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抗氧化聚砜血液透析膜的构建与性能研究

更新时间:2009-03-28

目前,全球终末期肾衰竭患者接受登记的约有301万人,其中210.6万人接受血液透析治疗,并且以7%~8%的速度递增,维持性血液透析是尿毒症患者的主要治疗手段.然而,在血液透析过程中,由于透析膜的生物相容性问题患者血液中的白细胞黏附和活化,产生大量活性氧,这些活性氧与血液中的蛋白质和脂质反应引起氧化应激现象.随着透析时间的延长,患者体内积累过多的氧化性物质会通过多种不同的途径损伤组织与器官,因此,研究新型抗氧化血液透析膜材料是非常有必要的.近年来,一些研究人员对抗氧化性血液透析膜进行研究,即在膜表面固定抗氧化剂,如维生素E[1-2]、共轭亚油酸[3-6]、染料木黄酮[7]α-硫辛酸[8]等.然而,固定化方法较为复杂,不利于工业化生产,对膜材料的整体性能影响很小,对中空纤维膜的改性也很困难;并且膜表面固定化方法形成的血液透析膜在使用过程中稳定性较差,无法维持透析过程中稳定的抗氧化效果[8].

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聚砜(PSf)血液透析膜对中分子毒素的清除率较高,血液相容性良好,机械强度及化学稳定性较高,在临床上得到广泛应用.然而,PSf上的异丙基与强氧化剂接触时易产生甲基自由基,加重尿毒症患者的氧化应激状态.乳蓟植物提炼的水飞蓟宾能直接清除自由基,又能抑制ROS生成酶的产生来防止自由基的形成[9],达到抑制氧化应激的效果.由于水飞蓟宾的水溶性差 (约40 μg/mL)、口服生物利用度低 (大约0.73%),无法直接口服达到抗氧化的效果,严重制约了水飞蓟宾在临床上的使用,然而可以把它作为制备血液透析膜的改性材料,将水飞蓟宾与卵磷脂复合制备出有抗氧化效果和良好生物相容性的水飞蓟宾-卵磷脂(SPC).SPC作为体外细胞系统的抗氧化剂,可以降低氧化应激诱导的氧化终产物丙二醛水平,丙二醛有细胞毒性会引起蛋白质、核酸等生命大分子的交联聚合.此外,SPC可以保护细胞免于黄嘌呤氧化酶引起的细胞凋亡[10].

本研究中,以PSf为基体,具有抗氧化性和生物相容性良好的SPC为改性剂,使两者杂化制备抑制氧化应激的血液透析膜.SPC/PSf杂化膜亲水性提高,且表现出良好的抗氧化性和生物相容性.该方法过程简单、无需特殊设备、成本低且易量产,为进一步开拓更适合临床需要的血液透析膜材料研究奠定了基础.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

PSf,工业品,比利时Solvay;SPC(Mn=371 g/mol, Mw/Mn=1.15),实验室自制; NN-二甲基乙酰胺 (DMAc),分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;聚乙二醇(PEG,6000),分析纯,天津市科密欧化学试剂有限公司;DPPH,分析纯,北京瑞泰生物有限公司;ABTS,分析纯,北京索莱宝科技有限公司.

植物油脂快速热裂解生物燃油的 GC-MS分析结果如图3所示,按出峰时间对组分加以比对整理。根据对GC-MS图谱的分析,将占比非常小和相似度不高的成分删除,集中讨论该燃油的典型组分,根据碳链长度及特征,对成分进行归类总结,见表4。可以看出该生物裂解燃油(PBF)包含了 C7 ~ C22之间的各类脂肪酸甲酯、烷烃、烯烃等生物燃料的常见成分,碳链长度跨度范围较大,在后续的研究中,将进一步简化组分构成。

傅立叶变换红外光谱仪 (FT-IR),美国Thermo Fisher Scientific;场发射扫描电镜 (FESEM),日本Hitachi;X-射线光电子能谱仪 (XPS),美国Thermo Fisher Scientific;酶联免疫检测仪,美国,Thermo Fisher Scientific;紫外-可见光分光光度计,中国,北京普析通用仪器有限公司.

CI-S:0为无牙石;1为龈上牙石覆盖面积<牙面1/3;2为龈上牙石覆盖面积在牙面 1/3~2/3,或牙颈部有散在的龈下牙石;3为龈上牙石覆盖面积>牙面2/3,或牙颈部有连续而较厚的龈下牙石。

1.2 SPC/PSf杂化膜的制备

将PSf、SPC、PEG溶解于DMAc溶液中,然后在60 ℃下恒温机械搅拌8 h,使其成为混合均匀的铸膜液.在室温 (25 ℃)下,采用浸没沉淀相转化法,用刮膜机 (Elcometer 4340)制备平板膜.铸膜液配方及膜的命名见表1.

 

表1 纯PSf膜和SPC/PSf杂化膜铸膜液组成

 

Table 1 Casting solution composition of pristine PSf and SPC/PSf hybrid membranes %

  

膜PSfSPCPEG6000DMAcM-C0200476M-C1191476M-C2182476M-C3173476

1.3 表面化学组成测试

膜样品干燥后,用X-射线光电子能谱仪 (GENESIS 60S) 对膜表面进行扫描.

1.4 形貌测试

将膜用导电胶固定在样品台上,喷金后用场发射扫描电镜 (S-4800) 观察膜的形貌.

1.5 膜性能表征

使用流动电位法检测膜表面电位.在流动电位测试中,电解质溶液为0.001 mol/L KCl 溶液,调节KCl 溶液的pH分别用浓度为0.1 mol/L的HCl溶液和0.1 mol/L NaOH溶液.

二是要注重导向性。所谓导向性,就是将名师评选的条件和标准作为方向标、指挥棒,使每一个有志于成为名师的教师明确努力的方向。从加强教师队伍建设这个意义上讲,名师的评选既重在结果,同时也重在过程。从遴选指标体系各要素及其权重中,可以看出名师评选的导向性。

将待测膜放入48孔板中,每孔中接种1 mL 5×103 cells/mL L929细胞悬液,25 μL阿尔玛蓝试剂进行细胞增殖的监测,设定TCPS板中接种的为参照组.在第一、三和五天时,每孔取出50 μL液体,使用酶标仪在激发波长560 nm,发射波长590 nm的条件下测得相对荧光强度.

膜水通量采用错流方式进行测试.实验条件:测试压力0.1 MPa,膜有效面积14.7 cm2,每隔5 min取一次透过液并称其质量.膜纯水通量Jw计算公式如(1)所示.

 

(1)

式中,V为渗透液的体积;A为膜的有效面积;t为透过V体积的滤液所需时间.

用磷酸盐缓冲溶液 (PBS,pH= 7.4)配制牛血清蛋白溶液BSA (浓度为1 g/L),将纯水换成BSA溶液.采用PBS作为空白对照,设置紫外波长278 nm,通过测定未知溶液的吸光度,计算渗透液的BSA浓度.采用公式(2)计算渗透过程中不同膜对BSA的截留率 (R).

 

(2)

式中,Cp为渗透液中BSA浓度;Cf为料液中BSA浓度.

使用泡压法滤膜孔径分析仪(3H-2000PB型)检测膜的孔径.膜样片用超纯水进行浸润预处理,在孔径分析仪上测试.

1.6 抗氧化性测试

DPPH自由基清除[11]:在3 mL浓度为1.0×10-4 mol/L 的DPPH 无水乙醇溶液中,加入1 cm×1 cm的膜,37 ℃下避光静置60 min,在517 nm 处测量吸光度Asample.不加膜的DPPH溶液得吸光度为Acontrol.用式(3)计算DPPH自由基清除率:

式中,Acontrol为DPPH溶液中不加膜的吸光度;Asample为DPPH溶液中加入膜的吸光度.

2.介词 (表示某情况自过去某时间点或某个事件以来一直持续到现在)自…以后,从…以来。通常作为完成时态的时间状语。

DPPH清除率

(3)

在校大学生创业融资难的原因及对策 ………………………………………………………………………………… 何登录(1/75)

ABTS自由基的清除[12]:将7 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等体积混合,在室温下无光储存12 h,得ABTS自由基溶液.在使用前,ABTS自由基溶液用无水乙醇稀释,在734 nm下以达到0.700±0.025的吸光度.在4 mL的 ABTS自由基溶液中,加入不同待测膜,摇匀,25 ℃下避光静置10 min,在734 nm处测量吸光度,并用式(4)计算ABTS自由基的清除率.

ABTS清除率

(4)

式中,Acontrol为ABTS溶液中不加膜的吸光度;Asample为ABTS溶液中加入膜的吸光度.

PSf膜和SPC/PSf膜保存在去离子水中,每隔24 h换一次水,分别于第1、30、60和90天测试膜清除自由基的能力.

为了确定SPC/PSf膜在透析条件下的稳定性,将新鲜膜浸入10 mL 0.05 mol/L PBS (pH= 7.4,37 ℃),溶液和膜样品进行充分振荡4 h后(记为PBS中处理后的膜),测试膜清除DPPH自由基的能力.

1.7 生物相容性测试

1.7.1 细胞增殖活力测试

水接触角测试是评价膜亲疏水性的主要方法.将一滴纯水 (3 μL) 置于膜表面,用DSA100型接触角测试仪对膜样品进行接触角测试.

在耕地地力保护过程中农户是主体,农户们的日常行为直接对地力条件产生影响。为了提高地力水平,必须要积极加强各项补助措施的制定和完善,提高耕地地力水平。比如确定秸秆还田、深松整地等具体作业标准、补贴面积,针对具体的可以接受补助的对象,给予一定的补助和优惠;尽量形成集中化作业规模,让农业大户、农机大户、专业合作社等发挥出引导作用;对散户进行引导,提高农户对耕地地力提升和保护的重视[2]。

1.7.2 血小板的黏附

收集肝素抗凝全血 (来自健康成年男性志愿者) 在1 000 r/min离心15 min得富血小板血浆(PRP).将1 cm×1 cm的膜浸泡在PBS(pH=7.4)1 h后吸弃,加入1.0 mL PRP孵育 60 min后.在4 ℃的2 mL浓度为2.5%戊二醛中固定.用乙醇-PBS水溶液体积分数为50%、70%、90%、100%进行一系列的脱水,自然晾干膜片,SEM观察血小板黏附.

1.7.3 全血中SOD的水平

SOD是机体清除体内超氧阴离子自由基的重要生物酶,因此测试血液中SOD的水平可知膜与血液的接触的过程中产生的氧化应激状态.收集肝素抗凝全血,SOD水平根据超氧化物歧化酶测定试剂盒 (南京建成生物研究所) 进行测试[13].

1.8 统计学方法

从理论上来说,在膜表面性状(粗糙度、孔径及其分布、开孔率等)一致的情况下,水接触角越小,表明膜表面越亲水[14].从表3中可以看出, PSf膜的初始水接触角为101.1°±2.3°,而M-C1,M-C2和M-C3的接触角分别为91.7°±3.4°、88.8°±1.5°、84.2°±2.1°.SPC/PSf膜的接触角减小,表明SPC/PSf膜表面亲水性提高.由XPS数据知,随着SPC在膜中含量的增大,亲水链段在膜表面偏析量增大,这也可以证明相对于纯PSf膜,SPC/PSf杂化膜的亲水性得到了改善.

2 结果与讨论

2.1 膜表面化学组成

由表3可知M-C0和M-C1,M-C2和M-C3的纯水通量和BSA截留率. PSf膜的通量最低为(44.4±8.1) L/ (m2·h),且BSA截留率最高为99.1%±0.4%.随着SPC的含量增加,SPC/PSf膜的通量依次增加,最高值达到(187.9±6.9) L/ (m2·h),BSA截留率略有降低,但仍保持在96%以上.影响膜通量的主要因素有膜的孔径、结构及亲水性.在成膜的过程中,SPC中的亲水链段向膜表面偏析,提高膜及膜孔的亲水性,降低了水分子的渗透阻力,因此SPC/PSf膜的通量明显增加.膜结构表征证实,SPC在成膜过程中具有致孔作用.因此,渗透过程中对BSA的渗透阻力下降,BSA更容易渗透通过膜.

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表2 膜表面的化学组成

 

Table 2 Chemical compositions of membrane surface %

  

膜OSCNPM-C016.143.2880.59M-C115.922.8379.361.350.55M-C216.442.4379.051.420.60M-C328.111.5676.942.610.78

2.2 膜的形貌结构

图1为相同成膜条件下制备的纯PSf膜和SPC/PSf膜的表面、断面形貌结构和局部断面形貌图.由图1中的a1~d1可知膜表面的微孔结构小于1 μm,由表3可知M-C0,M-C1, M-C2 和 M-C3的平均孔径依次为25、31.7、35.5和72.5 nm,即随着膜中SPC的量增大,膜的平均孔径增大.由图1中的a2~d2可知,所制备的平板膜断面具有相似的非对称结构、皮层结构及多孔支撑层.随着体系中SPC含量的增加,指状孔上逐渐形成微孔结构,且孔径尺寸逐渐增加.因为SPC和PSf能溶解分散在DMAc中,形成热力学稳定的均匀相.铸膜液与水相接触时,其平衡状态被破坏,由于PSf和SPC中卵磷脂的脂肪链具有良好的相容性,在非溶剂作用下,PSf和SPC中的脂肪链先从溶剂中沉淀出来.此时,PSf和SPC中脂肪链收缩且相互缠结在一起.由于水分子与亲水单元间的氢键、离子化作用,亲水单元仍处于伸展状态.膜干燥处理过程中,水分子的流失,亲水单元收缩坍塌在疏水单元上,形成规整的微孔结构(如图1中的a3~d3).

  

(a) M-C0; (b) M-C1; (c) M-C2; (d) M-C3图1 膜的形态结构Fig.1 FESEM image of membranes

2.3 膜的性能分析

2.3.1 膜的亲水性

采用SPSS V17.0软件对数据进行统计分析,数值以x±s表示,组间比较用t检验和方差分析.任意两组数据差异概率p< 0.05时,显著性差异,用*表示;任意两组数据差异概率p< 0.01时,极显著性差异,用**表示.

2.3.2 膜的渗透分离性能

纯PSf膜表面的全谱在结合能为532.5 eV、287.1 eV 和175.5 eV附近出现O、C和S信号峰,即为PSf中的元素.在铸膜液中添加SPC后,杂化膜表面出现N和P的特征信号峰,随着膜中SPC含量的增大,膜上N和P元素的信号强度逐渐增加(如表2所示).即SPC在膜表面的偏析量也在增大.SPC的卵磷脂结构中具有亲水的头部和疏水的脂肪链尾部. 成膜过程中亲水单元先迁移到初生膜与凝固浴界面.因此,亲水单元固定于初生膜与水浴的界面.随着SPC含量增加,亲水单元在膜表面的分布量增加,表明亲水单元在膜表面具有更高的覆盖率.亲水单元的表面富集现象可有效地提高膜的亲水性,抑制血浆蛋白在膜表面的吸附,进而提高膜的血液相容性.

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2.4 膜的抗氧化性

2.4.1 膜清除自由基的能力

DPPH是很稳定的以氮为中心的自由基,在517 nm处有强吸收峰,当有自由基清除剂存在时,DPPH会和清除剂提供的质子结合形成DPPH-H,从而使溶液颜色由紫色变为黄色,吸光度值变小.图2(a)为M-C0和M-C1,M-C2和M-C3清除DPPH自由基的能力.在90 d内, PSf膜对DPPH自由基的清除率仅为8.6%±5.6%.随着SPC在膜中含量增加, M-C1,M-C2和M-C3清除DPPH自由基的能力依次增强.且在30、60和90天时, M-C0和M-C1,M-C2和M-C3清除DPPH自由基的能力与第一天相比无显著性差异.

总而言之,历史代表着国家的发展情况,只有做好高中历史教学工作,才可以使学生掌握更多与我国文明、文化有关的知识,培养学生的爱国意识。基于本文对高中历史教学工作的反思,高中历史教师在日后教学中需要更加重视学生感受、明确教学重点难点、做好历史知识复习与回顾工作、强化历史教学中文化知识教学与思想教育的融合,为学生历史水平的提高做出努力。

ABTS在适当的氧化剂作用下氧化成绿色的ABTS自由基,在抗氧化物存在时ABTS自由基的产生会被抑制,在734 nm测定ABTS自由基溶液的吸光度即可测定并计算出样品的总抗氧化能力.图2(b)为M-C0和M-C1,M-C2和M-C3的清除ABTS自由基的能力.SPC/PSf膜清除ABTS自由基能力的趋势和清除DPPH自由基的一致,且在90 d内SPC/PSf膜清除ABTS的能力与第一天相比无显著性差异.SPC中含有酚羟基提供的氧原子可以与自由基未成对电子配对,进而清除自由基.PSf和SPC中两个长的脂肪链收缩且相互缠结在一起在成膜时已经构成膜的基体,即使保存时间延长,SPC依然能稳定的存在于SPC/PSf膜中,即SPC/PSf膜在90 d内均能保持稳定的清除自由基的能力.

 

表3 M-C0,M-C1, M-C2 和 M-C3的各种性能

 

Table 3 Various properties of M-C0, M-C1, M-C2 and M-C3

  

膜平均孔径/nm接触角/(°)纯水通量/(L·m-2·h-1)BSA截留率/%Zeta电位(pH=7.4)M-C025101.1±2.344.4±8.199.1±0.4-28.19M-C131.791.7±3.472.4±8.498.7±0.7-30.23M-C235.588.8±1.5107.9±1.297.3±0.8-37.39M-C372.584.2±2.1187.9±6.996.5±0.5-60.30

  

图2 膜清除自由基的能力Fig.2 DPPH and ABTS free radical scavenging activity of membrane

2.4.2 体外模拟膜清除自由基能力的稳定性

在血液透析的过程中,血液(37 ℃)和透析膜持续接触3~4 h.模拟透析过程,将PSf膜和SPC/PSf膜浸没于PBS缓冲溶液中,37 ℃振荡4 h测试膜清除自由基能力.由图3可知,由于PSf膜表面无抗氧化基团,故DPPH自由基清除率仅为8.6%±5.6%.在PBS中振荡4 h前后SPC/PSf膜清除DPPH自由基的能力均无显著性差异,膜清除自由基的能力比较稳定.SPC和PSf具有良好的混溶性, SPC在膜中稳定的存在,因此在血液透析的过程中SPC/PSf膜可以保持良好的抗氧化性能.对比文献模拟体外透析过程的实验α-硫辛酸固定在膜表面对DPPH自由基的清除率下降了约19%[8],而本研究中SPC/PSf杂化膜对DPPH的清除率分别下降了13.9%(M-C1)、3.5%(M-C2)和4.5%(M-C3).

  

图3 膜清除自由基能力的稳定性Fig.3 Stability of membrane scavenging free radical

2.5 膜的生物相容性

2.5.1 膜的细胞相容性

通过在PSf膜和SPC/PSf膜上进行细胞培养对比,研究SPC/PSf膜对细胞增殖行为的影响.由图4可知,随着细胞培养时间的延长荧光强度增大,表明细胞在PSf膜和SPC/PSf膜上均能正常增殖.与对照组TCPS培养板中增殖细胞相比,3 d和5 d时M-C0上的细胞增殖数量极显著低于对照组(p< 0.01),表明M-C0的细胞相容性不佳.而在各个时间段,随着膜中SPC的含量增大,细胞在膜表面的增殖数量增大,与对照组增殖细胞相比均无显著性差异.在相同培养时间内, PSf膜样品与M-C3膜样品相比存在显著性差异(P< 0.05),到第五天时, PSf膜和SPC/PSf膜之间的差异显著性增大.SPC中含有细胞膜的成分之一卵磷脂,有利于促进细胞在膜表面黏附、增殖,因此改性膜具有良好的细胞相容性.

  

图4 细胞在膜表面的增殖行为Fig.4 Cell growth behavior on membranes

2.5.2 血小板黏附

血小板在材料表面的黏附已成为评价材料血液相容性的重要项目之一.从图5可以看出纯PSf膜表面血小板的黏附量最多,且已完全活化变形,这些活化的血小板使凝血加速,且促使血栓形成.SPC改性后的膜表面黏附量明显减少,而M-C3膜表面几乎观察不到血小板的黏附.SPC中的亲水链段与水键合成结合水并在膜表面形成水合层,屏蔽血小板与膜材料的直接接触.此外,M-C0,M-C1, M-C2 和 M-C3膜表面的负电性依次在增强(表3),膜表面的负电荷与血小板形成静电排斥作用,即膜表面的血小板黏附量逐步降低,表明SPC改性后的膜的血液相容性得以提高.

  

(a) M-C0; (b) M-C1; (c) M-C2; (d) M-C3图5 膜表面血小板黏附形态Fig.5 SEM micrographs of platelet adhesion onto membranes

2.5.3 全血中SOD的水平

结果表明,在自由度为1时的χ2统计量为11.660 2,且P<0.05,拒绝原假设,通过Hausman检验,因而该面板数据模型最终应为变系数固定效应模型.

  

图6 膜表面全血的SOD水平Fig.6 The SOD level in blood on membranes

机体内出现氧化应激状态时,生物细胞中的SOD把 O2·-转化为H2O2,H2O2 再被过氧化氢酶和氧化物酶转化为无害的水,达到清除细胞内氧自由基,保护细胞的目的.图6是全血分别与纯PSf膜和SPC/PSf膜接触后SOD的水平.结果表明, PSf膜与血液接触时SOD值为(28.87±1.3) U/mg,与对照组相比有显著性差异 (P< 0.05),不含抗氧化成分的PSf膜表面会激活血液中的抗氧化酶,即PSf膜表面SOD显著性高于SPC/PSf膜;而SPC/PSf杂化膜与血液接触会抑制全血中SOD的形成,与对照组相比没有显著性差异 (P> 0.05);SPC/PSf膜相比于PSf膜显著抑制全血中SOD的形成.临床研究表明,SPC中的水飞蓟宾可以减少终末期肾脏病患者氧化应激标志物、恢复抗氧化酶[15].

3 结论

本研究表明,将有抗氧化性的SPC与PSf铸膜液杂化,制备SPC/PSf血液透析膜.SPC/PSf膜提高了PSf膜的清除DPPH和ABTS自由基的能力, M-C3对DPPH和ABTS最高清除率可分别达到88.3%±1.3%和99.4%±0.3%;90 天内SPC/PSf膜清除自由基的能力与第一天相比无显著性差异;体外模拟血液透析后,SPC/PSf膜对DPPH的清除率分别下降13.9%(M-C1)、3.5%(M-C2) 和4.5%(M-C3).细胞增殖实验表明,SPC/PSf膜与PSf膜相比具有良好的细胞相容性.血小板在膜表面黏附实验显示,SPC/PSf膜表面的血小板黏附量相比于纯PSf膜减少,SPC/PSf膜的血液相容性良好.并且SPC/PSf膜可显著降低全血与膜接触后引起的SOD水平.SPC/PSf膜可缓解病人在血液透析过程中的氧化应激状态,在血液透析领域具有潜在的应用前景.

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Abstract: The objective of this study is to improve the antioxidant properties of polysulfone (PSf) hemodialysis membranes through hybrid silybin-phosphatidylcholine complex (SPC). The SPC/PSf hemodialysis membrane with antioxidant activity was made using PSf as membrane material by liquid-liquid phase separation method in the presence of SPC as modifier to suppress hemodialysis induced oxidative stress. For the SPC/PSf hybrid membrane,the pure water flux was increased to (187.9±6.9) L / (m2·h) compared with the pure PSf membrane. With the increase of the content of SPC on the membrane surface, the antioxidant properties (the ability of scavenging DPPH and ABTS free radical) were increased to 88.3%±1.3% and 99.4%±0.3%. For the SPC/PSf hybrid membrane, the stability of free radical scavenging capability under typical hemodialysis condition was good. Compared with pure PSf membrane, the SPC/PSf hybrid membrane had good cell compatibility. Compared with the pure PSf membrane, the platelet adhesion of SPC/PSf hybrid membrane was decreased, and the blood compatibility was improved. The SPC/PSf hybrid membrane had strong ability to inhibit superoxide dismutase (SOD), while pure PSf membrane stimulated the production of SOD. The results indicated that hybrid modification by SPC and PSf provided practical application of the membranes with good antioxidant properties; and a new type of SPC/PSf hemodialysis membrane was expected to be applied in the field of hemodialysis and alleviate the oxidative stress status of the patients.

Key words: silybin-phosphatidylcholine complex (SPC); polysulfone; hemodialysis membrane; antioxidant; biocompatibility

 
王丹丹,杨宁,贾雪梦,袁光昊,陈莉,赵义平
《膜科学与技术》 2018年第02期
《膜科学与技术》2018年第02期文献

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