研究发现，微血管内皮细胞(microvascular endothelial cells, MVECs)不仅完成基本的血液和组织之间的物质交换，作为一种高度特化的细胞系统，分泌各种生物活性物质，参与机体多种生物学功能[1]。在MVECs的诸多功能中，其免疫特性越来越受到关注。MVECs被激活后可以表达多种免疫因子[2]，作为一种抗原呈递细胞，可向T 细胞呈递抗原[3]，影响黏附或穿越内皮的免疫细胞功能，在机体免疫应答和炎症反应中起着非常重要的作用。

黄芪为历代中医最为常用的中药材之一，为蒙古黄芪和豆科植物膜荚黄芪的干燥根。黄芪多糖和黄芪甲苷为黄芪的主要活性成分之一。研究表明，黄芪甲苷和黄芪多糖均具有抗病毒、抗氧化和调节机体免疫的功能，并能诱导机体免疫细胞产生干扰素[5,6]。现代药理研究证实，黄芪多糖和黄芪甲苷均可通过增加内皮细胞活性，促进内皮细胞增殖而具有保护血管内皮细胞作用[7,8]。但目前在国内外尚少见黄芪甲苷和黄芪多糖对MVECs免疫功能影响的系统研究报道。就此，将通过大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(rat intestinal mucous microvascular endothelial cells, RIMVECs)体外试验，研究黄芪多糖和黄芪甲苷与MVECs免疫功能之间的关系，从而为研发抗病毒药品以及中草药的临床应用提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠IFN-γ检测试剂盒：购于深圳晶美生物工程公司(批号FRK0002)；DMEM、Hank’s、胎牛血清(FBS)、双抗、L-谷氨酰胺：购于Gibco公司；黄芪甲苷和黄芪多糖：购自中国药品生物制品检定所。

B61是美国在20世纪60年代研发的一种核航弹，首枚于1968年服役。美国先后研发了8种型号的B61，目前仍有4种在役：B61-3、B61-4、B61-7和B61-11。

1.2 细胞分组与处理

原代培养并传代至第3代的RIMVECs[9]，吸弃培养基，加入预热至37 ℃、0.25% 胰蛋白酶溶液消化3～5 min ，吹打细胞脱壁后，将得到的细胞悬液密度调整为2×105 /mL，接种于96孔板在培养箱内静置培养至汇合状态后培养基更换为DMEM维持培养基，在培养箱内继续孵育过夜，吸弃维持培养基，加入含有黄芪甲苷和黄芪多糖的DMEM维持培养液，使其终质量浓度分别为25，50 μg/mL，空白对照组细胞内同样加入DMEM维持培养基，每组试验重复5孔。分别孵育6 h、12 h 和24 h后用 ELISA 法检测IFN-γ的表达变化。

1.3 采样测定和数据处理

在机体内，IFN-γ 主要由受到免疫应答或炎症反应刺激条件下被激活的T淋巴细胞、NK 细胞和NKT 细胞产生 [10]。研究表明，中药或其有效成分可以诱导机体细胞分泌IFN-γ，七味白术散可增强NK细胞的生物活性，提高乳鼠体内IL-4和IFN-γ的表达，表明其具有免疫调节功能[11]；清肺饮能使呼吸道病毒感染患者血清中NK细胞活性升高，提高IFN-γ 和IL-2 表达水平，说明该药对NK、IFN-γ和IL-2 的表达具有正向调节作用[12]。黄芪水煎液能诱生小鼠脾细胞分泌IFN-γ；丹参素和大黄素能协同PHA刺激人单个核细胞产生IFN-γ[13]；刺五加多糖、人参多糖及皂甙和羧甲基茯苓多糖等能够诱生白细胞分泌IFN-γ。BhardwajJ[6] 等研究证明，黄芪甲苷能促进淋巴细胞增殖和IFN-γ的分泌，而黄芪多糖能刺激小鼠脾淋巴细胞增殖，促进细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌，且具有明显的量效关系。

11月中旬，中国石油测井公司有3名员工被授予“陕西省技术能手”光荣称号，这是对他们参加第九届陕西省“测井杯”职业技能大赛获得优异成绩的嘉奖，也是对测井公司员工培养长效机制的最好肯定。

经过7天朝夕相处，两人的感情更加火热，郭启明提出，让关小美和他一起到北京去。他说：“小美，我是公司里的储备人才，现在公司就已经给我分了公寓，配了雅阁小轿车，公司领导承诺，将来还要给我股份，那时，我就可以每年带着你到海滩度假，带你游历世界……”郭启明的话让关小美心潮澎湃，但她还是犹豫着摇头说：“启明，我们的事我还没来得及给我爸爸妈妈说，如果我现在丢了工作跟你到北京去，他们肯定会反对……”

1.3.2 数据处理 应用SPSS 17.0 软件计算样品和2次重复数间的平均值及标准偏差，并以平均数加减标准差(Mean ± SEM)来表示，不同试验组间单因素方差分析，当值P<0.05差异显著，用* 和# 表明，当值P<0.01差异极显著，用**和## 表明。

2 结果与分析

2.1 黄芪甲苷对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响

ELISA法检测结果显示，黄芪甲苷25 μg/mL组在6 h、12 h 和24 h 时均能诱导RIMVECs分泌IFN-γ ，与空白对照组相比12 h时表达量差异显著(P<0.05)，24 h时差异极显著(P<0.01)，而6 h时差异不显著(P>0.05)；黄芪甲苷50 μg/mL组IFN-γ表达量与空白对照组比较在6 h和12 h时差异显著(P<0.05)，在24 h时差异极显著(P<0.01)。黄芪甲苷25 μg/mL组与50 μg/mL组随着孵育时间的延长细胞上清液中IFN-γ 表达量逐渐增多。

黄芪甲苷25 μg/mL组与50 μg/mL组之间相比，随着黄芪甲苷浓度的升高IFN-γ表达量也增加，在12 h时IFN-γ的表达量差异显著(P<0.05)，而在6 h和24 h检测差异不显著(P>0.05)。

各成分组与空白对照组比较，** P<0.01，*P<0.05；试验组同一个时间点进行比较，## P<0.01，#P<0.05 图1 黄芪甲苷对肠黏膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响(n=5) Compared with control group, **P<0.01 ,*P<0.05; experiment group are compared at the same time, ## P<0.01 ,#P<0.05 Fig.1 Effect of different concentrations of astragaloside Ⅳ on the excretion of IFN-γ in MVECs

2.2 黄芪多糖对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响

[2] Bierhaus A, Chen J, Liliensiek B , et al. LPS and cytokine-Activated endothlium[J].Semin Tromb Hemost, 2000, 26(5):571-587

各成分组与空白对照组比较，** P<0.01，*P<0.05；试验组同一个时间点进行比较，## P<0.01，#P<0.05 图2 黄芪多糖对肠黏膜微血管内皮细胞分泌IFN-γ的影响(n=5) Compared with control group, **P<0.01 ,*P<0.05; experiment group are compared at the same time, ## P<0.01 ,#P<0.05 Fig.2 Effect of different concentrations of APS on the excretion of IFN-γ in MVECs

黄芪多糖25 μg/mL组与50 μg/mL组之间相比6 h 时 RIMVECs内IFN-γ的表达量差异不显著(P>0.05)，而在12 h时两组差异极显著(P<0.01)，24 h两组差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

将含有黄芪甲苷和黄芪多糖的DMEM维持培养基处理的细胞置于细胞培养箱中分别培养6 h、12 h 和24 h 后采集细胞上清液，经3 000 r/m、10 min离心后，将在无菌条件下得到的细胞上清液分装于1.0 mL的离心管中，置于-80 ℃保存备用。

MVECs 是多种生理功能的细胞，在诸多生理功能中免疫和炎症方面的功能越来越受到关注。MVECs被激活后能够分泌或表达数十种局部激素和细胞因子，包括IFN-α、IFN-β、TNF-α等。但有关黄芪甲苷和黄芪多糖能否在体外激活RIMVECs分泌IFN-γ方面尚少见报道。本试验通过黄芪甲苷和黄芪多糖作用于体外培养的RIMVECs，采用ELISA法检测了细胞上清液内IFN-γ的表达量。结果显示，25 μg/mL和50 μg/mL两种浓度的黄芪甲苷和黄芪多糖均能诱导RIMVECs分泌IFN-γ。张娟[14]等研究证明，黄芪甲苷在体外对乙肝病毒DNA复制有一定的抑制作用，且与时间、剂量成相关，推测黄芪甲苷在体外对乙肝病毒的抑制作用可能是通过阻断细胞内病毒蛋白的合成或病毒DNA复制实现的。另有报道，黄芪甲苷在体内抗病毒机制可能与机体表达或增强表达IFN-α等细胞因子含量有关[15]。刘印华[5]等报道，黄芪多糖能使小鼠脾脏淋巴细胞增殖，提高IL-2 和IFN-γ的分泌量，亦具有明显的量效关系。李丽娅[16]等证明，黄芪多糖溶液对小鼠流感病毒性肺炎有显著的治疗作用。黄芪多糖可以增加乙肝表面抗原的抗体水平，诱导CD4 +T 细胞产生IL-4，IL-2 及IFN-γ，提高CD8+T 细胞IFN-γ 的表达 [17]；也有报道，黄芪多糖的抗病毒机制与调节IFN-β1、IL-29 等基因的表达有关[18]。本研究证明，黄芪甲苷和黄芪多糖在体外可以诱导RIMVECs分泌IFN-γ，根据上述报道结合本研究结果，我们推测黄芪甲苷和黄芪多糖的抗病毒作用与RIMVECs分泌IFN-γ相关，RIMVECs也是参与机体免疫功能的主要途径之一。

利用中药及其有效成分诱导MVECs合成并分泌内源性IFN-γ，在机体重要组织器官的细胞水平加固其抗病毒屏障、发挥相应的免疫调节作用，从而提高机体的免疫功能和抗病毒功能，以此来增强机体的免疫调节作用以及预防和治疗病毒性疾病，可以解决外源性IFN-γ的种属特异性和难以通过各种屏障的问题，有可能成为未来防治免疫性和病毒性疾病的一个新思路和方法。对于黄芪甲苷和黄芪多糖诱导MVECs表达IFN-γ，从而抗病毒的机制有待进一步深入研究。

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ELISA检测结果显示，黄芪多糖25 μg/mL组在6 h、12 h、24 h时均能诱导RIMVECs表达IFN-γ ，与空白对照组相比6 h时表达量差异不显著(P> 0.05)，12 h时差异显著(P<0.05)，24 h时差异极显著(P<0.01)，随着孵育时间延长，细胞上清液中IFN-γ 表达量逐渐增多，具有明显的富集效应；黄芪多糖50 μg/mL组RIMVECs表达IFN-γ与空白对照组相比6 h和24 h时差异显著(P<0.05)，在12 h时差异极显著(P<0.01)。

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近日，云南省在“2018第四届中国PPP融资论坛”举办了PPP项目推介会。云南16州市带来了76个重点项目，总投资1643亿元，涉及交通运输、市政综合开发、生态建设和环境保护、农林水以及教育、医疗、卫生、旅游等17个公共服务领域。

1.3.1 ELISA法检测IFN-γ的表达量 按照试剂盒说明书测定(双抗夹心ELISA方法)IFN-γ的表达量，具体步骤：1)试验前30 min将所有试剂盒标准品溶液、试验样品和酶标板从-80 ℃冰箱中取出，平衡至室温(20～25 ℃)。2)加样：试验样品恢复至室温后，酶标板每孔中各加入待测样品100 μL，其中每种样品做2次重复，另取2孔做空白对照，不加任何样品，将反应板置37 ℃温箱孵育120 min。3)洗板：甩去酶标板内液体，用洗涤液充分洗涤4次，在滤纸上印干。4)加抗体：每孔加入100 μL 37 ℃预热的IFN-γ抗体工作液，对照孔不加抗体，将反应板充分混匀后置37 ℃ 60 min；5)洗板：甩去酶标板内液体，用洗涤液充分洗涤4次，在滤纸上印干。6)每孔加酶标抗体工作液，将反应板置37 ℃孵育60 min。7)洗板：甩去酶标板内液体，用洗涤液充分洗涤4次，在滤纸上印干。8)每孔加入底物液100 μL，37 ℃避光反应20 min。9)每孔加入100 μL终止液混匀；10)立即用酶标仪在450 nm处测吸光值。11)绘制标准曲线，根据标准曲线计算各孔样品中IFN-γ的浓度值。

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作业过程中难以实现雨污分流，异味问题更是十分严重。挖掘机作业时每一斗的接力摆渡，以及无意间的垃圾翻动就是一次异味释放，该工艺的环境控制是通过喷洒生物除臭剂得以实现的。

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海丝文化的阐释与表现：“一带一路”背景下泉州城市品牌建设路径研究…………………………………………………………彭志坚（1，13）

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4)将得到的图像(图4(d))与原鸡蛋轮廓二值图像(图3(c))进行“异或”运算，提取出鸡蛋的蛋黄特征，此时发现图像中除了蛋黄区域外还有鸡蛋边界的存在，如图4(e)所示。

Bin 2：有“澳大利亚勃艮第”雅号，却由西拉和慕合怀特两个“强劲”品种混酿而成，口感柔润。1960年开始生产，70年代停酿，后再复产。

随着城市化进程的加速，城市人口猛增,高楼大厦林立，带来现代都市繁荣的同时,也产生了雾霾加剧、热岛效应、城市内涝等一系列环境问题,严重影响城市环境质量和居民健康．因此，减少工业排放、加强污染治理的同时大力发展绿化,提高绿化覆盖率,改善城市环境质量,建设绿色生态城市,是城市建设和可持续发展的必然趋势．