萱草属(Hemerocallis L.)为百合科(Liliaceae)多年生草本植物，全属约14种，主要分布于亚洲温带至亚热带地区，中国分布11种[1] ,迄今国际园艺品种已逾8.3万个[2]。属内植物黄花菜是重要的食用干菜，具有很高的经济价值，同时黄花菜富含次生代谢产物，这些次生代谢物用于治疗焦虑和肿胀以及现代医学和生物学中的其他应用[3]。

丰富的植物种质资源为植物育种和遗传研究提供了广泛的遗传基础。然而，大型种质资源也难以保存、评价和使用，建立核心种质库(Core Collection，CC)是有效探索和利用遗传资源新型变异的有利途径[4]。核心种质库的概念最早由Frankel[5]提出，后来由Brown [6]发展推广开来。迄今为止，已为许多植物物种建立了核心种质，通过表型性状构建核心种质库的方法简便易行，形态性状、农艺性状易于统计观察，是一种直接且有效的方法。但作物产量、品质和抗逆性等重要的农艺性状易受环境条件影响,因此基于表型数据的分类不能从本质上准确反映群体固有的遗传变异，得到的核心种质难以代表原有种质资源群体的遗传多样性。Noli等[7]发现分析SSR分子标记和形态特征的多样性时，SSR标记的分类与物种间的实际关系非常接近，因此本试验采用SSR分子标记对萱草属种质资源进行遗传多样性分析。

当前国内外对萱草属内植物的研究多集中于原种或一些常见的园艺品种，所选材料代表性有限，因此本试验利用EST-SSR分子标记开展萱草属种资源遗传多样性和聚类分析研究，构建萱草属初级核心种质库，为提高萱草属种资源的利用率、发掘优异基因资源，培育优质的观赏及食用品种提供理论依据和核心材料。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

选择课题组从国内外(中国，中国台湾，荷兰，美国，秘鲁)收集的155份萱草属植物为试验材料，现保存于山西农业大学萱草种质资源圃(表1)。

1.2 试验方法

采用CTAB[8]法提取DNA，Touchdown 程序进行PCR反应[9]，11%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进行PCR扩增产物检测,0.5×TBE缓冲液，250V电泳1.5h，电泳结果采用银染法显色，拍照保存并记录扩增带型。

采用NTSYSpc2.10软件计算155份萱草属种质材料间的遗传相似系数矩阵，选用SAHN程序，UPGMA[10]方法进行聚类。使用POPGENE32[11]软件计算每个基因座的等位基因数(Na)，Shannon信息指数(I)等。通过SAS 8.0软件进行ANOVA分析。

本试验所用EST-SSR引物序列来自大同黄花(H.‘Datong Huang Hua’)转录组测序结果(北京百迈克生物科技有限公司)。

1.3 取样方法

新动能是相对于旧动能来说的。何为旧动能？旧动能主要是指规模速度型目标导向、模仿跟踪型主体支撑、GDP导向制度引领、传统低端产业发展、粗放投入型要素配置，具体表现为：大目标GDP增速、大国企外企主导、大规模造城运动、大规模基础设施建设、大规模开发区建设、大规模要素投入、大规模招商引资、大规模模仿复制等。何谓新动能？新动能主要指质量效益型目标导向、创新型主体支撑、可持续制度引领、新兴高端产业发展、高级要素配置，具体表现为：新动能驱动（新制度、新要素、新市场）；新产业形态（新产业、新产品、新业态、新模式、新品牌）；新主体支撑（新企业、新企业家、新居民、新平台）。

 

表1 萱草属种质资源信息表(初级核心种质库)

 

Table 1 Information of experimental varieties (the primary Core Collection)

  

序号Number材料名称Name拉丁学名Latinname来源地OriginP1155P2116P384P455P538P6325蟠龙花Hemerocallis‘PanLongHua’浙江缙云P1P2P3P4P5P67大同黄花Hemerocallis‘DatongHuangHua’大同县P1P2P3P4P5P68小黄花HemerocallisminorMill.甘肃庆阳P1P2P3P4P5P616野生萱草2号Hemerocallis‘YeShengXuanCao2’重庆清风桥村P1P2P3P4P5P617长嘴子花1号Hemerocallis‘ChangZuiZiHua1’湖南邵阳P1P2P3P4P5P631野生萱草3号Hemerocallis‘YeShengXuanCao3’晋城沁水历山P1P2P3P4P5P644金娃娃1号Hemerocallis‘StelladeOro1’太谷南咸阳P1P2P3P4P5P646常绿萱草1号HemerocallisaurantiacaBaker.海南P1P2P3P4P5P648大苞萱草HemerocallismiddendorffiiTrautv.&Mey.中国P1P2P3P4P5P652多花萱草HemerocallismultifloraStout.中国P1P2P3P4P5P654黄花菜HemerocalliscitrinaBaroni.中国P1P2P3P4P5P657HemerocallisthumberseriiHemerocallisthumberserii美国P1P2P3P4P5P658Hemerocallisfulvavar.kwansovar.reasataHemerocallisfulvavar.kwansovar.reasata美国P1P2P3P4P5P660秋红Hemerocallis‘AutumnRed’美国P1P2P3P4P5P662小石城Hemerocallis‘RocketCity’比利时P1P2P3P4P5P664粉缎Hemerocallis‘PinkDamask’比利时P1P2P3P4P5P666骄阳Hemerocallis‘Blazingsun’美国P1P2P3P4P5P668蓝光1Hemerocallis‘BlueSheen1’比利时P1P2P3P4P5P676奶油卷Hemerocallis‘Bettywods’美国P1P3P4P5P678H400Hemerocallis‘H400’河北旭东P1P2P3P4P5P679小葡萄紫Hemerocallis‘LittleGrapette’美国P1P2P3P4P5P683金娃娃2号Hemerocallis‘StelladeOro2’美国P1P2P3P4P5P6100血秋红Hemerocallis‘XueQiuHong’河北旭东P1P2P3P4P5P6107北京6号Hemerocallis‘Beijing6’北京植物园P1P2P3P4P5P6115古老无名花Hemerocallis‘GuLaoWuMingHua’湖南祁东P1P2P3P4P5P6125野生萱草4号Hemerocallis‘YeShengXuanCao4’福建P1P2P3P4P5P6130台东6号Hemerocallis‘TaiDong6’台湾P1P2P3P4P5P6133四月红花Hemerocallis‘SiYueHongHua’湖南祁东P1P2P3P4P5P6137高山1号Hemerocallis‘GaoShan1’台湾P1P2P3P4P5P6142大乌嘴Hemerocallis‘DaWuZui’江苏P1P2P3P4P5P6146海尔范Hemerocallis‘FransHals’荷兰P1P2P3P4P5P6150X-91Hemerocallis‘X-91’河北旭东P1P2P3P4P5P6

注：P1,P2,P3,P4,P5,P6依次表示第1次，第2次，第3次，第4次，第5次，第6次抽样后保留群体。

2 结果与分析

2.1 155份萱草属种质的遗传多样性分析

从转录组数据中选取192对EST-SSR引物进行筛选，选取43对具有多态性且条带清晰的引物。43对引物共扩增出396条多态片段，平均扩增9.21(2～25)条，引物多态性信息含量(PIC)平均值为0.6064(0.2595～0.9065)，Nei基因多样性指数为0.5914(0.2097～0.9077)，Shannon’s(I)信息指数为1.2935(0.4770～2.6533)，说明43对引物提供的遗传信息丰富(表2)。不同材料间的遗传相似系数平均为0.8642(0.7828～1.0000)；其中‘宿迁1-C’(2)与‘H.flava L.’(59)间的遗传相似性系数最小为0.7828，二者之间的遗传距离最大，亲缘关系最远，‘大同黄花’(7)与‘桥头黄花’(11)间遗传相似系数最大为1。

 

表2 155份萱草属种质的遗传多样性分析

 

Table 2 Genetic diversity of Hemerocallis germplasm

  

PPBNaNeINeiObs-HomObs-HetExp-HomExp-HetAve-HetP1100%9.20933.09161.29350.59140.82430.17570.40650.59350.5929

注：PPB多态位点百分率，Na观测等位基因数，Ne有效等位基因数，I Shannon’s信息指数，Nei Nei’s (1973) 期望杂合度，Obs-Hom观测纯合度，Obs-Het观测杂合度，Exp-Hom期望纯合度，Exp-Het期望杂合度， Ave-Het平均杂合度。

2.2 155份萱草属种质的聚类分析

基于遗传相似系数矩阵，通过UPGMA方法对155份萱草属种质进行聚类分析，并对聚类结果进行Cophenetic相关性检验，相关性系数r=0.8687，证明聚类结果可靠。根据遗传相似系数及聚类树状图，在相似系数为0.8687处，将155份种质材料划分为两大类群(图1)。

6月中下旬，选择温185、新新2优良核桃的半木质化新梢枝条做接穗，选取新梢枝条上部的雌花芽做为方块芽接的接芽。在选取的接芽长度3 cm、宽度1.5 cm上下左右各切一刀深达木质部，将叶柄留1 cm削除。

图1 155份萱草属种质聚类分析图

Fig.1 The dendrogram of 43 EST-SSR markers derived from 155 Hemerocallis linesconstructed using UPGMA.The scale is based on genetic similarity coefficient.

类群Ⅰ包括 ‘黄花菜’(54)、‘北黄花’(9)、3份不同的‘小黄花’(8，33，34)原始种和 ‘大同黄花’(7)、‘蟠龙花’(5)等地方栽培种、野生种，共59份种质，为“黄花菜”类群。这一类群中花瓣和萼片都为黄色同时花瓣、萼片宽度都很小，均值分别17.46和13.77 cm；植株花葶都较高，叶片都较窄，花序都较大，着花量均值大于50朵，除‘蟠龙花’(5)外都为夜间开花，59份种质皆可食用。类群Ⅱ由11个组构成，包括原种‘常绿萱草’(46)、‘大苞萱草’(48)、‘多花萱草’(52)、‘高萱草’(53)、‘小萱草’(55)，变种‘重瓣萱草’(58)和萱草园艺品种、野生种，共96份种质，为“萱草”类群。这一类群中花瓣和萼片颜色变异丰富，有黄色，橙黄色，橙色，橙红色，红色，紫红，紫色7大色系，同时花瓣、萼片宽度变异系数也很高，其中橙色系的花瓣宽度变异系数最大为42.15%，宽度均值为35.90 cm(13.58～75.56),橙色系的萼片宽度变异系数最大为38.74%，宽度均值为23.40 cm(13.20～48.34)；植株花葶高低和叶片宽窄差异皆极显著，花序形态丰富从小型的迷你花序、极短枝花序到大型的八分枝花序皆有，着花量不等，除‘金娃娃’(83,145)和‘小蜜蜂’(147)外都为早晨开花。

2.3 萱草属初级核心种质库的构建

使用多次聚类优先取样法，通过6次取样构建了萱草属初级核心种质库(表1)，包含32份种质，包括4个种、1个变种、27个品种。核心种质库为原始群体的20.65%，保留了291个(68.69%)多态性位点，其中‘黄花菜’类群种质8份，占‘黄花菜’类群资源总数的13.56% ；‘萱草’类群种质24份，占‘萱草’类群资源总数的25.00%。

[11] Yeh F C, Boyle J B. Population genetic analysis of co-dominant and dominant markers and quantitative traits [J]. Belg. J. Bot, 1997, 129: 157.

对6次取样结果进行ANOVA分析，结果显示有效等位基因数(Ne)，Shannon信息指数(I)，Nei’s指数(Nei)，观测杂合度(Obs-Het)，期望杂合度(Exp-Het)，观测纯合度(Obs-Hom)，期望纯合度(Exp-Hom)以及平均杂合度(Ave-Het)差异均不显著，等位基因数(Na)从第5次取样开始出现显著差异，第6次取样差异极显著(表3)。

（1）基于 OMI的汾渭平原 SO2柱浓度值季节变化特征比较明显，由高到低依次为冬季、秋季、春季和夏季。太原、渭南和西安逐月浓度变化总体呈现下降趋势，临汾表现出了弱上升趋势。这4个城市的SO2柱浓度值与地面监测站的SO2浓度值具有较好的相关性，说明基于 OMI的 SO2柱浓度变化一定程度上可反映大气SO2浓度变化。

利用主坐标分析法(PCoA)构建核心种质和原始群体的分布图，由图2可知，32份核心种质分散的分布在原始群体的范围内，且与原始群体中的相对位置和几何构型相同。综合6次取样过程中所有位点遗传信息的分析结果和利用PCoA构建核心种质和原始群体的分布图，说明构建的初级核心种质库能够反应原始群体的遗传信息，代表原始群体的遗传多样性。

  

图2 萱草属初级核心种质库与原始群体的分布图

 

Fig.2 The distribution of Hemerocallis primary corecollection and the original population

 

表3 多次聚类优先取样法构建萱草属初级核心种质库遗传多样分析

 

Table 3 Genetic diversity index of Hemerocallis primary core collection by procedure of stepwise clustering preferred sampling

  

群体编码POPID样本量Samplesize原始群体的保留率SizePercentage观测等位基因数Na有效等位基因数NeShannons信息指数I多态位点数NP多态位点百分率PPB观测纯合度Obs-Hom观测杂合度Obs-Het期望纯合度Exp-Hom期望杂合度Exp-HetNeis指数Nei平均杂合度Ave-HetP1155100.00%9.2093Aa3.0916Aa1.2935Aa396100%0.8243Aa0.1757Aa0.4065Aa0.5935Aa0.5914Aa0.5985AaP211674.84%9.0930Aa3.1746Aa1.3203Aa392100%0.8252Aa0.1748Aa0.3971Aa0.6029Aa0.6001Aa0.5985AaP38454.19%8.3721ABab3.1837Aa1.3084Aa362100%0.8255Aa0.1745Aa0.3954Aa0.6046Aa0.6007Aa0.5985AaP45535.48%7.5814ABabc3.1798Aa1.2913Aa326100%0.8217Aa0.1783Aa0.3929Aa0.6071Aa0.6012Aa0.5985AaP53824.25%6.7674ABbc3.1650Aa1.2755Aa291100%0.8255Aa0.1745Aa0.3848Aa0.6152Aab0.6066Aa0.5985AaP63220.65%6.2558Bc3.0544Aa1.2303Aa272100%0.8235Aa0.1765Aa0.3987Aa0.6013Aa0.5913Aa0.5985Aa

注：A:极显著差异；a:显著差异，下同。

2.4 萱草属初级核心种质库的遗传多样性分析

43对引物对32份萱草属初级核心种质库材料共扩增出272条多态片段，平均扩增6.3256条, 引物多态性信息含量(PIC)平均值为0.6060(0.2285～0.8999)Nei基因多样性指数为0.5913(0.1623～0.9009)，Shannon’s(I)信息指数为1.2303(0.3846～2.4928)，说明43对引物提供的遗传信息丰富。不同种质间的遗传相似系数平均为0.7940(0.7059～0.9364)。

2.5 萱草属初级核心种质库的聚类分析

根据聚类树状图及遗传相似系数， 32份种质被分为2个类群：类群Ⅰ和类群Ⅱ。其中类群Ⅱ被划分成5个子组，分别命名为Ⅱa，Ⅱb，Ⅱc，Ⅱd，和Ⅱe (图3)。类群Ⅰ由12份种质组成，为“黄花菜”类群；其中‘小黄花’(8)和‘黄花菜’(54)为原始种，其余是以‘大同黄花’(7)为代表的地方品种。类群Ⅰ都为二倍体，花瓣和萼片黄色，为夜间开花类型‘蟠龙花’(5)除外，且全部引种自国内，其花器官皆可食。类群Ⅱ由20份种质聚类而成，为“萱草”类群，为早上开花类型(‘金娃娃’83，‘血秋红’100，‘北京六号’107为夜间开花)。Ⅱa和Ⅱc中除‘H.fulva var.kwanso uar,reasata’(58)和‘小石城’(62)外都是二倍体，Ⅱc包含6个萱草园艺品种，其中4个引种自美国，表明地理位置的远近可能对亲缘关系的远近产生影响。Ⅱb由‘X91’(150)和‘H400’(78)组成，二者都为四倍体。Ⅱd包含2个萱草品种和2个野生萱草，除‘血秋红’(100)都为3倍体，‘血秋红’(100)和‘野生萱草3号’(31)地理位置非常相似，为2个相邻省份，经纬度分别为E 112°47′，N 35°24′。Ⅱe仅包含引种自台湾的‘高山1号’(137)。“萱草”类群中种间、野生种和品种间的遗传相似系数变化范围要大于“黄花菜”类群中，说明“黄花菜”类群在萱草属内的遗传背景较为狭窄[12]。

图3 32份萱草属核心种质聚类分析图

Fig.3 The dendrogram of 43 EST-SSR markers derived from 32 Hemerocallis lines constructed usingUPGMA.The scale is based on genetic similarity coefficient.

3 结论与讨论

在“黄花菜”类群的59份种质中，由不同地方引种的相同名字的种质有的并未聚到一起，如引种自甘肃庆阳与湖南祁东的‘马蔺黄花’(35,131),引种自太谷县、山西农科院和美国的3份‘金娃娃’(44,83，145)。此外，同一引种地的同名种质也并非完全聚为一类，引种自甘肃庆阳的3份小黄花中，‘小黄花’(8)与‘小黄花4号’(34)聚在一起，而‘小黄花2号’(33)在聚类图中与前二者相距较远，这些现象说明当前我国萱草属种质资源比较混乱，同名不同物的混杂现象时有发生。

Erhardt[13]将萱草属分为5类：fulva，citrina，middendorffii，nana和multiflora。本试验中，阿基诺萱草和H.fulva var.kwanso var.reasata聚在一起为fulva组，‘黄花菜’、‘北黄花’和‘小黄花’聚集到citrina组中，‘大苞萱草’归为middendorffii组，‘多花萱草’和‘白云萱草’聚为一组为multiflora组，试验结果与Erhardt一致。同时，“黄花菜”类群先聚为一组，然后再与“萱草”类群种质聚在一起，这与Yasumoto[14]等的发现一致，认为H.fulva是H.citrina的祖先。Tomkins[15]等研究显示，几个萱草(H.fulva)变种都显示亲缘关系很近聚在一起，这与本试验结果一致，但Tomkins等的研究中‘小萱草’和‘大苞萱草’亲缘关系最近聚为一组后又分别与‘小黄花’和‘白云萱草’聚在一起，最后与‘黄花菜’聚为一组，这与本试验结果不一致，这可能与Tomkins等人使用的AFLP标记与本试验不同有关，也可能存在种质本身同名异物的现象。这些不一致之处有待后期研究。

核心种质库构建过程中原始群体的聚类分析、取样方法、取样比例与构建的核心种质是否具有代表性息息相关。徐海明[16]和Hu [17]等认为采用类平均法时,优先取样法和偏离度取样法能够使核心种质具有较大遗传变异,优先取样法优先抽取具有特殊性状表现的材料,更有利于保存一些特异种质，因此本试验采用多次聚类优先取样法进行取样。Yonezawa[18]等研究认为，依据保持群体遗传变异量或等位基因变异的要求，选择资源总量的20%～30% 作为核心样本具有较好的代表性。李自超[19]等认为核心种质适宜的规模各物种应当依据原始群体的大小而定,较小的群体则采用较高的取样比例如20%～30%,随着样本容量的变小,保存的遗传变异和结构对其容量的大小非常敏感。本试验中所用萱草属自然群体155份种质，资源数目较小，采用20.65%的取样比例。

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萱草属初级核心种质构建采用多次聚类优先取样策略：首先依据遗传相似系数判断处于最低分类水平的每组2个遗传材料的性状是否具有极端表现,并优先选取具有极端性状表现的个体；如果2个的性状都具有极端表现,则2个个体都可被优先选入核心库,如果都不具有极端表现则采用随机取样的方法剔除其中一个。

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例如：我在教学苏教版小学数学三年级下册的《统计》时，教师利用事先录好的录像：班级的男女生排球比赛场景，男生队个人参赛，女生队个人参赛，并通过PPT展示最终的比赛成绩记录表，进一步提出问题怎样比较男生队和女生队的输赢呢？

现有研究从宏观、中观和微观不同视角对金融结构影响产业结构升级的机理进行了深入分析，而在各不同传导途径中技术进步都扮演着非常重要的角色。主要表现为以下三个方面：(1)在合理高效的金融结构下，资金向着收益率高的部门流动，资金集聚与导向提供激励，促进技术进步，从而产业结构得以优化提升；(2)国际技术转移尤其是技术引进推动了我国经济结构的调整，其中金融结构发挥着重要的作用；(3)金融结构通过刺激“企业家精神”、影响企业的融资约束等因素，影响企业技术创新，推动产业结构高度化。

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主航道进出洋山港的大型和超大型船舶与其他通航船舶相比具有较高优先级。[9]当存在碰撞危险时，穿越洋山港主航道的船舶应当避让在航道中正常航行的船舶，金山航道南下北上过境船舶应主动避让洋山港进出口的大型船舶，并留足安全距离以保证进出口大型船舶的优先级。

自从泽仁姆说了这句话后，很多个无眠的夜晚，甲洛洛都想去会会她，但思量再三，还是生生地把这念头给葬在了心底。有几次他实在熬不住了，便翻身起床拉开电灯，当亮晃晃的灯光照亮那一屋子的锅碗瓢盆时，他那不安的心一下子又回到了现实，他便点上一支烟，对着黑夜无尽地吞吐。

相较而言，学术界对“困境儿童”的定义和分类问题的研究和达成共识的速度却显得相对滞后，未有突破性的进展和研究共识。

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气固流化床的时空多尺度不均匀结构使床层内气固两相流动表现出强烈的复杂性，用试验方法研究存在很大困难，气固两相流模型与数值模拟的研究成为热点。气固两相流模型很多，从对气固两相处理的连续性和离散性可分为：拟流体模型(PFM)、离散颗粒模型(DPM)和拟颗粒模型(PPM)。