变多能性的前提下控制牙周膜干细胞的增殖。

2.5 细胞保存

2.6.1 物理刺激 研究[24-25]发现，体外施加牵张力、静压力等不同形式的机械力会改变牙周膜干细胞的增殖与分化能力，如持续性机械振动力可使其增殖能力下降，成骨能力呈频率依赖性增强；循环牵张力促使细胞内多种成骨相关基因的表达显著上调[26]。关于机械力改变干细胞生物学特性的机制尚不完全清楚，已经有研究[27-28]发现蛋白激酶R 样内质网激酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）-真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）2α-活性转录因子（activating transcriptional factor，ATF）4、环氧化酶（cyc-looxygenase，COX）-2/前列腺素（prostaglandin，PG）E2等信号通路参与调控。

细胞冻存液的成分之一二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）可减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜的损伤，但同时对细胞有毒性作用。有学者[22]对比不同浓度DMSO 冻存体系对牙周膜干细胞的影响，发现5%比传统的10%体系能明显缩短细胞体外扩增所需时间，且2种冻存体系对细胞基本生物学特性的影响均不大，为改进牙周膜干细胞冻存方法提供了思路。有学者[23]提出了利用含3% DMSO 的无血清冻存液实现磁性冻存，解冻后干细胞标记物的表达、成骨和成脂分化潜能与未冻存的细胞相比没有明显变化，也没有出现明显的DNA 损伤，表明磁性冻存是一种可靠、有效的细胞储存法。

常规细胞体外培养时氧气浓度维持在20%左右，而低氧环境经证实可以影响干细胞的生物学特性，往往与氧气的浓度、低氧的维持时间有较大关系。例如，有学者[13]将牙周膜干细胞培养在2%低氧环境中48h，发现其增殖能力下降，DNA合成增强，干细胞表面标志物STRO-1和CD146表达不变；有学者[14]将其培养在2%低氧环境中7d，发现低氧对增殖没有抑制作用，并促进了干细胞标志物Oct-4、Sox2和c-Myc 的表达及提高了成骨、成脂分化潜能，这提示可利用低氧环境维持牙周膜干细胞的干性；还有学者[15]证实0.1%氧气环境中牙周膜干细胞向肌腱韧带方向分化的能力增强。这些实验结果提示，有必要探究牙周膜干细胞体外扩增更适宜的低氧浓度及低氧维持时间，以达到维持干细胞干性的目的。

2.6 其他物理和化学刺激

液氮低温冷冻是长期储存细胞的常规方法。有学者[19]将第3代牙周膜干细胞在液氮冷冻半年后复苏，发现其细胞形态、生长过程、免疫表型、成骨分化能力等与冻存前无显著差异，证实短期低温冻存对牙周膜干细胞生物学特性无明显影响。制成细胞膜片的牙周膜干细胞经冻存后的增殖率、成骨和成脂分化能力与新鲜膜片亦没有明显差异[20]。然而，有研究[21]认为冻存后的牙周膜干细胞内巨噬细胞集落刺激因子（macrophagecolony stimulating factor，M-CSF）表达增多，它与破骨细胞活化、牙根吸收密切相关，提示低温冻存过的干细胞应用在自体牙移植、牙周组织再生等领域时有诱导牙根吸收的可能性。

综上，槐树坪金矿床为蚀变岩型矿床，属中低温热液成因，矿体受火山构造及构造断裂带的双重控制，并受后期热液叠加改造，属火山喷发-热液改造块状硫化物型矿床。

2.6.2 细胞因子 多种细胞因子已被证实对牙周膜干细胞的增殖分化有调节作用。新近研究[32-33]显示，转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β1可通过上调Ⅰ型胶原蛋白、平滑肌肌动蛋白和骨膜蛋白的表达，加速牙周膜干细胞向成纤维细胞方向的分化；结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）可以上调细胞外基质的生成，并提高牙周膜干细胞成骨、成牙骨质、成纤维分化的能力。本文关注于细胞因子使用时的优化。1）细胞因子对牙周膜干细胞的影响往往呈剂量依赖性，在实际应用中有必要根据研究目的选择适宜的用量。例如不同浓度的肿瘤坏死因子（tumour necrosis factor，TNF）-α对牙周膜干细胞的影响不同，2.5及5 ng·mL-1的TNF-α可以显著提高牙周膜干细胞的增殖与成骨能力，而10 ng·mL-1只能促进细胞凋亡，对增殖与分化影响不大[34]。2）一些细胞因子的联合使用可以起协同促进作用。TGF-β3和骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-6都可以诱导牙周膜干细胞软骨方向分化，且二者的联合应用比单独使用某一种效果更明显[35]，这提示应用过程中可以对细胞因子进行合理的筛选与组合。

框架标记和解释标记在元旦社论中出现较少。框架标记可以构建清晰的语篇框架，从而使社论的论证更加具有气势。在语步4中框架标记出现频率较高，通常都是连用三个或四个相同句式开头的句子，不仅读起来铿锵有力，同时也为语步4阐述新年任务构建起清晰的框架，阅读时一目了然。如“在新的一年里，我们一定要……”、“1993年，我们……”、“要实现九十年代的奋斗目标……”、“夺取新的胜利，就要……”等。

多种细胞因子的作用机制已经与信号通路联系在一起。例如，有学者[36]证实，胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）-1可通过细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）和c-Jun 氨基末端蛋白激酶（c-Jun N-terminal protein kainse，JNK）-丝裂原活化蛋白激酶（motigen-activated protein kinases，MAPK）信号通路增强牙周膜干细胞的增殖与成骨分化能力；地塞米松可抑制牙周膜干细胞Wnt信号通路，进而抑制细胞生长[37]。研究细胞因子的作用机制有利于深入理解牙周膜干细胞的增殖、分化特性，为优化其体外培养环境提供理论基础。

2.7 其他因素

还有诸多其他体外培养因素会影响牙周膜干细胞的特性。例如，来自其他细胞的条件培养液包含多种细胞分泌因子，会不同程度影响牙周膜干细胞的增殖、分化等特性[38-39]；组织工程应用中，支架材料的种类、表面处理方式等可改变附着其上的牙周膜干细胞的生物学行为[40]。在牙周膜干细胞的体外培养中，有必要关注各种因素的影响效果及机制，以优化其培养策略。

3 结语

牙周膜干细胞具有良好的自我更新能力及多向分化潜能，在组织工程研究中的地位不容小觑。体外培养条件的改变直接影响牙周膜干细胞的增殖、分化、迁移等多种特性，各种影响因素的确切效果与机制有待进一步研究。通过适当控制体外培养条件，实现对牙周膜干细胞体外培养方案的优化（图1），以最大限度发挥种子细胞的多能性，对组织工程研究有重要意义。cells derived from dental tissues vs. those from other sources: their biology and role in regenerative medicine[J]. J Dent Res, 2009, 88(9):792-806.

  

图 1牙周膜干细胞体外培养策略优化Fig 1 Optimization of in vitro culture of periodontal membrane stem cells

4参考文献

[1]Seo BM, Miura M, Gronthos S, et al. Investigation of multipotent postnatal stem cells from human periodontal ligament[J]. Lancet, 2004, 364(9429):149-155.

[2]Wang L, Shen H, Zheng W, et al. Characterization of stem cells from alveolar periodontal ligament[J].Tissue Eng Part A, 2011, 17(7/8):1015-1026.

[3]Huang GTJ, Gronthos S, Shi S. Mesenchymal stem

[4]Bueno C, Ramirez C, Rodríguez-Lozano FJ, et al.Human adult periodontal ligament-derived cells integrate and differentiate after implantation into the adult mammalian brain[J]. Cell Transplant, 2013, 22(11):2017-2028.

[5]刘娟,孟波,赵华,等.人牙周膜细胞不同分离培养方法的比较研究[J].广东牙病防治, 2011, 19(12):631-634. Liu J, Meng B, Zhao H, et al. Methods for isolation and culture of human periodontal ligament cell: a comparative study[J]. J Dent Prev Treat, 2011, 19(12):631-634.

[6]Prateeptongkum E, Klingelhöffer C, Müller S, et al.Characterization of progenitor cells and stem cells from the periodontal ligament tissue derived from a single person[J]. J Periodont Res, 2016, 51(2):265-272.

[7]Tanaka K, Iwasaki K, Feghali KE, et al. Comparison of characteristics of periodontal ligament cells obtained from outgrowth and enzyme-digested culture methods[J]. Arch Oral Biol, 2011, 56(4):380-388.

[8]Jung IH, Kwon BS, Kim SH, et al. Optimal medium formulation for the long-term expansion and maintenance of human periodontal ligament stem cells[J].J Periodontol, 2013, 84(10):1434-1444.

[9]鄂玲玲,刘弘臣,王懿,等.血清浓度及培养时间对牙周膜细胞生物学活性的影响[J].上海口腔医学,2010, 19(3):275-280.E LL, Liu HC, Wang Y, et al. The effect of serum concentration and culture time on the biologic activity of human periodontal ligament cells[J]. Shanghai J Stomatol, 2010, 19(3):275-280.

[10]Hou LT, Li TI, Liu CM,etal.Modulation of osteogenic potential by recombinant human bone morphogenic protein-2 in human periodontal ligament cells:effect of serum, culture medium, and osteoinductive medium[J]. J PeriodontRes,2007, 42(3):244-252.

[11]Wu RX, Yu Y, Yin Y,etal.Platelet lysate supports the in vitroexpansion of human periodontal ligament stem cells for cytotherapeutic use[J].J Tissue Eng Regen Med,2017,11(8):2261-2275.

[12]Tarle SA, Shi S, Kaigler D.Development of a serumfree system to expand dental-derived stem cells:PDLSCs and SHEDs[J].J Cell Physiol,2011, 226(1):66-73.

[13]邹菡,文韵笙,吴志玲,等.低氧对人牙周膜细胞增殖、细胞周期及分化潜能的影响[J/OL].中华口腔医学研究杂志(电子版), 2015, 9(3):177-184.Zou H, Wen YS, Wu ZL, et al. A preliminary study on effects of hypoxia on the proliferation, cell cycle and differentiation of human periodontal ligament cells[J/OL]. Chin J Stomatol Res (Elect Ed), 2015,9(3): 177-184.

[14]Zhou Y, Fan W, Xiao Y. The effect of hypoxia on the stemness and differentiation capacity of PDLC and DPC[J]. Biomed Res Int, 2014, 2014:890675.

[15]Kawasaki T, Sumita Y, Egashira K, et al. Transient exposureto hypoxicand anoxic oxygen concentrations promotes either osteogenic or ligamentogenic characteristics of PDL cells[J]. Biores Open Access,2015, 4(1):175-187.

[16]Gölz L, Memmert S, Rath-Deschner B, et al. Hypoxia and P. gingivalis synergistically induce HIF-1 and NF-κB activation in PDL cells and periodontal diseases[J]. Mediators Inflamm, 2015, 2015:438085.

[17]Choi JK, Hwang HI, Jang YJ. The efficiency of the in vitro osteo/dentinogenic differentiation of human dental pulp cells, periodontal ligament cells and gingival fibroblasts[J]. Int J Mol Med, 2015, 35(1):161-168.

[18]Jayaraman P, Govindasamy V, Gnanasegaran N, et al. Expression patterns of immune genes in longterm cultured dental stem cells[J]. Clin Oral Investig,2016, 20(1):109-116.

[19]徐婕,刘宏伟.低温冻存对人牙周膜干细胞生物学特性的影响[J].中国医药指南, 2009, 7(17):20-21.Xu J, Liu HW. Effects of cryopreservation on biological characters of human PDLSCs[J]. Guide Chin Med, 2009, 7(17):20-21.

[20]魏福兰,马晓妮,张凡.深低温冻存对牙周膜干细胞膜片增殖和分化能力的影响[J].口腔生物医学,2015, 6(2):87-89.Wei FL, Ma XN, Zhang F. Effect of cryopreservation on proliferation and differentiation of periodontal ligament stem cell sheet[J]. Oral Biomed, 2015, 6(2):87-89.

[21]Rhim EM, Ahn SJ, Kim JY, et al. Cryopreservation induces macrophage colony stimulating factor from human periodontal ligament cells in vitro [J]. Cryobiology, 2013, 67(2):156-162.

[22]王漩,刘奕杉,马艳,等.不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响[J].中国组织工程研究,2013, 17(32):5855-5862.Wang X, Liu YB, Ma Y, et al. Periodontal ligament stem cells expansion in vitro under different cryopreservation systems[J]. J Clin Rehab Tissue Eng Res,2013, 17(32):5855-5862.

[23]Lee SY, Huang GW, Shiung JN, et al. Magnetic cryopreservation for dental pulp stem cells[J]. Cells Tissues Organs, 2012, 196(1):23-33.

[24]Zhang C, Li J, Zhang L, et al. Effects of mechanical vibration on proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells[J].Arch Oral Biol, 2012, 57(10):1395-1407.

[25]Zhang C, Lu Y, Zhang L, et al. Influence of different intensities of vibration on proliferation and differentiation of human periodontal ligament stem cells[J].Arch Med Sci, 2015, 11(3):638-646.

[26]Shen T, Qiu L, Chang H, et al. Cyclic tension promotes osteogenic differentiation in human periodontal ligament stem cells[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014,7(11):7872-7880.

[27]Yang SY, Wei FL, Hu LH, et al. PERK-eIF2α-ATF4 pathway mediated by endoplasmic reticulum stress response is involved in osteodifferentiation of human periodontal ligament cells under cyclic mechanical force[J]. Cell Signal, 2016, 28(8):880-886.

[28]Suzuki R, Nemoto E, Shimauchi H. Cyclic tensile force up-regulates BMP-2 expression through MAP kinase and COX-2/PGE2 signaling pathways in human periodontal ligament cells[J]. Exp Cell Res, 2014,323(1):232-241.

[29]Gao Q, Walmsley AD, Cooper PR, et al. Ultrasound stimulation of different dental stem cell populations:role of mitogen activated protein kinase signaling[J].J Endod, 2016, 42(3):425-431.

[30]Soares DM, Ginani F, Henriques ÁG, et al. Effects of laser therapy on the proliferation of human periodontal ligament stem cells[J]. Lasers Med Sci, 2015,30(3):1171-1174.

[31]Cmielova J, Havelek R, Soukup T, et al.Gamma radiation induces senescence in human adult mesenchymal stem cells from bone marrow and periodontal ligaments[J].Int J Radiat Biol,2012, 88(5):393-404.

[32]Kono K, Maeda H, Fujii S, et al.Exposure to transforming growth factor-β1after basic fibroblast growth factor promotes the fibroblastic differentiation of human periodontal ligament stem/progenitor cell lines[J]. Cell Tissue Res,2013, 352(2):249-263.

[33]Yuda A, Maeda H, Fujii S, et al.Effect of CTGF/CCN2 on osteo/cementoblastic and fibroblastic differentiation of a human periodontal ligament stem/progenitor cell line[J].J Cell Physiol,2015, 230(1):150-159.

[34]Zhu W, Tan Y, Qiu Q, et al. Comparison of the properties of human CD146+andCD146-periodontal ligament cells in response to stimulation with tumour necrosis factorα[J].Arch Oral Biol,2013, 58(12):1791-1803.

[35]Choi S, Cho TJ, Kwon SK, et al. Chondrogenesis of periodontal ligament stem cells by transforming growthfactor-β3and bone morphogenetic protein-6 in a normal healthy impacted third molar[J].Int J Oral Sci,2013, 5(1):7-13.

[36]Yu Y, Mu J, Fan Z, et al. Insulin-like growth factor 1 enhances the proliferation and osteogenic differentiation of human periodontal ligament stem cells via ERK and JNK MAPK pathways[J]. Histochem Cell Biol,2012, 137(4):513-525.

[37]Choi SS, Park EK, Kwack MH, et al. Effects of dexamethasone, a synthetic glucocorticoid, on human periodontal ligament stem cells[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2015, 388(9):991-995.

[38]Jin Z, Feng Y, Liu H. Conditioned media from differentiating craniofacial bone marrow stromal cells influence mineralization and proliferation in periodontal ligament stem cells[J].Hum Cell,2016, 29(4):162-175.

[39]Zhao L, Wu Y, Tan L, et al. Coculture with endothelial cells enhances osteogenic differentiation of perdontal ligament stem cells via cyclooxygenase-2/prostaglandinE2/vascular endothelial growth factor signaling under hypoxia[J]. J Periodontol, 2013, 84(12):1847-1857.

[40]Vera-Sánchez M, Aznar-Cervantes S, Jover E, et al.Silk-fibroin and graphene oxide composites promote human periodontal ligament stem cell spontaneous differentiation into osteo/cementoblast-like cells[J].Stem Cells Dev, 2016, 25(22):1742-1754.