草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus，GCRV) 是一种导致水产动物出血性疾病的高致病性病原，属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)水产呼肠孤病毒属(Aquareovirus)[1]。GCRV因其高致病率、高死亡率且传播范围广等特性，严重影响了我国水产养殖业的发展[2-3]。因而建立简便、快速的检测方法尤显重要，以期达到早发现、早预防的目的。

随着对GCRV流行病学研究的深入，各种检测技术也不断建立并完善，如：杨广智等[4]建立的葡萄球菌A蛋白协同凝集试验(SPA-CoA)；闵淑琴等[5]建立的不连续对流免疫电泳法(DCIE)和酶联免疫吸附试验(ELISA)；邵健忠等[6]建立的斑点免疫印迹检测法；方勤[7]等建立的细胞培养分离技术等。近年来，PCR(Polymerase chain reaction, PCR)技术由于其较高的灵敏度、准确度和特异性，从而得到了广泛的应用。王铁辉等[8]建立了RT-PCR体系用以检测GCRV；Zhang等[9]完善了GCRV的RT-PCR检测体系；周勇等[10]建立了GCRV的TaqMan real-time PCR定量检测方法。然而上述方法大多操作复杂且耗时较长，需要专门的实验人员及仪器，不适合应用于现场快速检测。

目前，一种新型的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)悄然兴起。它是一种在恒温条件下通过BstDNA聚合酶实现核酸快速扩增的方法[11]，在检测耗时、仪器成本等方面较PCR技术更加优越，并已开始应用于细菌及病毒的诊断，如：番茄溃疡病菌(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis, Cmm)[12]，鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus, SVCV)[13]，神经坏死病毒(Nervous necrosis virus，NNV)[14-15], 鲤疱疹病毒 (Cyprinid herpesvirus 2, CyHV-2)[16]等。Yang等[17]研究表明RT-LAMP较RT-PCR操作更为简便，反应耗时更短，但对引物设计要求更高，且易出现假阳性现象。基于LAMP扩增反应原理，通过设计羟基荧光素(Fluorescein amidite, FAM)标记的探针与生物素(Biotin, BIO)标记的LAMP扩增产物特异性杂交，可以在5 min内于横向流动试纸条(Lateral flow dipstick, LFD)上完成显色和结果判断过程，更为适用于现场实地检测。LAMP-LFD已成功应用于桃拉综合征病毒(Taura syndrome virus, TSV)[18], 虾黄头病毒(Shrimp yellow head virus, YHV)[19]，虾肝胰腺细小病毒和斑节对虾核型多角体病毒[20-21], 白斑综合征病毒[22]，传染性脾肾坏死病毒[23]的检测，但对于GVRV的LAMP-LFD检测尚未见报。

因此，本研究根据草鱼呼肠孤病毒S8片段的保守区设计3对引物(FIP/BIP, F3/B3, LF/LB)和1条FAM标记探针，建立了一种准确、快速的LAMP-LFD检测方法，同时与qPCR法进行比较，为GCRV的快速检出和即时诊断提供更加可靠、便捷的技术手段。

1 材料与方法

1.1 试剂

鱼呼肠孤病毒S8片段的重组质粒、鲤疱疹病毒3型胸苷激酶(Thymidine kinase, K)基因的重组质粒，以及鲤春病毒血症病毒糖蛋白(Glycoprotein, G)基因的重组质粒由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，制成甘油菌，-20 ℃保存。

1.黄油室温软化后用刮刀搅拌顺滑。2.水和砂糖加热至103度，蛋液打至鱼眼泡形状。3.边快速打发蛋液边缓缓倒入糖水。4.持续打发至蛋液恢复常温后，一次性将蛋液倒入黄油中打均匀。5.分次将黄油加入板栗蓉中混匀即可。

1.2 引物的设计

以含有GCRV、SVCV和CyHV-3特异性基因的重组质粒为模板，按1.3优化的反应体系分别进行LAMP、qPCR扩增，进行特异性检测。以去离子水为模板作为阴性对照反应。每个反应设置3组平行。

本研究以草鱼呼肠孤病毒的S8片段为检测靶标建立的LAMP-LFD方法可特异性地检出GCRV，LAMP-LFD虽然在灵敏度方面较qPCR法稍低，但反应时间较qPCR法短，主要该方法操作简便摒弃了对精密仪器的依赖，仅需配备一个恒温水浴锅即可完成核酸扩增反应过程，反应产物通过LFD可肉眼直接判断结果，适宜应用于GCRV的现场检测。

 

表1 LAMP-LFD引物和探针序列

 

Table 1 Primers and DNA probe sequences for LAMP-LFD

  

引物Primer位置Location序列(5'-3')Sequence(5'-3')目的PurposeGCRV-F399-116TGCGCGTATGTGTGGTACLAMP,qPCRGCRV-B3302-319GACAGACGAGGCAGAGCTLAMP,qPCRGCRV-FIP167-188/127-145(BIO)-CGTTTGGCAGATTGCGTTAGCA-CTACCCTTCGACGCCTCTALAMPGCRV-BIP239-260/281-300GACTAACGCTTCCTCTTCCGCC-CAAAACTGGTCGTAGCCGAGLAMPGCRV-LF146-164AGTAGCAGTCAGGCGTTGGLAMPGCRV-LB261-280TCCACCTCCAGTACTGCTTCLAMPGCRV-HP201-220FAM-GTCTGCACTGCAACTGTTTCLAMP

图1 LAMP-LFD引物设计示意图

Fig.1 Diagram for primers and DNA probelocations for LAMP-LFD

1.3 LAMP反应

25 μL反应体系：20 mmol/LTris-HCl (pH 7.5)，10 mmol/L (NH4)2SO4，50 mmol/L KCl，8 mmol/L MgSO4，0.1% Tween-20，1.4 mmol/L dNTP, 0.2 μmol/L F3/B3, 1.6 μmol/L FIP/BIP (或BIO-FIP/BIP)，0.4 μmol/L LF/LB，320 U/mL Bst DNA聚合酶，38.8 μg/L重组质粒，1 mol/L Betaine。分别在59，61，63，65和67 ℃下扩增1 h，根据扩增效果确定最适反应温度。在最适温度下分别扩增20，30，40，50，60 min，根据扩增效果确定最适反应时间，以去离子水为模板作为阴性对照。

1.4 实时荧光定量PCR(qPCR) 反应

实时荧光定量PCR反应在StepOne Plus实时荧光定量PCR仪(ABI)上进行，为了达到与LAMP反应进行比较的目的，采用LAMP体系的F3/B3引物进行qPCR扩增。通过StepOne软件2.3版进行数据收集和处理。

25 μL反应体系：12.5 μL Bestar SybrGreen qPCR Mastermix，0.5 μL GCRV-F3(10 μmol/L)，0.5 μL GCRV-B3(10 μmol/L，1 μL模板，10.5 μL ddH2O。反应条件：预变性95 ℃ 2 min；qPCR反应: 95 ℃变性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，28个循环，于每个延伸反应后收集荧光信号。融解曲线：95 ℃反应1 min，55 ℃反应1 min，之后由55 ℃以10 s/循环，0.5 ℃/循环升温至98 ℃。

1.5 LAMP产物的LFD检测

横向流动试纸条(LFD)检测原理见图2，BIO标记的LAMP产物与FAM标记的HP探针特异性杂交后形成复合物，通过横向层析与标记BIO抗体的检测线结合上，使得检测线显示红色呈阳性；未杂交的FAM标记的探针与胶体金标记的抗FAM抗体形成不含BIO的复合物穿过检测线而结合在质控线上。

于LAMP反应产物中加入20 pmol/L FAM-GCRV-HP，63 ℃杂交5 min。取5 μL杂交液加到80 μL 缓冲液中，混匀，将LFD垂直置入缓冲液中，静置3 min左右判读结果。

  

图2 横向流动试纸条(LFD)检测原理图

 

Fig.2 Schematic diagram of lateral flow dipstick (LFD)

1.6 特异性评价

根据NCBI Genebank的草鱼呼肠孤病毒S8 (登录号：HQ231204)片段，通过序列比对后，选择高保守部分,通过Primer explorer V5 (http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html) 在线软件设计3对特异性LAMP引物(外引物GCRV-F3和GCRV-B3、内引物GCRV-FIP和GCRV-BIP、环引物GCRV-LF和GCRV-LB)用于LAMP反应；同时设计一条可与LAMP产物进行特异性杂交的DNA探针GCRV-HP(见表1, 图1)，用于LFD检测。其中，内引物GCRV-FIP 的5′端进行BIO标记，探针GCRV-HP的5′端进行FAM标记(表1)，上述引物和探针由生工生物(上海)股份有限公司合成。另外，GCRV-F3和GCRV-B3同时作为荧光定量PCR扩增的上游引物及下游引物(表1)。

1.7 灵敏度评价

将GCRV质粒模板按10倍梯度稀释，选取9.7×10-1，9.7×10-2，9.7×10-3，9.7×10-4，9.7×10-5，9.7×10-6，9.7×10-7 ng/μL作为灵敏度检测模板。按1.3中的反应体系对LAMP产物进行LFD检测。按1.4体系于荧光定量PCR仪中进行real-time qPCR试验。以去离子水为模板作为阴性对照反应。每个反应设置3组平行。

作为全球领先的汽车座椅及电子电气系统供应商，李尔在2018年取得了不俗的业绩。尽管目前宏观经济发展出现了一些不确定性，但李尔还是表现出了强大的发展态势，一如既往持续专注于创新、人才和运营。在展望李尔2019年发展之际，本刊记者采访到了来自李尔公司亚太区座椅副总裁兼中国区总经理昌宏顺先生和李尔公司亚太区电子电气副总裁兼东盟国总经理艾汉缘（Hans-Jörg Ehlers）先生，听听他们对目前汽车市场发展的理解，汽车座椅和电子电气方面的最新技术以及李尔对未来发展所怀有的坚定信心和美好期待。

1.8 临床样品检测

将人工感染GCRV病毒的鱼置于解剖盘上，取其内脏组织，利用病毒基因组提取试剂盒提取病毒RNA，并进行反转录，将所得cDNA溶于30 μL去离子水，-20 ℃保存备用。通过LAMP-LFD和qPCR两种方法检测GCRV感染情况。

2 结果与分析

2.1 LAMP扩增条件的确定

在59，61，63，65和67 ℃下扩增1 h，琼脂糖凝胶电泳结果显示63 ℃扩增条带较为清晰(图3A)，因此确定63 ℃为LAMP最佳反应温度；在63 ℃分别扩增20，30，40，50，60 min，琼脂糖凝胶电泳结果显示，反应40 min扩增效果与50，60 min相比更为清晰(图3B)，因此确定40 min为最佳反应时间。

对0.97 ng/μL浓度的质粒模板进行10倍浓度梯度稀释，并以之为模板进行LAMP及qPCR扩增。结果表明：LAMP-LFD最低检测限为970 fg，qPCR最低检测限为97fg。

 

A.LAMP反应温度优化.M：DNA ladder; 0: 对照(以去离子水作为模板); 1～ 5: 以GCRV重组质粒为模板分别在59, 61, 63, 65, 67 ℃进行反应.

 

B.LAMP反应时间优化.M：DNA ladder; 0: 对照(以去离子水作为模板); 1～5: 模板浓度为9.7×10-4 ng/μL 条件下，反应时间分别为20, 30, 40, 50,60 min.

图3 LAMP反应参数优化

Fig.3 Optimization of LAMP reaction parameters

2.2 LAMP-LFD与qPCR特异性试验

在同一条件下，以含有GCRV、SVCV和CyHv-3特异性基因的重组质粒为模板，分别进行LAMP，qPCR扩增。结果显示：以GCRV为模板的LAMP与qPCR反应均呈阳性，以SVCV，CyHV-3为模板的反应为阴性，以去离子水为模板的反应也呈阴性(图4)，表明引物特异性良好。

 

  

A.LAMP-LFD检测;B.qPCR检测

 

0: 对照(以去离子水作为模板); 1: GCRV；2：CyHV-3；3：SVCV.

 

图4 LAMP-LFD与PCR特异性检测

 

Fig.4 Specificity of LAMP-LFD, qPCR for GCRV detection

2.3 灵敏度评价

宝宝的性格就是在一个个生活事件中形成的，其中疾病作为宝宝生活事件中举足轻重的大事，对宝宝性格的影响很大。有病的人未必就是性格消极，没病的人未必就是性格积极，关键是他人和自己对待疾病的态度，可以形成一个人的基本观念和行为方式。

 

  

A.LAMP-LFD检测;B.qPCR检测

0: 对照(以去离子水作为模板); 1～6:分别为以9.7×10-1，9.7×10-2，9.7×10-3，9.7×10-4，9.7×10-5，9.7×10-6，9.7×10-7 ng/μL浓度为模板进行反应检测.

图5 LAMP-LFD、qPCR灵敏度

Fig.5 Sensitivity of LAMP-LFD, qPCR for GCRV detection

2.4 人工感染样品检测

[9] Zhang L L, Luo Q, Fang Q, et al.An improved RT-PCR assay for rapid and sensitive detection of grass carp reovirus.[J].Journal of Virological Methods,2010,169(1):28-33.

3 结论与讨论

草鱼呼肠孤病毒是水生呼肠孤病毒属中致病力最强的毒株，建立快速准确的GCRV诊断方法，对于鱼类疾病的防控，减少水产养殖的经济损失具有重要意义。

Zhang等[9]建立的GCRV的RT-PCR方法最低检测GCRV含量为102 copies/μL。周勇等[10]建立的TaqMan real-time PCR体系检测限为10 copies/μL。LAMP检测方法是一种快速灵敏的检测手段，其反应产物的末端检测通常利用浊度仪，琼脂糖凝胶电泳法和荧光染料法。张金凤等[24]建立了针对GCRV的检测的LAMP检测体系，并利用添加SYBR Green I荧光染料辅助判定结果，其最低检测限为33 pg。但由于电泳及荧光染料法主要利用了染料能够嵌入双链DNA分子内而引起颜色变化的特性，且添加染料需开盖操作，易导致假阳性判读结果。

本研究建立的LAMP-LFD方法通过添加可与LAMP产物特异性结合的探针，很大程度上减少了非特异性扩增造成的假阳性现象，使结果更加准确可信。Kiatpathomchai等[22]建立的LAMP-LFD检测体系反应时间需70 min。Khunthong等[19]应用LAMP-LFD技术对YHV的检测限可达0.1 pg，检测时间需55 min。Ding等[23]建立的LAMP-LFD 技术对ISKNV 检测限为10 copies。本研究建立的反应体系检测限为970 fg，检测时间需50 min，较之前研究所得检测时间更短。

ZHAI Xiao, WANG Yi-ran, ZHU Ming-xiang, WANG Qi-jin

参考文献：

一幅幅记载历程的照片、一件件承载历史的实物，一幕幕感人至深的场景、一个个催人泪下的故事，生动展现了不同时期无数优秀共产党员带领人民大众争取民族独立、人民解放以及进行改革开放的伟大历史进程。担当道义的李大钊、革命伉俪陈觉和赵云霄，县委书记的榜样焦裕禄、劳动模范时传祥、决堤岸上的生死牌、舍己救人的人民子弟兵孟祥斌等等，无不生动演绎着党的大义担当和为民情怀。

辐射环境监测工作，在辐射环境影响评价的整个过程当中起到了至关重要的作用。现阶段，随着社会的不断发展，环境污染方面的问题也日益突出，在这种情况下，我们就更要充分的重视起环境监测方面的工作。为了辐射监测能够更好的应用于辐射环境影响评价当中，在接下来的时间里，我们应做好以下几个方面的工作：

[1] 方勤, 朱作言.水生呼肠孤病毒研究进展[J].中国病毒学, 2003,18(1):82-86.

[2] Gui J F, Zhu Z Y.Molecular basis and genetic improvement of economically important traits in aquaculture animals[J].Chinese Science Bulletin,2012,57(15):1751-1760.

[3] 杨映, 于辉, 古勇明.草鱼呼肠孤病毒研究进展[J].广东农业科学, 2015,42(15):92-97.

[4] 杨广智, 罗毅志, 叶雪平.葡萄球菌A蛋白协同凝集试验快速检测草鱼出血病病毒[J].水产学报, 1991,15(1):27-33.

[5] 闵淑琴, 洪世雯, 蔡宜叔.鱼呼肠孤病毒 (FRV) 抗血清的制备及其应用[J].水产学报, 1986,10(4):383-387.

Bst 2.0 WarmStartTM DNA聚合酶(Art.No.M0538)购自New England Biolabs(NEB)；SYBR Green I(Art.No.SR4110)荧光染料购自北京索莱宝公司；Betaine(Art.No.B0300-1VL)购自Sigma公司；dNTP、DNA Marker购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司，横向流动试纸条(Lateral flow dipstick, LFD)购自Milenia Biotec公司。

[6] 邵健忠, 项黎新.应用Dot-ELISA技术检测草鱼出血病病毒的研究[J].水产学报, 1996, 20(1):6-12.

[7] 方勤, 肖调义, 李旅,等.四株草鱼呼肠孤病毒毒株的细胞感染特性比较研究[J].中国病毒学, 2002,17(2):182-184.

12. 6σ管理模式是系统地解决问题的方法和工具，主要包括一个流程改进模式，即DMAIC模式，其中M表示________

[8] 王铁辉, 李军.用逆转录聚合酶链反应检测草鱼出血病病毒的研究[J].海洋与湖沼, 1997, 28(1):1-6.

利用所建立的LAMP-LFD法和qPCR方法对人工感染样品进行检测，同时设阳性和阴性对照，阴性对照为未进行感染的草鱼内脏组织所提取的RNA进行反转录后所得cDNA，采用LAMP与qPCR方法进行检测，2种方法检测符合率达100%。

[10] 周勇, 曾令兵, 范玉顶,等.草鱼呼肠孤病毒 Man real-time PCR检测方法的建立[J].水产学报,2011,35(5):774-779.

[11] Notomi T, Okayama H, Masubuchi H, et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA[J].Nucleic Acids Research,2000,28(12):E63.

[12] 赵赛,李建嫄,周颖,等.番茄溃疡病菌LAMP快速检测方法的建立[J].河北农业大学学报,2015,38(3):19-23.

[13] Shivappa R B, Savan R, Kono T, et al.Detection of spring viraemia of carp virus (SVCV) by loop-mediated isothermal amplification (LAMP) in koi carp, Cyprinus carpio L.[J].Journal of Fish Diseases,2008,31(4):249-258.

针对谐振式光学陀螺信号检测系统对锁相放大器中低通滤波器提出的40 MHz采样率、低截止频率及其调节的便捷性和阶数可调的要求,通过简化算法,设计了惯性低通数字滤波器可满足以上需求。

[14] Xu H D, Feng J, Guo Z X, et al.Detection of red-spotted grouper nervous necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification[J].Journal of Virological Methods, 2010, 163(1):123-128.

[15] Hwang J, Suh S S, Park M, et al.Detection of coat protein gene of nervous necrosis virus using loop-mediated isothermal amplification[J].Asian Pacific Journal of Tropical Medicine,2016,9(3):235-240.

[16] He J, Shi X, Yu L, et al.Development and evaluation of a loop-mediated isothermal amplification assay for diagnosis of Cyprinid herpesvirus 2[J].Journal of Virological Methods,2013,194(1-2):206-210.

加拿大钾肥公司副总裁、加钾国际上海代表处董事总经理、首席代表杜东海博士，广东天禾农资股份有限公司副总经理罗旋彬，珠海市供销社副主任袁绍勇等嘉宾参会，近百名水稻种植大户共同见证了2018年天禾加钾平衡施肥项目所展示的对比效果。

[17] Yang S, Wang K Y, Yang Z.Comparison of reverse-transcription loop-mediated isothermal amplification and reverse-transcription polymerase chain reaction for grass carp reovirus[J].Acta Veterinaria Brno,2015,84(3):215-223.

[18] Kiatpathomchai W, Jaroenram W, Arunrut N, et al.Shrimp Taura syndrome virus detection by reverse transcription loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Journal of Virological Methods,2008,153(2):214-217.

在学府街公铁立交桥施工中，他结合学府街的地理位置和地质特点，组织技术小组开展技术攻关，确保了学府街的工期节点和创效目标。学府路框构中桥原设计方案是顶进施工，计划施工工期为24个月。由于该道路处于佳木斯市繁华地带,是佳木斯市跨越铁路南北的主要交通干道，不允许封闭道路时间过长，最终通过既有线双线外绕的办法空出框构中桥位置改顶进施工为明挖现浇施工，施工过程中，项目部又对施工方案进行进一步优化，减少了部分横撑、格构柱、防护桩数量，通过以上措施办法，缩短了施工工期，降低了施工成本。将通江街2m-12m框构中桥变更为2个1m-12m框构中桥，工期得到保证，效益更加可观。

上一代农民工具有良好的传统美德，任劳任怨、勤勤恳恳，对环境不挑剔、对待遇不要求，而如今的新生代农民随着其受教育程度的提高，其专业知识和能力也不断增强，自我意识和自我效能感不断提升，他们对薪资待遇、工作环境和工作条件,以及工作中的人文关怀等都有自己的要求与预期,如果他们被录用，就对用工单位寄予期望，对单位有较强的认同感和归属感，如果不合适，他们也会毫不犹豫地选择离开，重新寻找自己理想中的单位和组织。

[19] Khunthong S, Jaroenram W, Arunrut N, et al.Rapid and sensitive detection of shrimp yellow head virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Journal of Virological Methods,2013,188(1):51-56.

[20] Nimitphak T, Kiatpathomchai W, Flegel TW.Shrimp hepatopancreatic parvovirus detection by combining loop-mediated isothermal amplification with a lateral flow dipstick.[J].Journal of Virological Methods,2008,154(2):56-60.

[21] Nimitphak T, Meemetta W, Arunrut N, et al.Rapid and sensitive detection of Penaeus monodon nucleopolyhedrovirus (PemoNPV) by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral-flow dipstick[J].Molecular and Cellular Probes,2010,24(1):1-5.

[22] Jaroenram W, Kiatpathomchai W, Flegel T W.Rapid and sensitive detection of white spot syndrome virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Molecular & Cellular Probes,2009,23(2):65-70.

武汉公司系泛海核心业务平台之一，持有泛海控股境内所有地产项目以及中国民生信托有限公司约93.42%股权、亚太财产保险有限公司51%股权。公告中，泛海控股表示，该项重组方案的实施是“主动顺应国家政策导向”。

[23] Ding W C, Chen J, Shi Y H, et al.Rapid and sensitive detection of infectious spleen and kidney necrosis virus by loop-mediated isothermal amplification combined with a lateral flow dipstick[J].Archives of Virology,2010,155(3):385-389.

[24] 张金凤,曾令兵,张辉,等.草鱼呼肠孤病毒逆转录环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法的建立[J].中国水产科学,2013,20(1):129-136.

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