猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起各年龄猪水样腹泻、呕吐和脱水为特征的一种病毒性肠道传染性病，多发于冬春寒冷季节[1]。在1971年，英国猪场育肥猪首次发生了该病，随后传至欧洲许多国家(比利时、英国、匈牙利、捷克、德国等)，之后亚洲各国也报道了该病，尤其韩国、日本和中国较为严重[2-4]。自2010年底以来，我国大部分地区规模化猪场暴发PED，免疫猪场也难以幸免，2周龄以内仔猪死亡率可高达100%，严重阻碍了我国养猪业的可持续发展[5-6]。

本文选取区位特征、邻里特征、服务特征为住宅价格的主要影响因素，因此从这3个层面来构建指标体系。其中评价区位特征的指标为主干道路、地铁站点以及商业服务中心到小区的距离；邻里特征的指标为学校、公园以及医院到小区的距离；服务特征的指标为绿化率、容积率、物业费等。

PEDV为单股正链RNA病毒，属于冠状病毒科、冠状病毒属I群[7]。PEDV 基因组至少有7个开放阅读框，编码4种结构蛋白(纤突蛋白S、小膜蛋白E、膜糖蛋白M和核衣壳蛋白N)和3种非结构蛋白(复制酶蛋白 1a和1b、ORF3 蛋白)。有研究发现，当ORF3基因的表达受到抑制后，病毒在Vero细胞上的产量明显降低[8]；当PEDV毒株适应细胞后，ORF3基因发生改变，PEDV的毒力也随之降低[9]。Park等[10]对PEDV野毒株和疫苗株的ORF3基因序列分析发现，与PEDV野毒株ORF3基因相比，疫苗株存在49个碱基的缺失，这为PEDV野毒株与疫苗株的鉴别提供了依据。

本研究通过对PEDV野毒株与疫苗株ORF3基因的缺失区域进行比较分析，在疫苗株的ORF3基因的245～293位缺失区域设计合成了1对特异性引物，建立了一种快速、敏感的检测PEDV野毒株与疫苗株的RT-PCR方法，并应用该方法针对河南新乡、开封、周口、中牟、新郑等不同猪群所采集样品进行检测，为临床实时监测PEDV在猪群中的流行状况以及免疫防控提供了有效的技术保障。

通过示范区建设，提高了劳动生产率，减轻了劳动强度，节约了农村劳动力资源。为加快农村劳动力向二三产业转移，农村向城镇化、市场化发展提供了条件，拓宽了农民的增收渠道，达到了农业增效、农民增收的目的。

1 材料与方法

1.1 病毒株、疫苗株及临床样品

猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis of swine virus，TGEV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, RV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus , PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2, PCV2)、猪博卡病毒(Porcine bocavirus, PBoV)、猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)均由郑州市猪重大疫病防控重点实验室保存；PEDV野毒株由本实验室鉴定并保存，PEDV疫苗株购自大北农动物医学研究中心。

2017年2月至2017年4月，45份采集自河南新乡、开封、周口、中牟、新郑等地猪场患有腹泻的仔猪肠道组织，取适量肠道组织研磨后-80 ℃反复冻融3次，12 000 r/min 离心5 min，取上清液于-80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

采用该PCR方法对来自河南新乡、中牟、周口、开封、新郑等地猪场发生疑似PEDV感染的45份猪小肠组织临床样品进行检测，检测结果显示PEDV阳性样品有38份，阳性率为84%，其中阳性样品中野毒感染36份，疫苗毒感染2份。本研究建立的RT-PCR检测方法可用于现地检测。

麋鹿小姐的期待是酒刀先生。她最喜欢看他开酒。骨节分明的手指握着瓶颈，恰到好处的力度，就像表演一场魔法秀。警惕而顽固的瓶塞，像守卫的小士兵。遇上不对的人，宁愿粉身碎骨，不求全身而退。可在他的手中，却格外顺从地把自己守护了一生的琼瑶佳酿，心甘情愿地呈上。仅这一幕，就足以让麋鹿小姐微醺其中。

1.3 引物设计

参考GenBank中登录的PEDV经典株CV777株(AF353511)和疫苗株CV777株(GU372744、KT323979)的ORF3基因，利用Meg Align(DNA Star)软件对PEDV野毒/疫苗株ORF3基因序列比对后(图1)，利用Primer Premier 5.0在疫苗株ORF3基因缺失区域两侧设计1对特异引物(表1)，经验证引物间无二聚体和发夹结构。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

 

表1 PEDV RT-PCR扩增引物

 

Table 1 Primers used in RT-PCR for PEDV

  

引物Primer序列(5'-3')Sequences(5'-3')引物位置/bpPrimerlocations片段大小/bp(野毒株)Productsize片段大小/bp(疫苗株)Productsize(vaccinestrain)P1GATGCGTCTTCTTTGAGG24972-24986P2GCGAGTGATGTAATGGTC25239-25253282233

  

图1 PEDV野毒/疫苗株ORF3基因位置

 

Fig.1 Location of ORF3 gene of PEDV virulent and vaccine strains

1.4 病毒核酸的制备

根据病毒DNA快速纯化试剂盒说明书，分别提取PPV、PCV2、PRV、PBoV DNA，并于-20 ℃保存，按照Trizol说明书提取PEDV、TGEV、RV总RNA，按照反转录试剂说明书合成cDNA，于-80 ℃保存备用。

1.5 PCR扩增、克隆及测序

以PEDV野毒和疫苗毒、TGEV、RV、PPV、PCV2、PBoV、PRV的核酸为模板进行PCR扩增。电泳检测结果显示，PEDV野毒和疫苗毒分别扩增出1条约为300和200 bp大小的目的条带，而TGEV、RV、PPV、PCV2、PBoV、PRV，均未扩增出目的条带，表明本研究所设计的鉴别引物扩增效果具有良好的特异性(图3)。

PCR产物经胶回收试剂盒纯化回收后，分别克隆于pMD18-T载体中，构建重组质粒pMD-PEDV，转化至E.coli DH5α感受态细胞。经PCR鉴定为阳性的重组质粒，由上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。通过紫外分光光度计测定重组质粒浓度，并计算重组质粒的拷贝数。

[2] Lin C M,Saif LJ, Marthaler D, et al.Evolution, antigenicity and pathogenicity of global porcine epidemic diarrhea virus strains[J].Virus Res, 2016, 226:20-39.

赫文斯是美国儿童图书馆服务发展历史上一位丰碑式的人物，提出并亲自实践了许多儿童图书馆服务开创性举措，引领了美国儿童图书馆事业的发展。

1.6 特异性试验

以提纯的PEDV野毒株/疫苗株、TGEV、RV、PPV、PCV2、PBoV、 PRV的基因组为模板进行PCR扩增，并设立无模板量的阴性对照，以验证该检测方法的特异性。反应体系与反应条件见1.5。

1.7 敏感性试验

分别对PEDV野毒株和疫苗株的阳性重组质粒等体积混合后进行10倍梯度稀释(10-1～10-10)，以1 μL每个稀释度质粒DNA为模板，按照已经建立的RT-PCR方法进行扩增。计算该PCR方法对PEDV野毒株和疫苗株的最低检出量，评价其敏感性。

1.8 重复性试验

对来自不同地区的3份阳性病料分别构建PEDV野毒株和疫苗株阳性重组质粒，采用已建立的RT-PCR检测方法，重复3次PCR扩增，共扩增9次(3×3)，以鉴定其重复性。

(2) 评论数：采集相关网站对周边600 m客流吸引点评论数，该数据可以在某种程度上反映周边客流吸引点的吸引力。

1.9 临床初步应用

用已建立的RT-PCR检测方法，对河南地区猪场采集的45份患有腹泻的仔猪的肠道组织样品进行检测，评价其临床实用性。

2 结果与分析

2.1 PEDV野毒株和疫苗株ORF3基因的扩增

以PEDV野毒株和PEDV疫苗株CV777细胞适应毒cDNA为模板进行PCR扩增，电泳检测结果显示，PEDV野毒株扩增片段约为300 bp，疫苗株扩增片段约为200 bp(图2)，与预期大小相符。将目的片段切胶回收、纯化、克隆到pMD18-T载体中进行测序。测序结果表明，PEDV 强毒株扩增的片段长度为282 bp，与参照株CV777(AF353511)的核苷酸同源性为100%，疫苗株扩增的片段长度为233 bp，与参照株CV777(GU372744、KT323979)的核苷酸同源性为100%，表明PCR产物是特异的。

  

M: DL 1000 DNA marker; 1: PEDV野毒株;2: PEDV疫苗株；3: 阴性对照.

 

图2 PEDV野毒株与疫苗株扩增结果

 

Fig.2 Amplification results of PEDV virulent and vaccine strains

2.2 特异性扩增

反应在25 μL体系中进行，2×Taq MasterMix 12.5 μL；模板3 μL；上下游引物各0.5 μL；ddH2O 8.5 μL。反应条件：94 ℃ 5 min；98 ℃ 10 s、55 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，35个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测。

[4] 张坤, 何启盖.猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪A群轮状病毒多重RT-PCR检测方法的建立及临床应用[J].畜牧兽医学报, 2010, 41(8): 1001-1005.

 

M: DL 1000 DNA marker; 1: PEDV野毒株扩增结果; 2: PEDV疫苗株扩增结果; 3: TGEV; 4: RV; 5: PPV; 6: PCV; 7: PBoV;8: PRV; 9:阴性对照.

图3 PEDV野毒株与疫苗株特异性扩增结果

Fig.3 Specific amplification results of PEDVvirulent and vaccine strains

2.3 敏感性试验

用紫外分光光度计对重组质粒进行浓度测定，结果显示PEDV野毒株重组质粒为148.2 ng/μL(约4.55×1010拷贝/μL)，PEDV疫苗株重组质粒为126.9 ng/μL(约3.96×1010 拷贝/μL)。10倍稀释后得到PEDV野毒株重组质粒为4.55×109～4.55×100拷贝/μL，PEDV疫苗株重组质粒为3.96×109～3.96×100拷贝/μL，分别作为模板进行PCR扩增，结果显示PEDV野毒株和疫苗株检测下限分别为455和396拷贝/μL(图4,5)，表明该方法具有良好的敏感性。

 

M:DNA markerⅠ; 1～10: PEDV野毒株质粒模板稀释10-1～10-10; 11:阴性对照.

图4 PEDV野毒株敏感性扩增结果

Fig.4 Sensitivity amplification results ofPEDV virulent strain

 

M: DNA markerⅠ;1～10: PEDV疫苗株质粒模板稀释10-1～ 10-10; 11: 阴性对照.

图5 PEDV疫苗株敏感性扩增结果

Fig.5 Sensitivity amplification results ofPEDV vaccine strain

2.4 重复性试验

对来自不同地区的3份阳性病料分别构建PEDV野毒株和疫苗株阳性重组质粒，采用已建立的PT-PCR检测方法，重复3次PCR扩增，共扩增9次(3×3)，重复检测结果完全一致，表明该方法具有良好的可重复性。

2.5 临床初步应用

Premix Ex Taq Mix、pMD-18-T载体、Proteinase K、IPTG、X-gal、DH5α感受态细胞、TRIzol、DEPC(焦磷酸二乙酯)、反转录试剂盒(Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)、胶回收试剂盒E.Z.N.A.Gel Extraction Kit和质粒提取试剂盒E.Z.N.A.Plasmid Midi Kit and Maxi Kit等均购自宝生物工程(大连)有限公司；其它常规试剂均为分析纯。

3 讨论

20世纪70年代至今，从欧洲到亚洲，都有对PED爆发和流行的报道[2-4]，自2010年底以来，PED在我国大部分养猪地区持续爆发[5-6]，尤其对哺乳仔猪的高发病率和高致死率，给养猪业造成了严重的危害，疫苗免疫仍是当前我国防控PED的重要举措，在2006年以前，我国猪场使用CV777的弱毒苗或灭活苗来预防PED，使得PED处于可防控状态；2006年到2010年间，免疫的猪场偶尔会爆发PED[11]；由于PEDV流行毒株多样，疫苗免疫效果在不同猪场差异较大[12]等诸多因素，在2010年后，PED在我国超过10个省区流行，用疫苗免疫过的猪场依然发病，给我国养猪业带来了巨大的经济损失。

2018年3月31日调查发现，小麦播后7 d 47% 异隆·丙·氯吡可湿性粉剂 3 000 g/hm2处理，小麦的株高、茎蘖数均显著高于空白对照，而与人工除草相比无显著差异(表5)；在小麦3叶1心时，47%异隆·丙·氯吡可湿性粉剂与3%甲基二磺隆油悬浮剂或15%炔草酯可湿性粉剂混用，小麦的株高、茎蘖数均显著高于空白对照，与人工除草相比无显著差异(表5)。

PEDV ORF3基因中49个碱基的缺失是区分野毒株与弱毒株的重要依据，根据这一特征，目前已经有很多实验室建立了关于PEDV野毒株和疫苗株的检测方法。李长龙等[12]建立了能够区分猪流行性腹泻病毒野毒与疫苗毒的RT-PCR方法；刘琦等[13]建立了鉴别猪流行性腹泻病毒野毒与疫苗毒的巢式PCR方法；修金生等[14]建立了基于SYBR I 实时荧光定量 PCR鉴别野毒株与弱毒疫苗株；宋予震[15]等建立了能够区分猪流行性腹泻病毒野毒与疫苗毒的RT-PCR方法。本研究建立的RT-PCR方法，通过一次试验就可有效地区分发病猪是疫苗株感染或是野毒株感染或是二者混合感染，并且用此建立的方法对TGEV、RV、PPV、PCV2、PBoV、PRV的基因组进行扩增均无特异性条带，且PEDV野毒株和疫苗株最低检测限分别为1.482×10-3pg/μL和1.269×10-3pg/μL，与刘琦等[13]建立的巢式PCR的灵敏度为0.002 pg/μL相似，较宋予震等[15]建立的鉴别野毒与疫苗毒的方法的灵敏度为20.6pg/μL高，说明此方法具有敏感、特异、快速、重复性好、费用低等优点，有利于减少免疫猪群被淘汰的可能性，降低经济损失，有望在疫病病原学方面得到广泛应用。

第一，行政隶属关系导致政策不统一。传统的行政划分形成了“区位差距”和“政策壁垒”，三地的教育主管部门制定政策，高校师资培训中心按照政策执行，属地化的政策差异导致一些工作不能协同，缺乏整体统一的规划。例如，北京市教委出台政策，拥有博士学位或者具有副教授和教授职称的高校教师，可以免修岗前培训课程，直接认定教师资格证。天津仍沿袭传统的政策，认定高校教师资格需参加岗前培训。而河北省教育厅刚调整了认定高校教师资格考试的政策，规定了岗前培训的成绩等同于教师资格认定考试成绩。三地间没有形成一个统一的认定政策。

本研究中从河南周口、中牟、新乡、开封等发生腹泻疫情的规模化猪场采集45临床样品病料，采用此RT-PCR对其进行PEDV的检测，结果检测到38份为PEDV阳性样品，阳性率为84%(38/45)，其中阳性样品中野毒感染36份，阳性率为94.74%(36/38)，疫苗毒感染2份，阳性率为5.26%(2/38)，可见河南地区普遍存在PEDV感染，且感染率较高，所以对于PEDV流行毒株的流行动态进行监测，对于预防和控制PED具有重要意义。

[6] Li W, Li H, Liu Y, et al.New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011[J].Emerg Infect Dis, 2012, 18(8): 1350-1353.

参考文献：

[1] 蔡宝祥.介绍几种新近发现的猪传染病[J].畜牧与兽医, 1982(5): 218-221.

表现之一是个案研究有余，群体研究不足。一方面对于书法大家的个案研究一直热度不减，成果丰富，如对碑学翘楚包世臣、康有为、邓石如等的研究著作颇丰。而另一方面对于清代某一地区书家群体、民间书家社团，如岭南地区书家对于兴盛的碑学运动持何种态度？他们的创作以及书学思想是否受到影响？诸如此类问题的研究成果则相形见绌。

[3] Zhao X, Li Z, Zeng X, et al.Sequence analysis of the spike gene of Porcine epidemic diarrhea virus isolated from South China during 2011—2015 [J].J Vet Sci, 2017, 18(2): 237-243.

由于桩顶荷载和地面荷载不是同时施加的，而是先后施加的。且在地面堆载施加之前，在桩顶荷载作用下的桩沉降已经完成。在地面堆载作用之后，桩的沉降是在桩顶荷载作用下的沉降之后的继续沉降，桩周土体的沉降也是桩顶荷载作用下土体沉降与地面堆载产生的新沉降之间的叠加。因此Alonso等[16]根据Randolph和Worth的模型和边界条件，在极坐标下建立了桩身摩阻力函数的线弹性表达式：

[5] Wang D, Fang L, Xiao S.Porcine epidemic diarrhea in China[J].Virus Res, 2016, 226:7-13.

一种巨大的优越感终于使我反应了过来，我轻轻地笑了一下，恰到好处地表达了我的轻蔑和不屑，头也不回地走出了古意的房间，再也没有了以往的兴致去欣赏古意那张被我激得看不清表情的脸。

[7] Master P S.The molecular biology of coronaviruses [J].Advances in Virus Research, 2006, 61: 93-202.

[8] Wang K, Lu W, Chen J F, et al.PEDV ORF3 encodes an ion channel protein and regulates virus production[J].FEBS Letters, 2012, 586: 384-391.

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