第二信使cAMP具有抑制多种免疫和炎症细胞活性和功能的作用[1]。磷酸二酯酶4(Phosphodiesterase 4, PDE4)是PDE家族的重要成员，广泛分布于免疫和炎症细胞中，且为细胞中水解cAMP的主导PDE[2-4]。因此，PDE4在调节这些细胞的功能上起着非常重要的作用，并成为一个新的抗炎和免疫调节剂的作用靶点而受到普遍关注。咯利普兰(Rolipram)是PDE4的一个特异性抑制剂，通过抑制细胞PDE4活性、升高cAMP含量，咯利普兰可抑制中性粒细胞等向炎症病灶的趋化，抑制单核巨噬细胞等释放炎症因子和黏附分子，降低血脑屏障的通透性，减少NO(Nitric oxide)等超氧化合物的生成，抑制细胞凋亡等而起到抗炎作用[5,6]。

中性粒细胞黏附于内皮细胞是急性炎症的必需过程，也是影响炎症发生、发展的重要因素。中性粒细胞是机体内数量最多的炎症细胞，中性粒细胞表面黏附分子表达的增加是其参与炎症反应的先决条件。研究表明PDE4抑制剂咯利普兰、roflumilast和cilomilast等均能抑制中性粒细胞对人脐静脉内皮细胞的黏附[7]，而咯利普兰对中性粒细胞黏附分子表达的影响及其机制的研究则鲜见报道。中性粒细胞表达的黏附分子主要有淋巴细胞功能相关抗原-1(Lymphocyte function associated antigen-1, LFA-1)和巨噬细胞抗原复合体-1(Macrophage antigen complex-1, Mac-1)，在介导与内皮细胞的牢固黏附及游出血管过程中起重要作用。中性粒细胞黏附分子的表达主要受到p38丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen activated protein kinase, MAPK)、胞外信号调控激酶(Extracellular regulated protein kinases, ERK)、磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)、Janus激酶(Janus kinase, JAK)等多条信号通路调控，当炎症因子与中性粒细胞膜上的相应受体结合后，可触发以上通路的变化并引起中性粒细胞穿出微血管、进入组织发挥抗炎作用[8,9]。研究表明cAMP参与了p38MAPK、PI3K、ERK、JAK条信号通路的调控[10-17]，因此，咯利普兰最初是否通过升高细胞cAMP并调控以上信号通路关键蛋白磷酸化活性变化，抑制中性粒细胞黏附分子LFA-1和Mac-1的表达，阻断与内皮细胞的黏附而发挥抗炎作用需进一步研究，以明确其抗炎的主要信号通路，为PDE4选择性中药抑制剂的药理研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

小鼠抗猪CD11a/LFA-1-FITC(MCA2308F)、小鼠抗狗(与猪有交叉反应)CD11b/Mac-1(MCA177S)、大鼠抗小鼠CD4-FITC(DC034)购于AbD Serotec；抗ERK 抗体(ab4819)、抗p38抗体(ab38283)、山羊抗兔 IgG H&L(HRP)抗体(ab205718)、山羊抗小鼠 IgG H&L(FITC)抗体(ab97002)购于Abcam；抗JAK-1 抗体(225499)购于Invirogen；抗PI3K p85抗体(orb106105)购于Biorbyt；咯利普兰、fMLP 购于Sigma；RPMI1640 购于Gibco；葡聚糖 T-500购于Pharmacia；磷酸酶抑制剂PhosSTOP(04906845001)、蛋白酶抑制剂cOmplete Tablets(40693132001)购于Roche；兔抗β-actin (Loading) Control(bs-0061R)购于北京博奥森生物技术有限公司；彩色预染蛋白分子量标准(P0068)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(P0015L)购于上海碧云天生物技术有限公司；人外周血淋巴细胞分离液(LTS1077)购于天津市灏洋生物制品有限责任公司；白细胞裂解液(c500015)购于上海齐一生物科技有限公司；其它试剂均为分析纯。

1.2 中性粒细胞和内皮细胞的纯化

采取猪新鲜血液 100 mL，肝素钠抗凝。分别经葡聚糖除去红细胞、淋巴细胞分离液除去淋巴细胞和单核细胞及纯水溶胀残留的红细胞等方法得到高纯度的中性粒细胞[18]。猪肺微血管内皮细胞采用组织块消化法分离提取，纯度≥ 95%，由兽医学(中医药)北京市重点实验室张涛副教授提供。

1.3 中性粒细胞与内皮细胞的黏附试验

将纯化的中性粒细胞用RPMI1640漂洗2次，计数并调细胞个数为5×107个/mL。设空白对照组、炎性对照组、咯利普兰组，每组2个重复。各组分别加入适量RPMI1640，100 μL 细胞悬液，咯利普兰组加入咯利普兰100 μL(反应液浓度1 μmol/L，可抑制50% PDE4活性)，共置于37 ℃、5% CO2培养箱预培养30 min。除空白对照组外，炎性对照组和咯利普兰组分别加入10 nmol/L的fMLP 100 μL，以 RPMI1640补足各组反应液至1 mL，再次置于37 ℃、5% CO2培养箱进行致炎的刺激培养，分别在5 min、30 min、3 h和6 h取出细胞样品，用RPMI1640漂洗2次。按分组要求将100 μL中性粒细胞悬液加入到长满内皮细胞的96孔培养板中，37 ℃、5% CO2培养箱培养1 h，PBS洗去未黏附细胞，加入0.25%虎红100 μL，室温作用10 min，洗去游离虎红，加PBS-乙醇(1∶1)200 μL/孔，室温作用1 h，酶标仪570 nm测A值。

1.4 黏附分子LFA-1和Mac-1的检测

4) 根据FAO和WHO关于食物理想蛋白质含量标准，四季竹的相应指标优于少穗竹，接近食物理想蛋白质含量标准。

1.5 p38MAPK、ERK等磷酸化活性检测

fMLP致炎时间的确定。各时间段400 μL中性粒细胞(反应液细胞数为5×107个/mL)加入100 μL 终浓度为 100 nmol/L fMLP致炎，每组2个重复。因激酶磷酸化活性变化迅速，分别在30 s、1 min、5 min和30 min后迅速将样品取出置于冰水中降温，取150 μL细胞悬液4 ℃、2 000 r/min离心8 min。细胞沉淀加入100 μL 细胞裂解液(含足量蛋白酶抑制剂PhosSTOP和磷酸酶抑制剂cOmplete Tablets裂解细胞，然后加入25 μL 5×Loading buffer混匀，常规western blot法检测中性粒细胞p38MAPK、ERK、PI3K和JAK磷酸化活性，β-actin为阳性对照。以灰度分析软件对条带进行分析，以目的条带/β-actin条带表示各蛋白磷酸化活性变化。

设空白对照组、炎性对照组、咯利普兰组，每组2个重复。各组加入适量PBS、中性粒细胞(反应液细胞数为5×107个/mL)，咯利普兰组加入咯利普兰(反应液浓度为1 μmol/L)，于37 ℃、5% CO2培养箱平衡30 min。随后各组加入终浓度为 100 nmol/L fMLP迅速致炎(空白对照组除外)，总反应体系为500 μL，放入37 ℃、5% CO2培养箱进行刺激培养。经预试验确定在fMLP刺激1 min后迅速将样品取出置于冰水中降温，各组取150 μL细胞悬液4 ℃、2000 r/min离心8 min。细胞沉淀加入100 μL细胞裂解液(含足量蛋白酶抑制剂PhosSTOP和磷酸酶抑制剂cOmplete Tablets)裂解细胞，然后加入25 μL 5×Loading buffer混匀，常规western blot法检测中性粒细胞p38MAPK、ERK、PI3K和JAK磷酸化活性，β-actin为阳性对照。以灰度分析软件对条带进行分析，以目的条带/β-actin条带表示各蛋白磷酸化活性变化。

1.6 统计分析

数据以柱形图±偏差表示，采用单因素方差及t-检验分析对照组与药物组等差异显著性，P<0.05为有统计学意义。炎性对照组与空白对照组比较，“#”表示P<0.05，“##”表示P<0.01；炎性对照组与咯利普兰组比较，“*”表示P<0.05，“**”表示P<0.01。

2 结果

2.1 咯利普兰对中性粒细胞与内皮细胞黏附的影响

由图1可知，与空白对照组比较，炎性对照组致炎因子fMLP在不同时间(6 h除外)可显著促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附(P<0.05，P<0.01)。与炎性对照组比较，咯利普兰对fMLP刺激的中性粒细胞与内皮细胞的黏附在不同时间均有明显的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

图1 咯利普兰对中性粒细胞与内皮细胞黏附的影响 Fig.1 Influence of rolipram on the adhesion of neutrophils and endothelial cells

2.2 咯利普兰对对中性粒细胞LFA-1、Mac-1表达的影响

根据图2结果，与空白对照组比较，炎性对照组致炎因子fMLP在不同时间(5 min除外)对中性粒细胞LFA-1表达均有明显的促进作用(P<0.05)；在不同时间内对中性粒细胞Mac-1表达均有一定的促进作用，但均无显著性差异。与炎性对照组比较，咯利普兰对fMLP刺激的中性粒细胞LFA-1的表达在不同时间均有一定的抑制作用，其中在5 min和30 min可显著抑制LFA-1的表达(P<0.01)；对中性粒细胞Mac-1的表达在不同时间均有一定的抑制作用，其中在5 min可明显抑制Mac-1的表达(P<0.01)。

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图2 咯利普兰对中性粒细胞LFA-1/Mac-1表达的影响 Fig.2 Influence of rolipram on LFA-1 and Mac-1 expression of neutrophils

2.3 fMLP对中性粒细胞 p38MAPK和ERK 磷酸化活性的影响

由图3可知，中性粒细胞p38MAPK磷酸化活性在fMLP刺激后逐渐升高，在5 min达到最高，随后降低。ERK 磷酸化活性在fMLP刺激后也逐渐升高，在1 min达到最高，随后也降低。结合前人相关研究，将咯利普兰试验fMLP的刺激时间确定为1 min。

①方案制定：各职能部门和人力资源部联合拟定各部门和各类员工的绩效考核方案，将方案提交给相关部门，最终由高层领导裁决。

图3 fMLP 不同时间对中性粒细胞p38MAPK、ERK磷酸化活性的影响 Fig.3 Influence of fMLP on p38MAPK and ERK phosphorylation of neutrophils in different time

2.4 咯利普兰对对中性粒细胞 p38MAPK、ERK 磷酸化活性的影响

根据图4可知，与空白对照组比较，炎性对照组致炎因子fMLP能够显著促进中性粒细胞p38MAPK、ERK磷酸化活性(P<0.05)。与炎性对照组比较，咯利普兰对fMLP刺激的p38MAPK磷酸化活性有一定的抑制作用，但无显著性差异，而对fMLP刺激的ERK磷酸化活性具有极明显的抑制作用(P<0.01)。

[15] Koizumi K, Nakajima H. Serotonin induces the migration of PC12 cells via the serotonin receptor 6/cAMP/ERK pathway[J]. Biomed Rep, 2014, 2(1):29-33

1.2.7 基因测序 针对大前庭水管综合征的特异性基因SLC26A4的21个外显子设计了18对特异性引物，将SLC26A4基因进行全外显子扩增测序。扩增的PCR体系包括10×L.A.缓冲液、dNTPs、引物、L.A.Taq酶及DNA模板，总体积为30 μl。扩增完成后，将PCR产物进行纯化，使用ABI 3130对产物进行Sanger测序。测序序列经过与参考基因组比较(NCBI：NG_008489.1)以及家系分析，确定致病突变。

经多次试验，均未检测到中性粒细胞PI3K、JAK磷酸化活性条带，可能与其在猪中性粒细胞的低表达有关。

图4 咯利普兰对中性粒细胞p38MAPK、ERK磷酸化活性的影响 Fig.4 Influence of rolipram on p38MAPK and ERK phosphorylation activity of neutrophils

3 讨 论

血液里的中性粒细胞正常情况下并不与内皮细胞黏附，但在炎症时中性粒细胞减速、贴边，逐渐与内皮细胞松散结合。接着在一些细胞因子的作用下，中性粒细胞表面的整合素家族被激活并与内皮细胞表面的配体结合，导致中性粒细胞与内皮细胞牢固黏附并从内皮细胞的连接处游出血管。在中性粒细胞表达的整合素家族主要是LFA-1和Mac-1。LFA-1可与内皮细胞上ICAM-1和ICAM-2黏附，而Mac-1只与ICAM-1黏附。适当的中性粒细胞黏附是机体的正常防御反应，但过度的黏附可引起内皮细胞损伤、管通透性增大、组织水肿渗出增多、加重组织器官损伤等一系列病理变化[19,20]。因此，临床上必须在炎症早期对中性粒细胞与内皮细胞黏附进行干预，才能取得较为理想的治疗效果。

咯利普兰通过干预组织细胞ERK活性对机体可起到保护作用：通过抑制人外周血单核细胞ERK1/2磷酸化活性，咯利普兰可阻断粉尘螨诱导的单核细胞IL-5表达的升高，提示其通过ERK信号途径抑制过敏原诱导的免疫活性细胞的活化[32]；通过提高少突胶质细胞前体细胞ERK磷酸化活性，咯利普兰可促进其成熟和髓鞘的再生，这有助于多发性硬化症的治疗[33]。由试验结果可知，咯利普兰对fMLP刺激的中性粒细胞ERK磷酸化活性具有极明显的抑制作用。因此，咯利普兰抑制中性粒细胞LFA-1、Mac-1的表达并减少与内皮细胞的黏附可能与其抑制ERK磷酸化活性密切相关。

p38MAPK是分布于细胞质中具有磷酸化作用的一类蛋白激酶，细胞外的多种应激原均可将其激活，通过调节核转录因子、细胞骨架蛋白和其它酶类等的磷酸化，参与细胞增殖、分化及凋亡等过程，与炎症、肿瘤等多种疾病的发生、发展和转归密切相关，被认为是细胞信息传递的交汇点和共同通路。研究表明p38MAPK参与细胞黏附分子的调控：如烧伤血清可通过p38MAPK信号转导通路增强血管内皮细胞VCAM-1的表达[25]；白细胞介素IL-27可通过p38MAPK途径下调中性粒细胞表面黏附分子Mac-1的表达，进而抑制中性粒细胞的黏附[26]；乙酰乙酸乙酯可诱导单核细胞LFA-1表达的上调，以p38MAPK抑制剂SB203580预处理单核细胞可抑制LFA-1表达的上调，提示乙酰乙酸乙酯有助于增加p38MAPK的活化[27]。咯利普兰也能抑制IFN-γ介导的 U937单核细胞p38MAPK磷酸化活性[28]。由试验结果可知，咯利普兰对fMLP刺激的p38MAPK磷酸化活性虽有一定的抑制作用，但无显著性差异。

ERK是MAPK家族的一员，是Ras丝裂原信号转导下游的核心元件，参与调节细胞多种生理病理功能。ERK激活后不仅可磷酸化细胞质中的靶蛋白，而且对细胞核内多种转录因子的磷酸化也具有重要作用。ERK是将信息从细胞表面传递至细胞核的关键蛋白，参与细胞的增殖、分化和凋亡，介入细胞形态、细胞骨架和细胞癌变等生物学的调控。研究表明ERK信号参与细胞黏附分子的调控：如HIV-1 Nef基因上调ICAM-1的表达与ERK信号分子磷酸化有关，为HIV-1感染的致病机制及临床治疗提供实验基础[29]；细胞外Ca2+可增强TNF-α诱导的VCAM-1的活化和单核细胞黏附，其机制与TRPC1/ERK1/2/NF-κB信号通路介导的VCAM-1活化单核细胞黏附有关[30]；TNF-α通过NF-κB、ERK和JNK信号通路增强人骨髓间充质干细胞VCAM-1的表达[31]。

根据试验结果，致炎因子fMLP可明显促进中性粒细胞与内皮细胞的黏附，而咯利普兰对fMLP刺激的中性粒细胞与内皮细胞的黏附具有明显的抑制作用。对中性粒细胞黏附起主要作用的黏附分子LFA-1和Mac-1通常处于低亲和力状态，少量分布在细胞膜表面，大部分保存于细胞内的存贮池。在fMLP等刺激因子的作用下中性粒细胞活化，LFA-1和Mac-1通过转位与质膜融合，在数分钟内表达可增加3～10倍，并通过构型的改变，其亲和力也明显提高[21,22]。由图2可知，中性粒细胞LFA-1、Mac-1表达在5 min较高，30 min最低，随后在3 h和6 h又逐渐升高，前期升高可能与存贮池中大量的 LFA-1、Mac-1 释放到质膜有关，而后期的升高可能与其构型改变提高亲和力有关。咯利普兰可抑制内皮细胞和单核细胞黏附分子的表达[23,24]，由试验结果可知，咯利普兰对fMLP刺激的中性粒细胞LFA-1、Mac-1表达在不同时间也均有一定的抑制作用，其中在5 min和30 min可显著抑制LFA-1的表达，在5 min可明显抑制Mac-1的表达，与咯利普兰最大限度抑制中性粒细胞与内皮细胞黏附的时间一致。

目前通过抑制或阻断炎症相关信号通路中关键信号蛋白的异常表达已经成为对抗炎症的治疗策略之一。因此，深入研究中性粒细胞等炎症细胞p38MAPK、ERK磷酸化活性变化规律及咯利普兰和PDE4选择性中药成分的作用机制，有可能为动物常见及疑难性炎症性疾病的治疗提供新的作用靶点和有效药物。

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综上所述，利用落锤、霍普金森杆实验平台和液压介质产生的动态脉冲载荷，峰值较高。但脉宽缺少10～102μs量级。本文设计了一种半正弦波脉冲载荷发生装置，可产生压力载荷峰值达50 MPa，脉宽为10～102 μs，可应用于实验室内进行冲击动力学加载实验。

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将提纯的中性粒细胞用 PBS 调至细胞数为 2×107个/mL。设空白对照组、炎性对照组、咯利普兰组，每组2个重复。各组分别加入适量PBS，100 μL细胞悬液，咯利普兰组加入咯利普兰100 μL(反应液浓度1 μmol/L)，共置于37 ℃、5% CO2培养箱预培养30 min。除空白对照组外，炎性对照组和咯利普兰组分别加入10 nmol/L的fMLP 100 μL，以PBS补足各组反应液至1 mL，于37 ℃、5% CO2培养箱分别进行刺激培养5 min、30 min、3 h和6 h。随后将各组细胞悬液分别置于试管中，PBS洗涤2次。将细胞悬液分装到2个试管中，每个试管100 mL(细胞数为2×106个)。一份样品加入LFA-1-FITC 10 μL于室温避光反应30 min，PBS洗涤2次；另一份样品加入一抗Mac-1 10 μL于室温避光反应30 min，PBS洗涤2次，然后加入二抗 CD4-FITC 10 μL于室温避光反应30 min，PBS洗涤2次。所得细胞沉淀加500 μL PBS悬浮，流式细胞仪(BD Biosciences, USA)检测2万个细胞表面LFA-1、Mac-1表达量。

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监控系统人机交互界面系统图如图5所示，监控变频器运行参数图如图6所示。该监控系统具备了对变频器基本功能的远程控制(启/停、更改频率)，基本参数与状态的远程监测，对重要的参数形成历史趋势曲线等功能[10]。系统的突出特点在于在系统内增加了以下两部分内容：

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随着人力成本的不断上涨，国家政策淘汰落后产能，支持先进制造技术的发展多方面推动了服务于制造业的机器人的转型升级，欧美国家在此类机器人产品研发方面起步较早，部分已投入实际环境来承担相应任务.随着智能工厂的逐步全球性覆盖与大型物流系统的逐步完善，此类机器人数量将会在短时间内出现井喷式增长，中国机器人市场将会出现前所未有的机遇[2].

HPV感染与肺癌预后相关性的机制暂不明确。既往研究提示，HPV阳性肺癌组织中HPV E6、E7癌蛋白的过度表达会下调p53蛋白，导致HPV阳性肺癌患者预后更好[23]。也有研究提出，HPV感染相关恶性肿瘤的主要特征为p53退化和p16上调，导致野生型TP53[24]和p16[25]基因携带几率增大，无病生存率提高。同时，遗传学研究提示，相比未感染HPV的肿瘤细胞，HPV感染肿瘤细胞的染色体畸变率和染色体增倍体出现几率明显降低，对放疗和化疗的敏感性明显升高，预后更好[26]。未来仍需进一步深入的基础研究来阐述HPV感染与肺癌预后相关性的可能机制。

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利用语料库布置练习，通过练习让学生对知识点掌握更加透彻，这是语料库存在的重要意义。教师在使用过程中，可以对学生进行单词和多词的猜测练习，采用不同的教学形式，让学生对部分高频词进行深刻理解重点掌握。例如：

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淮山含有抗性淀粉、多糖、甾体皂苷元等化学成分，具有降血糖作用。李宝霞等[13]报道，淮山中的抗性淀粉含量高，其在体内消化缓慢，可以延缓餐后血糖浓度升高。McAnuff等[14]研究了从淮山中分离出三种甾体皂苷元(△3薯蓣皂苷元、皂苷元、偏诺皂苷元)和植物兹醇、豆兹醇、β-谷兹醇对链脲霉素诱导的糖尿病大鼠空腹血糖的影响，发现甾体皂苷元可以降低糖尿病大鼠的血糖浓度。朱明磊等[15]研究发现，淮山多糖能够增加胰岛素分泌、改善受损胰岛β细胞，从而对四氧嘧啶模型糖尿病小鼠具有明显的降血糖作用。何云[16]报道，淮山多糖能显著降低四氧嘧啶诱导的糖尿病大鼠的血糖水平，而且降糖作用随着给药剂量的增加而增加。

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2.1 两组临床效果比较 治疗2周后观察组临床效果优于对照组，且总有效率(94.64%)高于对照组(75.00%)，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

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首先，文献分类只能求基本一致和相对的一致，百分之百、绝对的一致是没有的，也做不到。分类法本身是带有局限性的，没有一个分类法能完全满足一切读者的一切需要并解决读者在文献需求上的全部问题［3］。将某个作家的文学作品全部集中于一处，这是较为理想的情况。就国家图书馆而言，图书每年一紧架、排架，即使分类号完全一致的同类书也会因编目年而打断。分类法有时只能表示出文献内容或特征的一个方面，但我们可采取互见、参照等办法弥补其在功用上的缺陷，兼顾编目机构的习惯做法。

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分析:虽然这是一个型，但仅知道f′(0)存在，不能运用洛必达法则，此时，可做变量代换，利用函数x=0在处的导数得到极限。在利用导数的定义计算极限之前，先回顾一下导数的概念，即

由于案例教学法能够有效提升”会计学基础”的教学效果，那么如何更好地将其应用于课堂教学过程中则成为了丞待解决的重要问题。因此，本文提出了几个应用要点。

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