小麦(Triticum aestivum L.)是一种在世界各地广泛种植的禾本科作物，在生长发育过程中经常会受到各种病原菌的侵害。叶锈菌是一种专化性很强的活体寄生菌，其世代繁育主要依靠夏孢子侵染寄主。在不亲和组合中，寄主细胞通过过敏性反应(Hypersensitive reaction，HR)来抵抗叶锈菌的侵染，即吸器母细胞接触到寄主细胞后，寄主细胞迅速死亡，形成枯斑，病原菌因环境不适和营养缺乏而死亡，使其无法扩展[1]，最终达到抵抗病害的作用。已经证明HR反应属于典型的程序性细胞死亡(Programmed cell death, PCD)范畴，这种细胞死亡过程由寄主细胞主动控制[2]。本实验室前期研究发现，由叶锈菌侵染小麦而诱发的HR反应有典型的植物程序性细胞死亡特征[3-4]。习惯上都把植物HR归为PCD的范畴，并成为植物中研究PCD的主要形式，通常写作HR-PCD。在过去的十几年中我们着重研究了叶锈菌侵染小麦产生HR-PCD的诱发机制，试验结果显示钙[3]、细胞骨架[4]、活性氧[5]、一氧化氮[6]参与了这一过程。HR反应是小麦抵抗叶锈菌侵染的重要防卫反应，深入研究HR的发生机制，将是全面阐释小麦抵抗叶锈菌侵染分子机理的关键。

小麦Wrab家族基因分离于一种抗寒性小麦品种，最早由KanakoTsuda等[7]将其归类为第三组LEA蛋白(Late embriogenesis abundant protein, LEA)。在冷胁迫中，小麦内源ABA增加，可对低温诱导基因包括Wrab19、Wcs19、Wrab17在内的基因进行调控，从而提高小麦的抗寒性[8]。后来逐渐证明，Wrab基因参与了小麦抵抗生物胁迫及非生物胁迫，这对揭示小麦的抗逆机制具有深远意义。

前期工作中，本课题组通过构建叶锈菌侵染早期的小麦SSH文库及ESTs序列分析，筛选到了小麦受叶锈菌侵染所诱导表达的相关基因[9]，从中发现Wrab17基因受叶锈菌侵染诱发，并通过RT-qPCR结合VIGS(病毒诱导的基因沉默)分析，初步证明Wrab17基因参与小麦抵抗叶锈菌侵染过程，并在该过程中发挥正调控作用。在本课题组新近构建叶锈菌侵染早期的小麦转录组数据库中，发现Wrab18基因受叶锈菌侵染明显上调表达，表明Wrab18有可能参与了小麦与叶锈菌的互作过程。为了进一步发掘Wrab基因家族的功能，我们以Wrab18基因为研究对象，通过对小麦与叶锈菌不亲和互作体系中Wrab18基因的功能进行研究，探究其如何参与小麦对叶锈菌的抵抗过程。

1 材料与方法

1.1 试验材料

小麦品种‘洛夫林10’，简称‘L10’，小麦叶锈菌生理小种260，由本实验室长期繁育保存。小麦幼苗培养于光照培养室中，光源采用镝灯照射，光照强度为4000 Lux，光/暗周期为14 h/10 h，培养室昼/夜温度为24℃/20℃。‘L10’与260组成不亲和组合。

情况 2.2 若f3(v)=1,由于3-面只能与6+-面相邻,故最坏的情况是v关联一个3-面,两个6-面和一个5-面。由R1和R3得

1.2 L10总RNA提取

[5] 祁艳，刘刚，侯春燕，等.小麦与叶锈菌互作过程中的H2O2与HR[J].分子细胞生物学报，2008，41(4):245-254.

1.3 L10 cDNA合成及Wrab18基因克隆

根据NCBI登录的小麦Wrab18基因保守序列(登录号为AB115914)设计特异性扩增引物，引物序列见表1。

从问卷的调查数据来看，庐山西海的游客主要集中于庐山西海及周边地区，省内外的游客较少，这也是影响庐山西海客源的一个重要原因。

 

表1 扩增Wrab18基因的1对特异引物

 

Table 1 Conservative primers of Wrab18 gene

  

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')Wrab18-FTGGTGAGAGAGAAGAGCAGAGWrab18-RCAAGATTGGACGCATGTATG

关于Wrab基因家族最早的研究都是基于小麦抵抗寒冷胁迫的相关工作。植物体细胞膜结构会在寒冷胁迫中受到伤害。一些具有保护作用的还原性物质如CAT、SOD、POD等在细胞中可以通过控制自由基的产生和消除，改善膜脂过氧化产物以及膜脂肪酸组成的比例，降低脂质过氧化作用，从而提高膜保护酶的活性，保护细胞膜，提高抗寒能力[12]。孙学成等[13]证明低温胁迫前后2个冬小麦品种施钼处理ABA含量均显著增加，低温胁迫3 h时施钼处理ABA依赖型抗寒基因(Wrab15、Wrab17、Wrab18和Wrab19)mRNA表达量开始显著增加。大量研究证明，植物在抗寒诱导过程中，改变了基因转录和蛋白质合成的模式，而且这些改变与植物抗寒性密切相关[14]。

沥青等关键材料应直接从生产厂家订购，一般在设计文件中对此都有要求。沥青运到工地现场后，工地试验室要按照规范的要求严格抽检，主要检查针入度、延度及软化点，其他指标可根据施工需要选做。沥青的贮备要使用专用贮备罐，专用贮备罐安全、防水、保温、无浪费，加热方便。

以合成后的cDNA为PCR扩增模板，在0.2 mL离心管加入以下试剂：灭菌水12 μL，正反向引物F1/R1各0.5 μL，Ex Taq Mix 6 μL，模板cDNA 1 μL。PCR反应过程为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃延伸5 min。反应结束后取PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳(110 V，30 min)检测。按照SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒对目的条带进行回收。回收的 PCR产物与pGEM-T easy Vector 载体连接，构建重组质粒转化E. coli DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，将鉴定后的阳性克隆送上海生物工程技术服务有限公司测序。

1.4 Wrab18氨基酸序列跨膜区分析

利用TMpred分析软件(http://www.ch.embnet.org)对Wrab18编码的氨基酸序列进行跨膜区分析，获得分析图。

1.5 RT-qPCR检测小麦接种叶锈菌后Wrab18基因的表达模式

当小麦幼苗生长7 d左右，第1片叶片完全展开时接种叶锈菌。处理组使用自来水润湿的毛笔蘸取叶锈菌生理小种260夏孢子悬浮液，分别涂抹于‘L10’的展开叶片上，然后将幼苗黑暗保湿12～14 h，保湿后移入光照培养箱昼/夜温度为24℃/20℃继续培养。于接种后0,4,8,12,16,24,48 h取接种叶片，液氮速冻后，提取总RNA，使用TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect ReaL Time) 试剂盒合成cDNA。

基于Wrab18基因序列，在其序列非保守区设计特异性引物(见表2)，产物长度146 bp，引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，以cDNA为模板，进行RT-qPCR，在Roche LightCycler R96实时荧光定量PCR仪上进行，程序运行完成后，采用2-ΔΔCT法进行试验数据的计算。目的基因的相对表达量计算公式：(1)ΔCt (test)=Ct(target,test)-Ct(ref,test)；(2)ΔCt(calibrator)=Ct(target,calibrator)-Ct(ref,calibrator)；(3)ΔΔCt(test)=ΔCt(test)-ΔCt(calibrator)；(4)表达量的比值=2-ΔΔCT。

低中频结构接收机[6-7]的原理与零中频结构接收机类似,唯一不同点在于低中频结构接收机将射频信号下混频至低中频频点,而零中频结构接收机将射频信号下混频至零频频点。在低中频结构中,由于有用信号被搬移到较低的频点而不是被搬移到零频,因此不存在直流偏移现象。低中频结构虽然不存在直流偏移现象,但是对镜像抑制滤波提出了很高的要求。在该结构中,由于射频信号频率与本振信号频率相差不多,所以系统需要的镜像抑制滤波器应具有极高Q值。在实际应用中,极高Q值的滤波器加工相当困难,所以一般不采用这种结构。

 

表2 Wrab18基因实时定量引物

 

Table 2 RT-qRCR primers of Wrab18 gene

  

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')RTWrab18-FGCCCCTGTTTGATCTACGTRTWrab18-RAGAGTGGTTTCCCTTGTGG

1.6 Wrab18基因编码蛋白的亚细胞定位

佰草集和相宜本草等这些本土品牌的成功，从品牌层面上来看，是将“本草”这一中国特色国粹融入品牌价值中，改变了其品牌属性和基因。中国的传统文化中，发掘和运用中草药（汉方）进行美容、洗发护发已有数千年历史，这是跨国品牌难以企及的，也是跨国品牌的短板和软肋。因此，这场植物与化学科技的对决，中国本草文化与外国文化的对决，能避开本土品牌的短板，发挥其长板效应。

 

表3 Wrab18亚细胞定位载体引物

 

Table 3 Subcellular localization primers of Wrab18

  

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')Wrab18-GFP-FTATCTAGAATGGCCTCCAACCAGAACCAWrab18-GFP-RTAGGTACCGTGATCCCTAGTGATCTTCT

1.7 利用VIGS技术沉默Wrab18基因后功能分析

设计Wrab18基因特异性VIGS引物如表4，构建VIGS载体命名为BSMV：Wrab18，酶切线性化α，β，BSMV:00和BSMV:Wrab18后进行体外转录获取病毒RNA，以摩擦接种法接种到7日龄的‘L10’幼苗第1片叶上，参照牛笑南等人的方法[10]，保湿箱暗培养12～14 h后置于光照培养箱昼/夜温度为24℃/20℃培养。在第3片叶上接种叶锈菌生理小种260，在接菌后的第24，48，72，96 h取接种叶片，剪成1 cm长叶段，进行HR染色。HR染色参照祁艳等人[5]方法。对染色后样品进行荧光显微观察，统计50个单侵染点HR面积及吸器母细胞数量。

现阶段而言，许多的高职院校，误将校园文化建设理解成物质文化建设，这是十分片面的。误以为将校园内的设置完善，丰富学生的课余生活，这就是校园文化建设，但是实际上来说，这只是一种娱乐文化，这将会导致娱乐消遣之风在整个校园盛行。高校要进行文化建设，但是却没有一个明确的目标，整个局限在对于学生的管理和思想政治教育的基础层面上，没有达到整体办学、培养高素质人才的高层次目标。

 

表4 Wrab18基因VIGS片段特异性扩增引物

 

Table 4 Specific amplification VIGS primers of Wrab18

  

引物Primer引物序列(5'→3')Primersequence(5'→3')VWrab18-FTTGCGGCCGCGCACGAGGGTCGATCGATTCVWrab18-RTTGCGGCCGCCCGCCTTGTCCATCATCTGC

2 结果与分析

2.1 Wrab18基因的扩增及序列分析

提取小麦品种‘L10’总RNA，反转录为cDNA。利用所设计的1对Wrab18基因特异性扩增引物对反转录后的cDNA进行PCR扩增，PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示获得大小约510 bp的特异性DNA目的条带(图1)。测序结果表明该基因为Wrab18基因(图2)。Wrab18基因的cDNA共有852 bp，其中1～112位是5′非编码区，623～852位是3′非编码区，113～622位是开放阅读框，共510 bp，编码169个氨基酸，相对分子质量为17.528 kD，pI值为5.95，带正电荷氨基酸残基总数(Arg+Lys)为24个，带负电荷氨基酸残基总数(Asp+Glu)为25个，不稳定系数为25.29，脂肪族氨基酸残基指数为41.95，亲水性平均系数为-1.009，综上所述，该蛋白为呈弱酸性的稳定亲水性蛋白。

利用Tmpred分析软件对氨基酸序列进行跨膜区分析(图3)，横坐标表示氨基酸序列，纵坐标表示亲、疏水值，“-”表示亲水性，“+”表示疏水性，数值越高，疏水性越强。预测结果数值都小于零，如图3所示，表明Wrab18可能不含有跨膜结构，为亲水性蛋白。

甲洛洛百思不得其解，这是丁主任的一个习惯还是有所目的？如果说习惯，这只是偶尔出现，如果说有所目的，又是什么？

 

注：M为DL2000 bp DNA Marker；1为Wrab18的PCR产物

图1 Wrab18的PCR扩增

Fig.1 Wrab18 amplified by PCR

  

图2 Wrab18的全长cDNA序列和编码的氨基酸序列

 

Fig.2 Wrab18 full-length cDNA sequence and the encoded amino acid sequence

  

图3 氨基酸序列跨膜区预测

 

Fig.3 Prediction of amino acid sequence transmembrane

2.2 小麦与叶锈菌互作过程中Wrab18基因在转录水平的表达模式

小麦品种‘L10’接种叶锈菌生理小种260后0，4，8，12，16，24，48 h取叶片进行RT-qPCR，结果显示(图4)，Wrab18基因在接种后8 h的表达量有明显升高，约为0 h表达量的3.7倍，随后表达量降低，并保持相对稳定，表明Wrab18基因可能参与了小麦抵抗叶锈菌侵染的过程。

  

接种后时间/h Time

 

图4 不亲和组合中，RT-qPCR检测Wrab18表达量变化

 

Fig.4 Expression of Wrab18 was verified by RT-qPCR in incompatible

2.3 Wrab18基因编码蛋白的亚细胞定位分析

我们构建了Wrab18基因的亚细胞定位载体并注射烟草叶片，用激光共聚焦荧光显微镜进行定位观察(图5)。由图5可见，注射阴性对照的绿色荧光标记布满整个细胞(图5A)，而注射Wrab18-GFP的烟草叶片中可明显看出细胞核及细胞质呈现绿色荧光(图5D)，表明Wrab18定位在烟草细胞的细胞核及细胞质中。

  

注：A、D为激光图，B、E为透射光图，C、F分别为A和B、D和E的叠加图。

 

图5 注射Wrab18-GFP烟草叶片的Confocal观察

 

Fig.5 Location of Wrab18-GFP in tobacco leaves observedby confocal laser scanning microscope

2.4 沉默Wrab18基因后对HR及吸器母细胞的影响

在沉默植株的第3片叶上接种不亲和叶锈菌生理小种260，在接种后24，48，72，96 h分别取样并进行Rohringer荧光染色，以接种BSMV:00的叶片作为对照，通过荧光显微镜进行观察。

应用pSuper1300载体构建Wrab18的亚细胞定位载体，根据载体图谱设计基因引物如表3。将构建好的载体转入农杆菌EHA105中，注射烟草叶片进行瞬时表达，48 h后剪下注射的烟草叶片，撕取下表皮在Confocal下观察目的蛋白的亚细胞定位情况。

“有吸收力的心理”是蒙台梭利发现的又一个“童年的秘密”。蒙台梭利认为一个人在他的童年时期所获得和吸收的一切会一直保持到成年时期，甚至会影响其一生。儿童天生具有一种感受能力，他能感受到外部世界的各种信息，并将这些信息转化为自己心理的一部分。同时，幼儿在3岁之前的这个时期，他们只具有吸收的能力，但不具有接受的能力，不需要任何形式的直接教学。所以，一个适宜儿童成长的家庭环境，一个能够引起儿童专注地吸收的外部环境会更能保证儿童健康心理的发展，而生理发展又是和心理发展密不可分的。正如蒙台梭利所说，“富有刺激的一种心理体验能够加快新陈代谢的速度，并因而促进一个人的身体健康。”③

[4] 刘刚，党磊，王冬梅.激发子诱发小麦叶肉细胞原生质体微管骨架排列格局与[Ca2+]cyt的变化[J].分子细胞生物学报，2007，40(4): 217-225.

  

注：A、B分别为对照组菌丝发育及HR；C、D分别为沉默

 

Wrab18基因的菌丝发育及HR

 

图6 沉默Wrab18基因叶片接种叶锈菌260后96 h的Rohringer荧光染色观察(400×)

 

Fig.6 The Rohringer fluorescence staining of silence Wrab18leaf inoculated by Puccinia triticina 260 after 96 h

  

接菌后时间/h Time

  

接菌后时间/h Time

 

注：A为HR面积统计；B为HMC数目

 

图7 50个单侵染点的HR面积及HMC数量统计

 

Fig.7 Statistic analysis of HR area and HMC number of 50 single infection

3 讨论

小麦叶锈病作为影响小麦产量的主要病害之一，发掘抗病基因，培育抗病品种具有深远的意义。小麦Wrab家族基因作为一类能够响应ABA诱导抵御寒冷胁迫的一类重要基因，在小麦响应胁迫反应中具有重要作用[11]。

根据PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit说明合成cDNA。反应结束后置于-20℃冰箱备用。

30多年下来，李建明家里和单位办公室，到处堆满毛主席像章、塑像等有关红色收藏品。一个纸箱子里可装几千枚像章，小瓷像则要衬纸以防磕碰，至于那次花2000元买下的两汽车塑像，因为太占地方，后来一样留下一个，其余全部处理掉了。

碳氧单键（C-O）的吸收峰在1300-1100cm-1，波罗的海琥珀的吸收峰为1260cm-1和1164cm-1双吸收峰，并且1164cm-1吸收峰强于1260cm-1，1164cm-1为波罗的海的特有吸收峰，可以作为波罗的海琥珀产地鉴定的重要依据。而多米尼加琥珀在此区域内存在多个吸收峰并在1240cm-1附近吸收最高，峰形独立清晰；墨西哥琥珀吸收强度较弱，峰位相对于多米尼加琥珀吸收峰较平缓；而缅甸琥珀在此区域内也是呈现“山”字吸收峰[8]，在1150cm-1附近处吸收峰为缅甸琥珀特征吸收峰。多米尼加和墨西哥琥珀缺失1164cm-1吸收峰。这是产生天然树脂的不同树种决定的。

杨高山等[15]证明Wrab17基因参与了小麦抵抗叶锈菌过程。利用VIGS技术沉默小麦Wrab18基因，发现在不亲和组合接种后期，由于叶锈菌侵染诱发的小麦细胞HR面积增大，叶锈菌吸器母细胞数量增多，表明Wrab18基因在小麦抵抗叶锈菌的侵染中起到正调控作用。张林生等[16]报道了关于Wrab18基因的相关研究工作。他们通过将Wrab18基因导入大肠杆菌，对转化后的大肠杆菌进行耐受性试验，发现转化后的大肠杆菌对于温度、干旱、盐等非生物胁迫的耐受性有所加强，证明Wrab18基因可能在这些胁迫反应中发挥了作用。同时，Wrab18蛋白还具有保护LDH酶的作用，使植物体在胁迫反应中能够维持正常的生理代谢。LDH酶是糖酵解途径中的重要酶，能够促进乳酸与丙酮酸之间的转化。以上结果表明了Wrab基因在小麦抵抗生物及非生物胁迫中均发挥了作用。

在植物响应逆境胁迫的过程中，除去相关基因的作用外，基础防卫反应也起到重要作用，而这涉及到整个植物体各部位的联动，包括细胞信号，植物激素，以及各类酶的作用，而Wrab基因家族作为响应ABA诱导的一类基因是否在其发挥作用的同时与更多的信号间存在有联系依旧未知，这方面研究将有利于更深入了解植物响应逆境胁迫的机制。在接下来的研究中，将以小麦转基因植株(RNAi阳性植株)为材料，进一步明确Wrab18基因的功能，并通过对在诱发HR过程中参与的相关基因、转录因子等分析，明确Wrab18基因在小麦抗叶锈调控网络中的作用机制。

(1)由于冷凝式热水器内部存在系统热容会导致热水器内管路对热量有蓄热的作用，热量传递给水在时间上发生延迟，因此热水温升与加热时间呈非线性增长趋势，热水器系统热量分布可由 表示，热水温升与加热时间关系数学模型由表示。热水器加热时间的影响因素包括系统热容、进水流量以及进气流量。

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[3] Liu G, Hou C Y, Wang D M. Calcium influx is required for the initiation of the hypersensitive response of Triticum aestivum to Puccinia recondita f.sp. tritici[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 2010, 74(3): 267-273.

Rohringer荧光染色结果表明(见图6，图7)，沉默Wrab18基因，在接种后24，48，72 h由于叶锈菌侵染诱发的小麦细胞HR面积与对照组相比无明显变化，叶锈菌吸器母细胞数量变化也不明显；而在接种后96 h， HR面积相比对照组有明显扩大，叶锈菌吸器母细胞数量增多，这可能是由于Wrab18基因沉默后使得小麦对叶锈菌生理小种260的抗性降低所导致的。

取生长7日龄的小麦‘L10’叶片约100 mg，放入经氯仿预处理的1.5 mL离心管中，加入钢珠低温研磨，利用UNlQ-10柱式Trizol总RNA抽提试剂盒提取总RNA。提取后置于-80℃冰箱备用。

[6] 陈阳辉，刘静，陈琰，等.IWF诱导小麦悬浮细胞产生NO及其与Ca2+的关系[J].中国农业科学，2011，44(12)：2601-2607.

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