甜瓜细菌性果斑病(Bacterial fruit blotch，简称BFB)是由西瓜食酸菌(Acidovorax citrulli,原燕麦食酸菌西瓜亚种, A. avenae subsp. citrulli)引起的主要危害西瓜、甜瓜等葫芦科作物的严重病害[1, 2]。该病害主要靠种子传播，自其发现以来已经给西瓜和甜瓜产业造成重大损失，特别在海南、内蒙古和新疆等西瓜、甜瓜主产区或制种区该病害发生尤为严重[3, 4]。近几年，瓜类细菌性果斑病有上升趋势，已经成为限制和阻碍甜瓜、西瓜产业进一步发展的主要障碍。

γ-谷氨酰转移酶(Gamma-glutamyltransferase，GGT)在原核生物和真核生物中广泛存在，是生物体内谷胱甘肽(γ-谷氨酰-半胱氨酸-甘氨酸)和谷氨酰胺代谢的相关酶之一[5]。在一些动物病原细菌中GGT是重要的致病因子。如幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)是引起人的胃炎以至引发胃癌的重要病原菌，但是H. pylori不能够直接利用胞外的谷氨酰胺和谷胱甘肽，这些物质必须通过GGT水解成为谷氨酸后才能被利用，因此GGT在H. pylori中的一个重要功能就是分解胞外的谷氨酰胺和谷胱甘肽，为细菌提供谷氨酸，为其在寄主体内长久定殖提供能源。GGT在H. pylori中的另一个重要的功能是在细菌胞外分解代谢产生NH3，NH3不仅可以作为重要的氮源被细菌利用，还能帮助细菌抵御胃部的酸性环境[6]。同样在空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)和土拉热杆菌(Francisella tularensis)中，GGT都发挥着重要的致病作用[7，8]。但是，目前尚无GGT在植物病原细菌中的致病作用报道。

屈哨兵：这是一个比较现实的问题，主要涉及教育的眼光和教育制度设计。事实上，国家也注意到了这个问题。义务教育阶段学校的校长标准有6大块60条，它其实就是做一名合格校长的基本要求，也界定了一名校长的基本努力范围。

本研究前期通过随机突变的方法在甜瓜细菌性果斑病菌A. citrulli MH21中筛选到了GGT编码基因Acggt3，并推测其与菌株MH21对甜瓜的致病作用相关。因此，本研究对A. citrulli MH21中γ-谷氨酰转移酶编码基因Acggt3序列进行了分析，设计引物对该基因进行PCR扩增和克隆，经异源表达和纯化获得了AcGGT3重组蛋白，检测了不同条件下该重组蛋白GGT活性，为进一步探索AcGGT3在A. citrulli中的致病机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、质粒和主要试剂

1.1.1 供试菌株和质粒 甜瓜细菌性果斑病菌A. citrulli MH21，大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)为北京农学院植物病理实验室保存。质粒pET22b(+)由中国农业大学植物病害生物防治实验室赠送。

1.1.2 试剂 2×Taq PCR MasterMix、质粒小量快速提取试剂盒(离心柱型)和琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒购买自北京博迈德基因技术有限公司。DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶等购自TAKARA公司。His标签蛋白纯化试剂盒购买自康为世纪生物科技有限公司。氨苄青霉素购自生工生物工程(上海)股份有限公司，使用质量浓度为50 μg/mL。

[10] 任争光,侯磊,宋治国,等.甜瓜细菌性果斑病菌致病性突变体筛选与hrcR基因的克隆[J].植物病理学报, 2009,39(5):501-506

1.2.2 PCR扩增Acggt3基因 根据信号肽预测结果去掉Acggt3基因信号肽序列，设计表达引物。上游引物P1：5’ ATGAATTCCTCGGTGCCGGACCAGCCC 3’；下游引物P2： 5’ ATGTCGACGTCGCCCATCACGATGCCCT 3’，在上下游引物5’端分别引入EcoRⅠ和SalⅠ酶切识别位点(下划线序列)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方 法

1.2.1 Acggt3基因序列分析 在A. citrulli MH21菌株的全基因组测序结果(未发表)中搜寻到γ-谷氨酰转移酶基因Acggt3的完整序列，用DNAMAN和MEGA4.0生物软件对Acggt3基因编码的氨基酸序列和NCBI基因库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)中的其他GGT相关序列进行比对分析，并构建Acggt3基因的系统进化树。利用信号肽检测软件SignalP 4.1对Acggt3编码的氨基酸序列进行信号肽预测。

纵观陈凯歌导演“以士为影”的创作历程，我们会发现，对人文精神的追求是其不变的内核。不管是早期农村题材、影像美学、寓言手法，还是后期城市题材，创作者从未停止过对人们存在的思考以及对我们所处世界的探寻。

数学实验材料往往能一物多用，像上文中的“超级七巧板”，除了用来“拼图形”之外，还可以用来研究“分类”“密铺”等。可以就同一实验材料展开不同的课题探究，是一种生成性的学习资源。相同的材料因为材质不同也会产生新的玩法。与“超级七巧板”类似，我们还常用一种透明材质的彩色图形片（见图3）。因为透明，所以学生可以很方便地进行图形的重叠比较，从而多角度地进行实验探究。我们利用“透明图形片”，曾在上海、重庆等地多次上过展示课。在上课伊始都提了一个相同的问题“从这些彩色图形片中，我们可以找到哪些数学问题？”学生提出的问题即是实验的内容。比如：

以A. citrulli MH21的基因组DNA为模板，P1和P2为引物，用2×Taq PCR MasterMix进行PCR扩增。在50 μL的反应体系中，分别加入2×Taq PCR MasterMix 25 μL，P1和P2引物各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min，35个循环：94 ℃ 40 s、59 ℃ 35 s、72 ℃ 2 min，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.0%琼脂糖凝胶(含Goldview核酸染料)电泳，BIO-RAD凝胶电泳图像分析系统分析鉴定。

1.2.3 重组质粒的构建 利用胶回收试剂盒回收Acggt3基因PCR扩增片段，经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切后连到同样酶切的质粒pET22b(+)上，连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，涂布于含氨苄青霉素的LB平板上，37 ℃培养16 h。挑取长出的菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡培养16 h，用质粒小量快速提取试剂盒进行质粒提取。提取的质粒经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切验证正确后，将对应的菌液送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。重组质粒命名为pET-GGT3，重组菌命名为BL21-pET-GGT3。

1.2.4 AcGGT3的异源表达与蛋白纯化 将新活化的重组菌BL21-pET-GGT3在37 ℃、180 r/min培养3 h(OD600约为1.0)，加入IPTG(终质量浓度20 μg/mL)，转入28 ℃恒温诱导培养6 h，取1 mL菌液做全菌SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色。大量摇培重组菌，并诱导蛋白表达，获得的菌液在4 ℃，10 000 r/min离心5 min，沉淀用0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)悬浮，冰浴超声破碎，4 ℃，10 000 r/min离心1 min，上清液上样Ni柱，用His标签蛋白纯化试剂盒获得纯化的AcGGT3蛋白。

1.2.5 GGT酶活性检测 AcGGT3酶活检测采用分光光度计测定法[7]。1 mL的酶活测定体系(10 mM的Tris-HCl缓冲液，pH 8.0)中，含5 mmol/L γ-谷氨酰对硝基苯胺，60 mmol/L双甘肽(Gly-Gly)，10 μg纯化的AcGGT3蛋白，分别在25、30、37和42 ℃反应1 h，在分光光度计410 nm处测定吸光值。同样的方法，分别在pH为6.0、7.0、8.0、9.0和10.0的Tris-HCl缓冲液中，37 ℃条件下检测AcGGT3的酶活性。GGT的酶活检测反应原理如下：

随着创新创业教育在高校的旅游管理专业中得以有效的实施，使得旅游管理专业实现了不断地发展，为当今旅游业的发展以及旅游管理型人才的打造起到了有效的促进作用。本文就是对高校的旅游管理专业创新创业教育进行分析，对其现状以及存在的问题进行研究，并提出了相应的解决策略，希望可以对高校旅游管理专业创新创业教育效果的进一步提升起到有效的帮助作用。

(3)研磨液在4 ℃条件下5 000 r·min-1转速离心30 min，取上清液，残渣用少许纯甲醇洗涤,再次离心倒出上清液，共洗涤3次，合并。

上式反应中的р-硝基苯胺在410 nm处吸光度增加，其增高速率与GGT的活性成正比。

2 结果与分析

2.1 Acggt3基因序列分析结果

甜瓜细菌性果斑病菌MH21中Acggt3基因全长1887 bp，编码628个氨基酸，信号肽预测结果显示AcGGT3蛋白具有信号肽，信号肽位置为N端1～49位氨基酸。将AcGGT3的628个氨基酸序列在NCBI数据库中用Blastp和DNAMAN5.0软件比对分析，结果显示AcGGT3同已发表的A. citrulli AAC00-1菌株(GenBank登录号：CP000512)标记为Aave_1410的γ-谷氨酰转移酶基因氨基酸序列完全一致，同A. avenae ATCC19860(CP002521)、Acidovorax sp. JS42(CP000539)、Bacillus subtilis NCIB3610(ZP_03595859)、H. pylori 26695(AE000511)和C. jejuni ATCC49943(FJ234215)的氨基酸一致性分别达到94%、79%、30%、28%和26%，说明AcGGT3氨基酸序列在Acidovorax属菌株中较为保守。基于AcGGT3氨基酸序列构建的系统进化树也显示MH21菌株同其他Acidovorax属菌株聚在同一分类单元(图1)。

系统进化树运算采用邻位法(Neighbor-joining)，括号中为序列登录号，黑色箭头标记为MH21菌株 图1 基于A. citrulli MH21的AcGGT3氨基酸序列及其他菌株相关序列构建的系统进化树 The bootstrap support values of the phylogenetic treewere from the Neighbor-joining method, and the accession No. were listed in brackets behind the strain, and the strain MH21 was labeled with black arrow Fig.1 Phylogenetic rooted tree based on sequence analysis of AcGGT3 of strains from MH21 and related bacteria

2.2 AcGGT3蛋白表达载体的构建

[12] Bahar O, Goffer T,Burdman S. Type IV pili are required for virulence, twitching motility, and biofilm formation ofAcidovorax avenae subsp. citrulli[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions, 2009, 22(8): 909-920

M：1 kb DNA ladder；1：pET-GGT3的EcoRⅠ和SalⅠ双酶切产物 图2 重组质粒pET-GGT3的双酶切验证 M：1 kb DNA ladder marker；1: The recombinant plasmid digested by EcoRⅠand SalⅠ Fig.2 Enzyme analysis of the recombinant plasmid

2.3 AcGGT3蛋白的表达结果

将重组菌BL21-pET-GGT3接入LB液体培养基中，分别在诱导前(OD600在1.0)和诱导后6 h取菌液，全菌用SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果显示(图3)，与不诱导的样品相比，诱导6 h的菌液样品里有一条显著增强的条带，大小略大于60 kDa。将诱导表达的样品用His标签蛋白纯化试剂盒纯化回收蛋白，经SDS-PAGE电泳检测，结果表明在相应位置(略大于60 kDa处)有清晰的唯一条带出现。根据信号肽预测结果，AcGGT3蛋白去掉信号肽后有579个氨基酸，和6个组氨酸(His)重组之后为585个氨基酸，经DNAMAN软件预测蛋白大小约为62 kDa。由此说明表达出的蛋白大小与预测结果也一致，证明AcGGT3蛋白表达成功。

M：蛋白分子量标准；1：未诱导的菌体蛋白；2：IPTG诱导6 h后的菌体蛋白；3：纯化后AcGGT3蛋白 图3 AcGGT3蛋白表达的SDS-PAGE分析 M：protein size marker；1：Total cellular proteins of BL21-pET-GGT3 without IPTG induced；2：IPTG induced cellular proteins；3：The purification protein of AcGGT3 Fig.3 Detection of the recombinant expression of AcGGT3 by migration on SDS-PAGE gel

2.4 温度对AcGGT3酶活性的影响

同一反应体系中，分别在25、30、37和42 ℃条件下检测AcGGT3的酶活性，结果显示(图4)，AcGGT3在37 ℃反应条件下OD410有最大的吸光值，其次是30 ℃，两个温度下并无显著差异；与30和37 ℃条件下的检测结果相比，42 ℃反应时酶活反应下降明显，到达显著水平；25 ℃反应时AcGGT3酶活性最低。以上结果说明30和37 ℃是AcGGT3酶活反应最佳温度条件。

图4 温度对AcGGT3酶活性的影响 Fig.4 The effects of temperature on the activities of AcGGT3

2.5 pH值对AcGGT3酶活性的影响

将AcGGT3蛋白放在不同pH(6.0～10.0)的反应体系中，37 ℃条件反应1 h，410 nm下检测吸光值。结果显示(图5)，随着pH值的增加，OD410的值也在增加，并在pH值为8.0时达到最大值，在pH为9.0和10.0时略微下降，但下降不显著，说明AcGGT3酶活反应适宜碱性环境。

图5 pH对AcGGT3酶活性的影响 Fig.5 The effects of pH on the activities of AcGGT3

3 讨 论

由西瓜食酸菌(A. citrulli)引起的细菌果斑病(BFB)自在美国佛罗里达州的西瓜上发现以来，已经给世界大部分西瓜、甜瓜产地造成严重的危害[2, 9]。随着基因测序技术的发展和推广，越来越多的A. citrulli菌株基因组测序的完成，A. citrulli分子致病机制研究也取得了快速的发展。研究表明III型分泌系统(T3SS)是A. citrulli主要的致病因子[10, 11]。另外果斑病菌的IV型菌毛系统、鞭毛蛋白相关编码基因以及VI型分泌系统(T6SS)突变后都影响到了菌株的致病能力[12-14]。许多植物病原菌的能量代谢途径中断会造成病原菌在寄主组织中生长缓慢或对寄主致病力下降。如组氨酸和亮氨酸生物合成基因hisA和leuB以及吡哆醛磷酸(VB6)生物合成基因pdxJ突变后，A. citrulli菌株对寄主西瓜和甜瓜的幼苗致病力均显著下降[15-17]。由此可见涉及能量和重要营养物质代谢的基因在A. citrulli中也发挥重要致病作用。

本研究的γ-谷氨酰转移酶(GGT)是维持细菌自身氧化还原平衡和能量代谢的重要酶之一，也是催化转移L-γ-谷氨酰的特异性酶[5]。它催化并转移谷胱甘肽和谷氨酰胺的γ-谷氨酰到其他氨基酸或多肽受体上，或者直接通过水解作用形成γ-谷氨酸和半胱氨酰-甘氨酸或氨。除了在H. pylori、C. jejuni和F. tularensis等动物病原细菌中报道外[6-8]，在B. subtilis中GGT还参与了B. subtilis的荚膜成分多聚γ-谷氨酸的降解[18]。本研究首次在A. citrulliMH21中克隆GGT基因(Acggt3)，在大肠杆菌中成功表达了该蛋白(AcGGT3)。利用GGT转移γ-谷氨酰基的特性，以γ-谷氨酰-р-硝基苯胺为底物，双甘肽为转移受体进行酶活反应验证，结果显示在37 ℃水浴反应过程中，反应体系的颜色(黄色)随时间不断加深，证明有р-硝基苯胺不断被释放出来，证明了AcGGT3具有完整的GGT活性。虽然AcGGT3的氨基酸序列与已发表的其他动物病原细菌和芽孢杆菌的GGT序列相似率较低，但是它们都具有共同的GGT酶活性，说明GGTs具有保守的功能域。AcGGT3的酶活反应温度在30 ℃和37 ℃最佳，pH偏好碱性环境，这也与多数细菌GGT酶活反应条件一致[19-20]。本研究说明来自植物病原细菌A. citrulli MH21中的γ-谷氨酰转移酶AcGGT3具有完整GGT活性，因此推断其应具有和动物病原细菌GGT一样的特性和致病功能。本研究结果不仅有助于了解A. citrulli的生物学功能，还将为深入探索该菌的致病机制提供线索。

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L-γ-谷氨酰-p-硝基苯胺+双甘肽谷氨酰双甘肽+p-硝基苯胺。

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本文依据办公建筑的实际尺寸与室内物品布置，对该办公室建立了物理模型(图1)，并进行了适当简化，其尺寸为Z×X×Y(长×宽×高)=8 m×6 m×3.5 m，室内有16人，16张桌子.办公室西墙有2个窗户，东墙两侧分别有1个铁质结构和木质结构的门，北墙有1个木质结构门通往另一个房间.室内采用4台机组送风，侧送侧回，送风温度为24 ℃.风口中心距地面2.5 m，风口与地面中心线垂直断面对称分布，以东北侧风口为例，该风口中心距东侧墙体2 m，距北侧墙体1.5 m.详细室内物品规格见表1.

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本文通过研究越界人和野生动物的速度与轨迹得出:越界人的行走方向一般是固定且有目的,这点在边疆表现得尤为明显。这与野生动物无目的,轨迹曲折多变有着明显的区别。在得到越界人与动物的轨迹数据后,对数据进行计算。规定矩形框的中心为运动目标的质心,(x,y)表示矩形框的中心坐标,(x1,y1)表示矩形框左下角顶点坐标,并用(x2,y2)代表矩形框右上角的顶点坐标,很显然x=x1+(x2-x1)/2,y=y1+(y2-y1)/2。目标的位移由目标的运动轨迹计算得出,然后计算目标在监控中移动的总路程(位移为目标移动的直线距离,路程为目标从一个地点到另一个地点的总长度)。

水流模型边界包括北侧的定流量边界、东西侧的隔水边界和南侧的定水头边界。定流量大小采用达西公式结合实测流场及含水层特征计算确定，区域地下水主要接受降水补给，据统计研究区内年平均降水量为783.1 mm，地形平坦，当地降水入渗系数为0.23，由此可计算出降水补给地下水的量为0.000 493 460 3 m3/d。将地表沟谷概化为一条大致南北向的排水沟。地下水最终以流入水库或民用井抽水进行排泄。

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以A. citrulliMH21的DNA为模板，利用引物P1和P2进行PCR扩增，最后得到去掉信号肽的Acggt3基因片段，大小为1 740 bp，将扩增产物酶切(EcoRⅠ和SalⅠ)后与蛋白表达载体pET22b(+)连接，转化大肠杆菌后提取质粒，酶切检测得到5 493 bp的载体片段和1 740 bp的目的片段(图2)，经过测序发现克隆序列与全基因组中Acggt3基因对应序列完全一致，说明AcGGT3蛋白表达重组质粒pET-GGT3构建成功。

质谱离子模式选择时，碱性化合物一般选择正离子模式，酸性化合物一般选择负离子模式。本实验选取的16个监测指标中新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、芦丁、金丝桃苷、木犀草苷、异绿原酸A、异绿原酸C均含有酸性官能团，负离子响应高，故选用负离子模式进行检测；木兰花碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱、小檗碱、巴马汀均含有碱性官能团，正离子响应高，故选用正离子模式进行检测；黄芪甲苷在正、负离子模式下均有响应，正离子响应比负离子响应高，因此采用正离子模式鉴别黄芪甲苷。

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为了验证无线无源转速测试方法的可靠性,采集较长时间内读取天线端电压幅值。分别采用 1 kHz 以及2 kHz脉冲激励即电机的旋转速度分别为5 r/s、10 r/s,MATLAB仿真读取天线端电压幅值随时间的变化曲线分别如图9和图10。两图中电压最低点分布均匀,通过测量最低点之间的时间间隔即可推算出电机的转速。

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提高大棚蔬菜种植技术，要在农民投资建立大棚的基础上进行。所以，为了改善农民投资条件，政府可以制定相关的农业金融政策，鼓励农民进行大棚蔬菜种植；也可以规范市场建设，引导农民采用大棚蔬菜种植模式，为农民投资建立大棚提供良好的环境。