赤霉素是植物体内的重要激素，属于四环二萜家族，自20世纪50年代被发现以来，在许多真菌、细菌和植物中共确定了100多种结构性变异体。但是其中具有生物活性的只有GA1、GA3、GA4、GA5、GA6和 GA7。在大多数植物种群中，GA1和GA4是参与调节生长和发育的最主要的成分；它们在整个植物的生长周期中都起作用, 比如种子萌发、下胚轴延伸以及成花诱导等。赤霉素信号转导途径中重要的调控因子之一是GRAS基因家族的一个亚族DELLA蛋白，拟南芥中有五种DELLA蛋白分别为GA-INSENSITIVE (GAI) ，REPRESSOR-of-ga1-3 (RGA)，RGA-LIKE1 (RGL1)，RGL2 以及 RGL3，这些DELLA蛋白都会抑制GA响应有关的生长[1,2]。DELLA蛋白可能作为一种植物生长调节的定量调节剂，通过蛋白质互作，结合多重环境信号和激素信号来调节植物生长[3-5]。研究表明，拟南芥和梨等植物中编码DELLA蛋白的基因发生改变后会影响植物的生长发育，特别是在影响植物株高方面效果明显[6,7]。

矮化密植已成为苹果栽培的主要方式，不但可以提升光能及土地的利用率，而且可以促进果树提早开花结果，高产优质，并且易于栽培管理。近年来，人们越来越关注矮化密植问题，研究人员也在不断探究果树矮化调控的分子机理[8]。研究发现，植物激素尤其是赤霉素在调控植物树体结构方面具有显著功能。植物赤霉素信号转导途径中DELLA蛋白的表达发生变化时会影响植物株高性状的表现[9,10]。‘SH6’是山西果树研究所从‘国光’和‘武乡海棠’的杂交后代中选育的矮化优良品种，对许多地区的矮化栽培都起到一定的推动作用[11,12]。

就此以苹果属植物‘国光’、‘SH6’的嫩叶作为试验材料，对DELLA蛋白家族中的RGL1b，RGL2a，RGL2b等基因进行克隆、生物信息学特性分析以及这些基因在不同苹果砧木中的基因表达分析，初步探究了这些基因对于苹果果树矮化调控的作用机理。

1 材料与方法

1.1 植物材料

于2016年以苹果属重要的砧木植物‘SH6’(Malus sp. SH6)、‘SH6’的亲本也是广泛种植的苹果品种‘国光’(Malus sp. Ralls Janet)为试验材料。基因克隆与基因表达的样品均取自山西果树所(坐标：东经112.50576°, 北纬37.349639°)，选取生长势一致，生长方向相同的一年生新梢上的叶片迅速放入液氮中，之后-80 ℃冻存。

Moreover, locals notice that, the abnormal behavior of some animals can also forecast the change of weather. Just as proverbs go:

1.2 试验方法

植物激素赤霉素(GA)是植物体内一种重要的调节生长的激素。有研究表明，GA在调控植物生长发育特别是株高方面有重要作用。例如，拟南芥中赤霉素不敏感基因GAI (GA insensitive)的N末端发生突变时，植株会出现变矮现象，对赤霉素不敏感。相反当其C末端发生突变时，植株会表现出对GA 敏感的表型，植株表现为细长表型。而调节赤霉素的过程机制又是非常复杂的，涉及到了多个代谢通路，其中DELLA蛋白作为赤霉素信号转导途径中的重要负调控因子，对植物的生长发育有显著的调控影响[14-16]。

cDNA的合成：提取好的RNA使用cDNA合成试剂盒(大连宝生物工程有限公司)反转录生成cDNA。

在赛车圈和车迷圈中，詹姆斯·亨特和尼基·劳达在1976年的“龙虎斗”已经非常知名，不过那些对赛车漠不关心的人知道这个故事大多数是通过2013年上映的电影《极速风流》。片中詹姆斯·亨特所驾驶的赛车正是迈凯伦M23D，这个1∶8比例模型展示了这款经典赛车上几乎所有细节，从发动机缸盖上的螺丝、点火线束到转向机构上的万向节，一切都应有尽有。如果不能拥有一辆真正的1976款迈凯伦F1赛车，有一个1∶8的模型也是不错的，前提是你的银行账户上有8430美元闲钱。

引物的设计与合成：根据National Center for Biotechnology Information(NCBI)公布的苹果中同源基因MdRGL1b(GenBank：DQ007886)，MdRGL2a(GenBank：DQ007883)，MdRGL2b(GenBank：DQ007884)设计所需引物，序列如表1。

选取2017年5月～2018年4月在我院接受治疗的陈挛性半面痉挛患者50例作为研究对象。根据治疗方法将其分为两组，各25例。其中，A组仅行针灸治疗，男11例，女14例，年龄55～75岁，平均年龄（65.3±4.3）岁；B组行输液加针灸治疗，男17例，女8例，年龄55～75岁，平均年龄（65.5±4.5）岁。两组在性别、年龄等一般资料方面对比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 引物序列 Tab.1 Primer sequences

引物Primer序列(5’-3’)PrimerSequence目的PurposeofPCRRGL1b-FATGAAAGGGGAGCATCAG克隆RGL1b-RTCAGTGAGCGATGACC克隆RGL2a-FATGAAGAGAGAACACTGCC克隆RGL2a-RTCACTCCGTTGAGCTC克隆RGL2b-FATGAAGAGAGATCACCGC克隆RGL2b-RTCACTCGGTTGCGCTC克隆qRGL1b-FTATCGGGGTTGAGGTTGAATqRT-PCRqRGL1b-RCAATCTTAGGCTTCATGGCCqRT-PCRqRGL2a-FCAACGTGGTGGCATGTGAAGqRT-PCRqRGL2a-RCACCCGATACCCATCTACGCqRT-PCRqRGL2b-FGAGTTTGAATTCCGAGGCTTCqRT-PCRqRGL2b-RGCTCCACAATTGTCACAATCqRT-PCR

PCR扩增体系(25 μL)：H2O, 10 μL; 2×EASY Taq PCR SuperMix, 12 μL;上游引物，1 μL;下游引物，1 μL; 模板cDNA, 1 μL。

PCR反应扩增方法与步骤：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min，35 个循环；72 ℃ 5 min；4 ℃ 保存。

利用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒(北京博迈德生物科技有限公司)对产物进行胶回收，然后连接到pEASY-T1 Cloning Vector(北京全式金生物技术有限公司)，并转化大肠杆菌感受态Trans T1，鉴定阳性克隆进行测序。

1.2.2 苹果砧木‘SH6’及‘国光’中RGL1b，RGL2a，RGL2b基因的特异性表达 运用CFX96TM实时系统(Bio-Rad)上的SYBR R Premix Ex TaqTM II(大连宝生物工程有限公司)进行Real Time-PCR。以Malus 18S rRNA基因作为参照基因,Malus 18S荧光引物的序列为：q18S-F：GTCACTACCTCCCCGTGTCA；q18S-R：GAGCCTGAGAAACGGCTACC。体系的总体积为20 μL，其中含有9 μL 2×SYBR Green qPCR Mix(大连宝生物工程有限公司)，0.1 μM特异性引物和100 ng模板cDNA。将反应混合物加热至95 ℃ 30 s，然后进行以下步骤39个循环，95 ℃ 10 s，59 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，试验3次重复。用Excel 2016软件分析表达量差异。

2 结果与分析

2.1 苹果砧木‘SH6’中RGL1b，RGL2a，RGL2b基因的克隆

依据NCBI搜索的苹果同源基因的序列设计所需引物，选取苹果砧木SH6叶片的cDNA为模板，同源克隆得出苹果砧木‘SH6’中RGL1b，RGL2a，RGL2b基因的全长CDS(Coding sequence)序列，测序结果分析得出，RGL1b的CDS序列全长是1 755 bp，编码584个氨基酸；RGL2a的CDS序列全长是1 596 bp，编码531个氨基酸；RGL2b的CDS序列全长是1 761 bp，编码586个氨基酸(图1)。

图1 RGL1b、RGL2a、RGL2b基因的扩增 Fig.1 Theamplification of RGLs genes

2.2 RGL1b，RGL2a，RGL2b结构域分析

利用NCBI Conserved Domain 工具对RGL1b，RGL2a，RGL2b基因对应的蛋白序列的结构域进行分析(图2)，发现3种RGLs蛋白都具有DELLA家族与GRAS家族保守的功能域。

图2 RGL1b,RGL2a,RGL2b蛋白的保守功能域 Fig.2 The putative conserved domains of RGL1b,RGL2a,RGL2b

2.3 RGL1b，RGL2a，RGL2b氨基酸序列的分析

利用DNAMAN7.0软件对‘SH6’的RGL1b，RGL2a，RGL2b氨基酸序列进行对比分析(图3)，‘SH6’中3种RGLs蛋白与苹果MdDELLA(AAY56749.1)蛋白具有相似性，都包含DELLA，TVHYNP，VHIID及RVER等结构域。推测RGL1b，RGL2a，RGL2b蛋白可能属于苹果DELLA蛋白家族，并且在‘SH6’果树生长发育特别是株高方面有显著作用。

1.代表DELLA结构域；2.代表TVHYNP结构域；3.代表VHIID结构域；4.代表RVER结构域 1. represents DELLA domain;2. represents TVHYNP domain;3. represents VHIID domain;4. represents RVER domain 图3 苹果砧木‘SH6’中RGL1b、RGL2a、RGL2b及苹果MdDELLA的氨基酸序列同源性分析 Fig.3 The multiple alignments of RGLs and MdDELLA

2.4 RGL1b，RGL2a，RGL2b蛋白质的信息分析

[9] Foster T, Kirk C, Jones W T, et al. Characterisation of the DELLA, subfamily in apple (Malusx domestica, Borkh.) [J]. Tree Genetics & Genomes, 2007, 3(3):187-197

利用MEME对3种RGLs蛋白保守结构域分析表明(图4)，RGL1b蛋白与RGL2b蛋白有2个保守基序完全一致，RGL1b蛋白与RGL2a蛋白有1个保守基序完全一致，3种蛋白既含有相似的结构域，但又各具特点。再利用SWISS-MODEL推测不同RGLs蛋白质的三级结构(图5)，蛋白质的三维结构差异预测出其功能上的不同。分析得出，RGL1b与RGL2a蛋白的α-螺旋和β-折叠差异较明显，而RGL2a与RGL2b的蛋白三级结构相似但存在微小差异，据此可推测这三种蛋白在生物功能上的不同相似度。

图4 RGL1b、RGL2a、RGL2b蛋白保守基序分析 Fig.4 Motif composition analysis of RGL1b, RGL2a, RGL2b

图5 RGL1b、RGL2a、RGL2b蛋白三级结构预测图 Fig.5 The prediction of RGL1b,RGL2a,RGL2b protein structures

2.5 系统进化分析

运用Neighbor-Joining 法，对克隆得到的3种‘SH6’RGLs蛋白与NCBI中其他物种DELLA蛋白：拟南芥中RGLs蛋白(GenBank: NP_197251.1, OAP14146.1, OAO92748.1)、猕猴桃中RGLs蛋白(GenBank: AHB17742.1, AHB17743.1, AHB17745.1, AHB17746.1)、苹果中RGLs蛋白(GenBank: AAY56752.1, AAY56750.1, AAY56749.1)进行进化分析。结果表明(图6)，RGL1b、RGL2b蛋白亲缘关系很近，并且与苹果MdRGL1b (AAY56752.1) 、苹果MdRGL2b ( AAY56750.1)在进化上最接近；而RGL2a则与苹果MdRGL2a (AAY56749.1) 在亲缘关系上最接近。有研究表明苹果RGLs蛋白与拟南芥DELLA蛋白在调控植物株高方面有相似作用，推测出苹果砧木‘SH6’中RGLs蛋白对于控制果树矮化生长具有非常重要作用。

图6 ‘SH6’与其他植物的RGLs蛋白系统进化树 Fig.6 Phylogenetic tree of RGLs in ‘SH6’ and other reported RGL proteins in other plants

2.6 苹果砧木‘SH6’ 和‘国光’苹果中RGL1b，RGL2a，RGL2b基因的特异性表达

[5] Locascio A, Blázquez M A, Alabadí D. Genomic analysis of DELLA protein activity [J]. Plant & Cell Physiology, 2013, 54(8):1229

RJ代表‘国光’，SH6代表‘SH6’植物 RJ represents ‘Ralls Janet’，SH6 represents ‘SH6’ 图7 苹果属植物中RGL1b，RGL2a，RGL2b基因转录水平的分析 Fig.7 Expression analysis of RGL1b, RGL2a, RGL2b transcription levels

3 讨 论

1.2.1 RGL1b，RGL2a，RGL2b的克隆 RNA提取：首先称量0.25 g冻存的材料，然后依照卢艳芬等海棠‘比利时垂枝’McRGL1a基因的克隆与分析中的方法进行总RNA的提取[13]。

本研究基于matK + (psbK-psbI)序列构建了蜘蛛抱蛋属19种92个样品的系统发育树(图1)，结果显示该属植物聚集度较好，多数表现为单系，可对物种进行区分，只有环江蜘蛛抱蛋的5个样品相对分散。线叶蜘蛛抱蛋的01～04号样品采于云南，06～10号采于广西，2个地区的样品聚为一支；采于四川和贵州的四川蜘蛛抱蛋遗传距离较近。研究结果表明生态地理环境对该属种内遗传变异的影响较小。

本研究中在苹果属植物‘SH6’中分离得到了RGLs的CDS序列全长，编码氨基酸数量，且在N-端序列都含有DELLA蛋白家族特有的结构域，这三个基因所编码的蛋白长度相近，但是却各不相同，基本可以确定是功能有联系的但互相独立的三段基因。其DELLA蛋白结构域也证实了它们具备DELLA蛋白的生理生化功能。通过蛋白差异分析，推算出RGL1b、RGL2a、RGL2b蛋白的理论等电点、分子质量。利用ProtScale分析3种RGLs蛋白质的疏水性功能，推测得出以上3种RGLs蛋白均具有亲水性。利用Psort Prediction工具对RGLs蛋白质的亚细胞定位进行了推测，其中RGL1b蛋白主要分布在细胞质和线粒体基质中；RGL2a蛋白主要分布于细胞质；RGL2b蛋白主要分布于细胞核。分析发现，上述3种蛋白的亚细胞定位存在差别，暗示它们在调控植物生长发育功能上存在时空差异，推测RGL1b与RGL2a他们可能是在细胞质中可以相互作用的两类蛋白，RGL2b则可能是在前两者在其他位置上的类似作用蛋白。利用MEME对3种RGLs蛋白保守结构域分析表明，RGL1b蛋白与RGL2b蛋白有2个保守基序完全一致，RGL1b蛋白与RGL2a蛋白有1个保守基序完全一致，3种蛋白既含有相似的结构域，但又各具特点。再利用SWISS-MODEL推测不同RGLs蛋白质的三级结构。分析得出，RGL1b与RGL2a蛋白的α-螺旋和β-折叠差异较明显，而RGL2a与RGL2b的蛋白三级结构相似但存在微小差异，结合其蛋白亚细胞定位，可推测RGL2a与RGL2b可能在功能上有一些相近，只是作用位置不同，RGL1b则可能与RGL2a有相互作用的可能，这也为后续试验开拓了思路。

人工蝉花子实体对庆大霉素所致小鼠急性肾衰竭的影响及机制研究 ……………………………………… 邵佳蔚等（19）：2648

通过上述结果，分析得出苹果砧木‘SH6’中RGL1b，RGL2a, RGL2b蛋白的三级结构相似但各具特点，预测这三种RGLs蛋白在调控植物生长方面既有功能冗余，又各自分工。进化树分析这3种RGLs蛋白与苹果、拟南芥、猕猴桃中的DELLA蛋白的亲缘关系较近，也表明了苹果砧木‘SH6’中RGLs蛋白在调控植物生长发育方面有着与拟南芥DELLA蛋白类似的功能，这也为我们进一步设计试验研究其作用机理提供可靠参照[17,18]；这3种RGLs基因在苹果砧木‘SH6’中的相对表达量明显高于在亲本‘国光’中的表达，据此推断RGLs作为DELLA蛋白在调控‘SH6’砧木及其接穗矮化中起到关键作用，也可以推测其就是引起品种间株高差异的原因之一。

目前，关于DELLA蛋白在果树矮化砧木中的研究比较有限，通过对苹果矮化砧木‘SH6’中RGLs序列的生物信息学分析和其在品种间基因表达的差异比较，有助于深入研究苹果矮化机理，促进苹果矮化密植的进一步发展。

有一天，我终于又看到了白丽筠，或者说我自认为是白丽筠的女子。我高喊了一声：“白丽筠！”那个在我前面走过去的女子回过头来，却是一副不曾相识的表情，马上回过头去，向大堂深处走去。我急忙冲上前去，想要拉她的手，这时不知从哪里冒出来一个保安，照我的下巴狠狠地打了一记钩拳，我一个趔趄，栽倒在地上。

按照经济新常态的发展要求，抓住中国-东盟共享丝路商机、扩大开放、深化经贸合作、区域经济一体化的发展机遇，结合广西少数民族的特色，打造出一支有国际化视野的创新型师资队伍。考虑创业活动的综合性对经济、管理、法律、财会、心理、技术等学科的需求，打破专业、系部的界限以学科带头人为核心组建学科交叉的“泛”专创型教研团队，优先给予资源分配、政策支持等，设立团队建设专项基金，在各级项目申报、人员培训等方面给予倾斜，培育创业、专业教研能力突出的师资团队。

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回忆第一次“出海”的情景，时任五建沙特拉比格炼油项目五建项目组经理的高耸森笑着说：“就是这个项目硬是让我咬着牙学会了开车和英语。”

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研究组术前Ⅲ～Ⅳ期患者CA19-9、CA15-3、CEA、NES水平均明显高于Ⅰ～Ⅱ期患者CA15-3、CEA、NES水平(P<0.05)，见表2。

‘SH6’是‘国光’与‘武乡海棠’杂交后选育出的优良矮化砧木。用实时荧光定量qRT-PCR方法，检测3种基因的相对表达量(图7)。结果显示，RGL1b，RGL2a，RGL2b在矮化砧木‘SH6’中的表达量均明显高于在乔化亲本‘国光’中的表达，与本研究推测的RGLs基因功能相一致，这3种RGLs基因可能在调控砧木矮化中起关键作用。

本课的授课对象为我校2017级旅游管理班学生。在本单元中，学生已经学习了旅游者证件、财物丢失和旅游者患病的处理，并初步掌握了部分旅游问题及事务的处理方法，对旅游者常遇见问题的处理有一定的解决能力，但现场实操把控能力有限，对旅游者思想分析和问题处理的把控能力较差。

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[8] 韩振海.苹果矮化密植栽培[M].北京：科学出版社，2011

利用工具Compute PI/Mw可以对目标蛋白质的等电点，分子质量做出分析，推算出RGL1b蛋白的理论等电点是4.95，相对分子质量是64 kDa；RGL2a 蛋白的理论等电点是5.38，相对分子质量是58 kDa；RGL2b 蛋白的理论等电点是5.10，相对分子质量是64 kDa。利用ProtScale分析3种RGLs蛋白质的疏水性功能，推测得出以上3种RGLs蛋白均具有亲水性。利用Psort Prediction工具可以推测蛋白质的亚细胞定位，通过分析，RGL1b蛋白主要分布于细胞质(34.8%)和线粒体基质(30.4%)；RGL2a蛋白主要分布于细胞质(60.9%)；RGL2b蛋白主要分布于细胞核(73.9%)。分析可以发现，上述3种蛋白的亚细胞定位存在一定差别，也暗示它们在调控植物生长发育功能上存在差异。

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观察组护理后ADL评分为(93.4±2.3)分;对照组护理后ADL评分为(82.4±2.1)分,观察组护理后生活能力评分高于对照组(P<0.05)。

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