多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)是动物、植物、真菌体内普遍存在的一类核编码的铜结合酶，催化单元酚、二元酚、多元酚及到联苯酚的羟基化以及羟基酚到醌的脱氢反应，该酶定位于植物叶绿体的类囊体和其他类型质体的基质中，而植物体内PPO的底物存在于液泡中，PPO与底物被区隔化分开,在质体中以潜伏状态存在，只有当植物体内发生生理紊乱或组织受损时,PPO与底物的亚细胞区域化才被打破，PPO被激活。在PPO的作用下,底物与氧发生反应产生醌,醌在植物体内能发生自身聚合或与细胞内的氨基酸和蛋白质发生反应，产生黑色或褐色的沉积物[1-4]，是果蔬等农产品产生酶促褐变的主要原因。

自1937年Kubowitz在实验室中第一次分离出多酚氧化酶后[5-6]。Thygesen等报道马铃薯匍匐茎、块茎、根和花中PPO活性高，叶和茎中的低，块茎发育过程中块茎的PPO活性不断升高[7]。Vaughn等使用细胞化学和体外酶学方法，发现PPO活性的彻底丧失对大豆幼苗的酚类物质代谢没有影响。用Tentoxin处理组织导致PPO的完全失去并不影响酚类物质在这些组织中的积累[2,4,8]。当植物体内发生生理紊乱或组织受损时，PPO与底物的亚细胞区域化被打破，PPO底物被激活产生黑色或褐色的沉积物，所以产生了酶促褐变，使果品经济价值下降[9]。

本课题组之前有过关于PPO的研究，希望能用转基因的方法来调控草莓果实中PPO基因的表达，从而提高草莓果实的品质及经济价值，而构建草莓多酚氧化酶基因的表达载体是首要条件。

1 材料与方法

1.1 材 料

植物材料:五叶草莓(Fragaria Pentaphylla)的叶片。T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶，PCR产物纯化试剂盒等购自北京生工科技公司。EcoRI，HindIII，BamHI，PstI限制性内切酶购自宝生物工程公司。BglⅡ等限制性内切酶购自NEB公司。植物表达载体pCAMBIA1304、大肠杆菌菌株DH5α、根癌农杆菌GV3101和pGEM-1809质粒由农业应用新技术北京市重点实验室保存。pGEM-T载体、质粒小提试剂盒、DNA marker、DNA快速纯化回收试剂盒购自天根生化科技公司。引物合成、DNA测序为北京三博远志生物技术公司。其他试剂为国产分析纯。

1.2 方 法

1.2.1 草莓多酚氧化酶基因FpPPO1全长的克隆 步骤Ⅰ：取野生五叶草莓叶片，按照魏琦超改良的CTAB法提取草莓总DNA[10]。CTAB抽提液(2.5%(W/V)CTAB,100 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0)，20 mmol/L EDTA(pH 8.0),1.4 mol/L NaCl)；CTAB/NaCl溶液(10% CTAB，0.7 mol/L NaCl)；CTAB沉淀液(1%(W/V)CTAB，50 mmol/L Tris-HCl(pH 8.0),10 mmol/L EDTA(pH 8.0)；高盐TE缓冲液(10 mmol/L Tris-Hcl(pH 8.0),1 mmol/L EDTA(pH 8.0),1 mol/L NaCl)；氯仿/异戊醇(24∶1)；无水乙醇；70%乙醇。

步骤Ⅱ：分别用EcoRI、HindIII、BamHI、PstI在100 μL的总反应体积中酶切过夜，反应体系如下:基因组DNA 15 μL (30 ng/μL),10×Buffer 5 μL，相应的限制性内切酶1 μL(10～15 U/μL)，加水补至50 μL，在37 ℃反应2 h， 65 ℃水浴15 min灭活限制性内切酶。取6 μL电泳检测酶切效果，剩余反应液用两倍体积乙醇沉淀后溶于20 μL TE buffer。

1.2.2 草莓多酚氧化酶基因FpPPO2全长的克隆 步骤Ⅰ：取野生五叶草莓叶片，按照魏琦超改良的CTAB法提取草莓总DNA[7-8](同1.2.1步骤Ⅰ)。在DNA溶液中加入等体积的Tris平衡酚(pH 8.0)∶氯仿∶异戊醇为25∶24∶1的混合液，混匀10 min于8 400 r/min低温离心10 min。取上清液于另一离心管中，重复本步骤至杂质层基本消失。向上清液加入1/10体积的3 mol/L醋酸钠(pH 6.8)，再加入2倍体积预冷的无水乙醇，低温条件下静置30 min或过夜，以充分沉淀DNA。在0 ℃ 8 000 r/min离心5～10 min,除去上层废液(酒精)，向沉淀中加入75%酒精洗涤，除去酒精室温干燥15～30 min。向沉淀中加入0.5～1.0 mL TE (pH 8.0)，50 ℃保温10 min左右至沉淀完全溶解。8 000 r/min离心3 min，取上清液，于-20 ℃下保存备用。

步骤Ⅳ：使用根据金晓磊克隆得到的732 bp PPO基因片段设计PCR引物。上游引物P1r:5'-TCAATTAATCTAAGAAGCAAATTCAANCTNGANAC-3'；P2r:5'-TCAATTAATCTAAGAAGCAAATTCAANCTNGA-3'；P3r:5'-TCAATTAATCTAAGAAGCAANTTNAANCT-3'；P4r:5'-TCAATTAATCTAAGAAGCAANTTNAA-3'；下游引物P939f:5'-TGTATGAGCGCGCACGACTATAAGAC-3'；P728f: 5'-CATGGACAAGCCACAAGCCAACTCCAC-3'。PCR反应体系包括2 μL DNA模板，2.5 μL 10×PCR缓冲液，2 μL 2 mmol/L dNTPs，引物各2 μL，0.5 U TaqDNA聚合酶，加无菌水至25 μL。每轮PCR反应体系: PCR循环参数为94 ℃ 3 min，之后94 ℃ 30 s，70 ℃ 30 s，每个循环降低0.5 ℃，72 ℃ 2 min进行20个循环，而后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min进行10个循环，72 ℃ 5 min。反应结束后取2μL反应液进行2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。PCR产物用PCR产物纯化试剂盒纯化回收，操作按照北京生工科技公司试剂盒说明书进行。

步骤Ⅴ：用T4DNA连接酶将纯化的DNA片段与PGEM-T载体连接，将连接反应产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含氨苄青霉素和X-Gal、IPTG的LB选择平板上，37 ℃过夜后，平板上长出稀疏的蓝色和白色的克隆菌落，挑取白色菌落。

步骤Ⅵ：用质粒提取试剂盒提取质粒。经HindⅢ和PstⅠ对质粒DNA进行酶切鉴定。酶切鉴定正确的质粒送北京三博远志生物技术有限责任公司进行序列测定。

步骤Ⅲ：取上述酶切产物 5 μL, 溶解到0.2 μg/μL,用0.3 U T4 DNA连接酶,分别在总体积10，20，50 μL中于4 ℃连接过夜,PCR反应体系:2×Master Mix12 5 μL，上下游引物(20 μmol/L)各1 μL，模板DNA (连接产物或上一轮PCR产物)1 μL，加水补至25 μL。以确定自连接反应的最佳反应体积。次日取2 μL反应液用于PCR。

试样的检测面经研磨后，加以腐蚀，划一条既与熔合线底部相切，又平行于试板轧制面的直线，在此直线上，每隔0.5mm进行维氏硬度的测定，切点两侧各测七点（见图4）。焊接热影响区最高硬度试验结果如表5所示。

步骤Ⅱ：以提取的草莓基因组DNA为模板,设计其上下游引物。P1:5'-CAGATCTACATCAGCAAGAAACTCAATTTTGATAGTGTC-3'；P2:5'-AGATCTACCTCAGAGGCCATGGCTTCTCTGTC-3'。反应体系25 μL，以1 μL DNA模板，12.5 μL 2×mix缓冲液，8.5 μL ddH2O，引物各1.5 μL。PCR 反应条件95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 个循环，72 ℃延伸5 min终止反应，4 ℃保存。PCR产物用琼脂糖凝胶电泳，切下约1 800 bp的目的条带，用小量DNA快速胶回收试剂盒回收(方法按试剂盒说明进行)。

步骤Ⅲ：将回收产物与pGEM-T载体在16 ℃过夜连接。后转化E.coli DH5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选含有目的质粒的大肠杆菌菌落，随机挑取白色菌落，扩大培养。

多酚氧化酶是都具有与铜离子结合的特征区域A、B，属于铜金属酶[11]。在基因工程研究中，分析遗传基因的全长cDNA序列是研究基因结构、基因表达和基因功能的重要前提[12]。

从图8中可以观察到，老化使材料试样的电阻升高，同时也使试样的波形更加清晰，可见老化提高了材料对正弦信号激振力的敏感度。换言之，材料老化处理后，其准确检测受力的能力得到了提升。本文采取固定滑块的方式，也就是利用摩擦力固定，因此在激振力作用下，滑块的摩擦会产生高频信号干扰。通过低通滤波排除装夹摩擦产生的高频干扰信号，滤波前后复合材料时域波形图的对比见图 9。由于实验需要获取完整的信号进行研究，因此实验过程中未采用任何滤波手段。通过图9可以发现，低通滤波器将摩擦产生的信号过滤，使731 Hz的信号清晰地展现出来。

1.2.3 草莓多氧化酶基因正义植物表达载体的构建 步骤Ⅰ：以纯化后所得到的质粒PGEM-T1809和表达载体pCAMBIA1304，经BglⅡ单酶切收集目的片段克隆，转化大肠杆菌DH5α，构建出植物表达载体pCP1809(图1)。重组质粒pCP1809克隆采用菌落PCR法和限制性内切酶酶切法鉴定。

图1 草莓表达载体pCP1809构建过程 Fig.1 Flow chart of constructing plant expression vector pCP1809

步骤Ⅱ：用液氮转化法将pCP1809转入根癌农杆菌感受态GV3101。取5 μL pCP1809加到50 μL的Top10感受态细胞中，液氮速冻后37 ℃水浴5 min，取出管后立即置于冰浴中2 min；加入500 μL的37 ℃预热的LB液体培养基(无抗),150 r/min 28 ℃ 3～5 h；8 000 r/min 离心1 min，留下200 μL的菌液，加到LB(固)+Kan+Rif的培养基上，用玻璃棒轻轻涂开，待表面干燥后，倒置，37 ℃ 12～16 h。在筛选培养基LB+卡那霉素(Kan)50 mg/L+利福平(Rif)50 mg/L上获得菌落。从长有转化根癌农杆菌菌落的平板上各随机挑取几个分隔良好的单菌落，利用菌落PCR方法鉴定出阳性单菌落，成功构建了草莓多酚氧化酶基因的正义表达载体pCP1809并将其导入农杆菌。

根据在吉隆坡地铁MRT一期施工过程中的经验，本项目中大量使用大体积混凝土结构，因此根据施工管理过程中的经验在此对项目实施过程中大体积混凝土裂纹产生的原因进行分析并提出解决措施。

评定两组术后髋关节的恢复情况,采用Harris髋关节评分法,满分100分,90分以上为优、80-89分为良、70-79分为中,70分以下为差。

1.2.4 草莓多酚氧化酶基因反义植物表达载体的构建 步骤Ⅰ：用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取草莓叶片总RNA。按照说明书操作。

2.1.1 DNA纯度检测 在提取过程中未发现多酚类物质的褐化，粗提的DNA均为白色，纯化后呈无色透明，无褐化的现象，能迅速溶解于TE缓冲液。紫外检测结果发现，OD260/OD280的比值均在1.8～1.9之间，表明所得DNA溶液中蛋白质杂质去除较完全。

步骤Ⅲ：根据Genbank数据库中其他物种的PPO基因序列设计兼并引物扩增片段，引物为F300 5'-TACGAACTTCTATTGTCTTACCTTCTC-3'，R300 5'-TGGGACTACCTGGCGGGTCAA CAATCA-3'；得到一个400 bp左右的片段，根据片段测序结果设计设计5'-RACE及3'RACE引物。5'RACE：5'-GAATTCTTGTGAGAGAAGGAAGAC-3'，3'RACE： 5'-GTCTCCAAATGTGGAGCCGCAGAC-3'。 PCR反应体系50 μL:10ⅹPCR缓冲液5 μL；提取的样品DNA1 μL;上游引物(25 μM)2 μL；下游引物(25 μM)2 μL；dNTPs(10 μM)1 μL；Taq DNA聚合酶(2 U)1 μL；灭菌的无核酸重蒸水。PCR反应条件：94 ℃预变性 5min，94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min结束反应。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。按照北京生工科技公司DNA回收试剂盒回收DNA。

步骤Ⅳ：提取质粒，用BglⅡ和SpeⅠ37 ℃酶切2～4 h，将酶切产物进行凝胶电泳检测。挑取有正确插入的质粒，进行测序。

步骤Ⅴ：序列测定由北京三博远志生物技术有限责任公司完成。利用DNAMAN和NCBI等软件和网络分析测序结果。

步骤Ⅵ：在筛选培养基LB+卡那霉素(Kan)50 mg/L+利福平(Rif)50 mg/L上获得菌落。从长有转化根癌农杆菌菌落的平板上各随机挑取几个分隔良好的单菌落，利用菌落PCR方法鉴定出阳性单菌落。成功构建了草莓多酚氧化酶基因的反义表达载体pCP430导入农杆菌(图2)。

图2 植物表达载体pCP430构建过程 Fig.2 Flowchart of constructing plant expression vector pCP430

2 结果与分析

2.1 草莓多酚氧化酶基因FpPPO1全长的克隆

步骤Ⅱ：按照SMARTTM RACE cDNA扩增试剂盒使用说明书反转录成5'-cDNA及3'-cDNA用于扩增PPO基因全长。

2.1.2 电泳检测DNA CTAB法抽提的DNA溶液用琼脂糖凝胶电泳检测总基因组DNA的有无及其完整性。如图1，可以看出获得的DNA电泳带型好，主带清晰，无弥散现象，RNA去除干净，点样孔没有残留的DNA表明DNA受损程度低，平均分子量在20 kb以上。(图3)

图3 改良CTAB法提取总DNA电泳图 Fig.3 Improved CTAB method to extract total DNA electrophoresis

2.1.3 重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定 以提取的阳性重组质粒为模板，用M13(+)和M13(-)的引物对插入片段进行PCR检测。重组质粒的PCR产物与目的条带大小相同。重组质粒用双酶酶切出的片段与目的条带大小也相同，这与预期的结果完全一致。由此可以判断,目的DNA序列克隆成功。

图4 草莓 PPO1 基因全长序列及推导的氨基酸序列 Fig.4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PPO of Fragaria pentaphylla

2.1.4 序列分析 从草莓叶片中成功扩增出PPO基因的全长序列，通过DNAman序列拼接后获得长度为3 591 bp的DNA 序列(图4),命名为FpPPO1，已在GenBank登陆，登陆号为HM063946。经GenBANK推测，怀疑在FpPPO1序列前部有500～600 bp的启动子。

2.1.5 同源性分析 草莓FpPPO1基因全长里有一个完整的 ORF(open reading frame)，其中 5'侧翼区长972 bp，3'侧翼区长798 bp，编码1 196个氨基酸。使用BLASTN和BLASTX的程序，将克隆到的基因全长FpPPO1与GenBANK中的PPO核苷酸及PPO氨基酸序列进行比较。结果表明，与金晓磊已克隆多酚氧化酶基因片段序列(GenBank号: EU523113)比对核苷酸相似性100%，与其他物种的PPO序列有较高的同源性，核苷酸序列相似性为73%～76%，氨基酸相似性为57%～77%。

2.1.6 进化分析 FpPPO1 基因序列与GenBank 中四个科的十二种植物PPO基因进行同源性比对创建系统发育树(图5)，构建出三个主要分支。第一个分支有7个基因，进化过程中有来自蔷薇科的苹果(Malus domestica)、沙梨(Pyrus pyrifolia)、白梨(Pyrus bretschneideri),李(Prunus salicin )和五叶草莓(Fragaria Pentaphylla)，山茶科金花茶(Camellia nitidissima),葡萄科葡萄(Vitis vinifera )。可以看出，不同物种之间PPO基因的相似性仍然较高，也从侧面证明了植物PPO基因在不同物种之间进化关系较近。第二个分支有一个基因，是胡桃科胡桃(Juglans regia)。第三个分支有四个基因，分别是蔷薇科榅桲(Cydonia oblonga)、扁核木(Prinsepi sinensis)、皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)和绣线梅(Neillia thyrsiflora var.tunkinensis)。

MEGA软件创建的PPO基因进化树，经分析表明PPO基因在物种进化过程中趋于保守，整体上表现出较高的相似性。不同科、属的植物的PPO基因高度保守，且PPO基因在不同物种间的表达能力上也高度相似，起源比较复杂。暗示该基因在植物种类的分化之前就已产生，推测五叶草莓的PPO基因在演化过程中可能存在相似进化机制。

图5 草莓PPO1基因氨基酸序列进化树 Fig.5 PPO1 gene amino acid sequence of evolutionary tree of Fragaria pentaphylla

2.2 草莓多酚氧化酶基因FpPPO2全长的克隆

[3] Vaughn K C.Polyphenol oxidase: the chloroplast oxidase with no established function[J].Physiology Plant,1988,72:659-665

张树仁提出结构加固设计必须考虑分阶段受力影响。黄海东、向中富、刘剑锋等[7]从平截面假定出发，基于组合截面内力分配提出了拱桥增大截面加固技术的内力计算方法，进一步强调了增大截面加固设计分阶段受力的特性。

“三聚氰胺事件”之后，中国奶业政策的一大举措就是规范生鲜乳的销售秩序。主要手段是根据域内乳企的加工能力和现有的养殖场存栏量划分生鲜乳交易的对象，使养殖场和乳企一一对应，促使乳企和养殖场之间签订长期销售合同。为保证合同执行，一方面政府严查“扰乱收购秩序”的行为，另一方面乳企通过保证收购的承诺、账期和对中断交奶的惩罚措施来维系双方的交易。同时，政府和奶业协会等作为第三方允诺帮助双方协商公允的价格。然而，实际执行中，几个方面的不对等导致养殖者的谈判力不断弱化。

泳道M.DNA marker; 泳道1～3.重组质粒BglⅡ单酶切产物 Lane M.DNA marker; Lane 1-3.BglⅡⅡdigest product of recombinant plasmid 图6 重组质粒pGEM-T1809限制性核酸内切酶酶切鉴定 Fig.6 Identification of recombinant plasmid pGEM-1809 with restriction enzyme digestion

2.2.2 序列分析 从草莓叶片中成功扩增出PPO基因的部分序列，通过DNAman序列拼接后获得长度为1 809 bp的cDNA 序列(图7)，将其命名为FpPPO2，已在GenBank登陆，登陆号为HM063947。

图7 草莓PPO2基因序列及推导的氨基酸序列 Fig.7 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PPO2 of Fragaria pentaphylla

2.2.3 同源性分析 经开放阅读框预测发现其包含一个完整的ORF，编码602个氨基酸。使用BLASTN和BLASTX的程序，将克隆到的PPO基因全长与GENE BANK中的PPO核苷酸及PPO氨基酸序列进行比较。结果表明与GENE BANK中其他物种的PPO序列有较高的相似性，核苷酸序列比较相似性为74%～99%，氨基酸相似性为74%～99%。

2.2.4 进化树分析 FpPPO2基因序列与GenBank中5个科的12种植物PPO基因同源序列进行同源性比对创建系统发育树(图8)，结果显示构建出两个主要分支。第一个分支有6个基因，进化过程中有来自蔷薇科的五叶草莓(Fragaria Pentaphylla)，白梨(Pyrus bretschneideri)，沙梨(Pyrus pyrifolia)，李(Prunus salicina)，山茶科金花茶(Camellia nitidissima)，豆科紫苜蓿(Medicago sativa),可以看出，不同物种之间PPO基因的相似性仍然较高，也从侧面证明了植物PPO基因在不同物种之间进化关系较近。第二个分支有6个PPO 基因，是蔷薇科榅桲(Cydonia oblonga) ，绣线梅(Neillia thyrsiflora)，皱皮木瓜(Chaenomeles speciosa)，西洋梨(Pyrus communis)，胡桃科胡桃(Juglan regia)，大戟科蓖麻(Ricinus communis)。由于相同科、属的序列之间表现出很高的同源性，推测五叶草莓的PPO基因在演化过程中可能存在相似进化机制。

图8 草莓PPO2基因氨基酸序列进化树 Fig.8 PPO2 gene amino acid sequence of evolutionary tree of Fragaria pentaphylla

2.3 草莓多氧化酶基因正义植物表达载体的构建

随机挑取5个处理平板上的单菌落进行菌落PCR鉴定，获得3个阳性克隆，扩增出1 809 bp左右的目的片段。鉴定出的阳性克隆提取质粒，经BglⅡ单酶切后电泳检测，也切出了1 809 bp目的片段。酶切结果与预期结果完全一致，说明已获得PPO2植物表达载体pCP1809。

2.4 草莓多酚氧化酶基因反义植物表达载体的构建

2.4.1 草莓总RNA的提取 提取总 RNA，经 DNase 处理后电泳检测(图9-10),可清晰看到28S和18S RNA 两条带,无 DNA 污染，可见提取的 RNA 质量较好，基本没有降解。

泳道M.DNAmarker; 泳道1.重组质粒BglⅡ单酶切产物 Lane M.DNA marker; Lane 1.BglⅡdigest product of recombinant plasmid 图9 重组质粒pCP1809限制性核酸内切酶酶切鉴定 Fig.9 Identification of recombinant plasmid pCP1809 with restriction enzyme digestion

M.DNAmaker；Lane 1 图10 草莓RNA凝胶电泳图 Fig.10 Electrophoresis of RNA product of strawberry

2.4.2 3'和 5'端未知序列的克隆 以总 RNA 反转录后的 cDNA 为模板,以通用引物 5' PCR Primer 与特异 5' RACE 引物配对进行5'端扩增,得到一条300 bp 左右的片段(图11)。以 3' PCR Primer与 3' RACE 引物配对进行 5'端扩增,得到一条520 bp 左右的片段(图12)。分别回收扩增的片段，与 pGM-T 载体连接后转化至大肠杆菌DH5α，通过酶切重组质粒检测筛选阳性克隆并测序。

M:DNA marker；1:RT-PCR扩增产物；2:5’-RACE扩增产物 M:DNA marker；Lane 1:RT-PCR amplified fragment of PPO gene;Lane 2: 5’-RACE amplified fragment of PPO gene 图11 草莓PPO基因的扩增结果 Fig.11 The PCR result based on PPO gene of strawberry

M:DNA marker； 1:3’-RACE扩增产物 M:DNA marker；Lane 1:3’-RACE amplified fragment of PPO gene 图12 草莓PPO基因的扩增结果 Fig.12 The PCR result based on PPO gene of strawberry

2.4.3 酶切分析 随机挑取5个处理平板上的单菌落进行菌落PCR鉴定。鉴定获得3个阳性克隆，扩增出400 bp左右的目的片段。鉴定出的阳性克隆提取质粒，经BgⅡ和SpeI双酶切后电泳检测，也切出了400 bp左右的目的片段。酶切结果与预期结果完全一致，说明已获得PPO植物表达载体pCP430(图13)。

3.促进学生创造参与策略。通过对基本知识的学习,学生不能满足于一般的学习任务,还要将所学的知识、方法内化,通过迁移、重组创造性的运用到新的体育知识的学习中,从而深化学生对新知识的理解。这是高层次的参与过程，是学生主动参与的最直接，最彻底的方式。实践中，可以通过集体交流,小组总结将个人学习成果贡献给集体享用,同时接受集体的帮助,享受集体学习的成果。

泳道M.DNA marker; 泳道1.重组质粒BglⅡ和SpeI酶切产物 Lane M.DNA marker; Lane 1.BglⅡ和SpeI digest product of recombinant plasmid 图13 重组质粒pCP1098限制性核酸内切酶酶切鉴定 Fig.13 Identification of recombinant plasmid pCP430 with restrictionenzyme digestion

2.4.4 序列分析 通过草莓叶片中成功扩增出PPO基因的部分序列及对应的氨基酸序列(图14)。

图14 草莓 PPO 基因部分序列及对应的氨基酸序列 Fig.14 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PPO from strawberry

3 讨 论

步骤Ⅴ：用质粒提取试剂盒提取质粒DNA，然后用BglⅡ对质粒DNA进行单酶切鉴定和PCR检测。目的片段的序列测定将经过酶切和PCR检测的确定带有目的片段的菌落穿刺培养，送于北京生物工程公司进行序列测定。

本研究根据已经发表的多酚氧化酶基因片段序列设计引物，利用改良CTAB法和PCR技术，首次同时克隆了五叶草莓两个完整的多酚氧化酶全长基因，分别命名为FpPPO1和 FpPPO2，他们的序列已经在GenBank中登录，登录号为HM063946和HM063947。和已发表的PPO的核苷酸序列比较，同源性达57%～99%，说明不同植物PPO基因具有一定的同源性，相同科、属的植物的PPO之间的同源性更高。利用MEGA软件对PPO核苷酸序列进行进化树分析，发现与其他不同科的物种基因亲缘关系较近，推测草莓起源较复杂，在演化过程中可能存在相似进化机制。这两个基因彼此之间的核苷酸序列和氨基酸序列的相似性也较高，怀疑这两个基因属于同一个基因家族。但他们的具体作用机制和进化机制尚待进一步研究。

对于已被命名的草莓多酚氧化酶FpPPO1的全长克隆采用的是反向PCR的方法，DNA的酶切和自连接是IPCR中的关键步骤，酶切DNA不完全可能导致IPCR得不到产物或扩增出几个长度不同的产物[13]。如果DNA浓度高或反应体积小，则可能生成各种串联多聚体，这就是IPCR中经常扩增出多个产物的主要原因，所以在20μL体积中进行环化反应避免了多聚体的生成，使IPCR结果相当稳定。

通过对GitHub中软件存储库进行数据爬取，我们获得了27万条存储库信息.我们首先通过异常值处理，人工剔除异常记录等处理手段，对原始数据进行数据清洗，保留下约13万条存储库记录.然后，通过数据审查，发现其整体的数据分布是有偏的，并非正态分布，考虑到Github开源社区中的开发者在学习使用平台时会建立许多用于入门的练习项目，一些经常参与活跃项目开发的软件工程师也会经常建立新的存储库用于测试，还有一些项目长期疏于管理且无人关注成为了死项目等诸如此类的原因，我们尝试使用聚类方法从数据层面上对项目进行分类.在聚类结果中去除异常记录，最终获得90956条软件存储库的数据集合作为研究对象.

本研究从全金安区四个级别随机抽取159个定级单元作为检验样点，通过采用统计分析软件SPSS中的相关性分析的功能计算定级指数与经营效益分值间的相关程度。

在获得PPO基因全长的基础上，构建了草莓正义和反义表达载体，经酶切鉴定和测序分析确定载体构建正确。pCAMBIA系列的载体是最常用的植物表达载体，不少转基因研究所用的表达载体以其为骨架改造而成[14]，与近些年来发展起来的植物病毒表达载体相比，质粒的拷贝数低，外源基因表达水平低，但是表达更加稳定[15]。本试验带有CamMV35s启动子和GUS报告基因的双元载体的CAMBIA1304为基础，也是出于后期应用目的的考虑，构成用于转化的双元载体pCP1809，pCP430，他们既可以做稳定遗传的转基因操作，又可以做快速的瞬时表达研究。为研究草莓中PPO的含量与植株的抗病性、褐变奠定了基础，对探讨PPO在草莓等非跃变型果实成熟的调控机理具有重要意义。

参考文献：

[1] Vaughn K C.Tentoxin induced loss of plastidic polyphenol oxidase[J].Plant Physiology, 1981, 53: 421-428

[5] 李荣林,方辉遂．一个世纪以来对多酚氧化酶研究的进展[J]．福建茶叶,1997,(4):10-14

2.2.1 重组质粒的酶切鉴定和PCR鉴定 从图6可以看出,重组质粒的PCR产物与目的条带大小相同。重组质粒用单酶酶切出的片段与目的条带大小也相同，这与预期的结果完全一致。由此可以判断，目的DNA序列克隆成功。

[4] Vaughn K C.Function of polyphenol oxidase in higher plants[J]. Physiology Plant, 1984, 60:106-112

（三）建设监管平台。潜江市农场管理局与湖北荆谷信息技术有限公司接洽，目前已就资产监管平台软件开发和系统搭建进行实质性操作程序。

最后，人际情绪管理研究主要从社会心理学和认知神经科学领域发展出来，尚缺乏在其他领域的运用.比如，童年期依恋关系是人际情绪管理的雏形，会引导个体终生使用人际情绪管理策略[24-25].因而，人际情绪管理研究能够使人更好的理解依恋关系.人际情绪管理研究对精神障碍和心理治疗,也有着重要的启示.研究发现,精神障碍患者在人际情绪管理使用方面存在异常[26]，规范患者的外在人际情绪管理策略，训练他们更好的使用内在人际情绪管理策略,可成为心理治疗的一个重要目标[27].

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文献管理和使用能力 在文献收集过程中，文献体量较大，内容丰富复杂，学生的文献管理能力需要提高。为此，介绍和要求学生选用NoteExpress、EndNote等参考文献管理工具，借助文献管理工具具有的主题分类和随时笔记的便捷性和优势性，提高学生文献管理能力。另外，学生在写作毕业论文过程中需要经常引用文献，并随时可能对文献顺序进行调整。为此，指导学生科学使用文献管理工具，能够边写作边引用，以及运用行文中参考文献的自动排序功能，从而提高文献使用能力以及引用文献的规范性，促进写作效率的提高。

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