卵黄是卵生动物胚胎及幼体发育早期必需的营养物质，储存于卵细胞中，其主要成分是卵黄蛋白(Vitellin, Vn)。就甲壳动物而言，多年来对于Vn的研究主要集中在生化特性、合成部位以及功能等方面。Vn是一种糖、脂、磷复合蛋白，分子量大多在300 ku以上，含2～5个亚基不等[1-3]；甲壳动物Vn的合成部位比较复杂，有的由脂肪体合成(等足目)，有的则由卵巢和肝胰腺合成(十足目)，但不同种类卵巢和肝胰腺的贡献率也不尽相同[2]；Vn除了可作为胚胎和幼体发育的能量和营养供应者之外，也对个体的性腺发育、配子发生有积极作用[4-5]。因此，研究Vn的发生、积累对于甲壳动物的胚胎及个体发育至关重要。

中华锯齿米虾(Neocaridina denticulata sinensis)隶属于甲壳纲，十足目，匙指虾科，米虾属。该物种具有较强的环境适应力，繁殖速度快，生长周期短，所以对于生理、毒理以及生态等方面来说是较好的实验材料[6]。已有文献对中华锯齿米虾性腺发生的组织学特征[6]、Vn的纯化和生化性质[7]等进行了报道，但是并未分析其卵巢发育过程中Vn的积累情况(Vn开始积累的时间点)。本研究从卵巢发育分化初期的中华锯齿米虾开始取材，通过免疫定位的方法，观察卵巢中Vn的积累时期，了解卵母细胞的发育时相，并且为中华锯齿米虾卵巢发育的相关研究提供参考；同时，明确Vn积累节点，在Vn积累前适时给予营养调整与供应，将有利于卵巢发育，保证卵子质量。

1 材料与方法

1.1 材料

试验中所用成熟雌性中华锯齿米虾和抱卵雌虾(体长2.8～3.3 cm，体质量0.25～0.30 g)购于保定市东风桥市场。

购买回成熟雌性中华锯齿米虾后即从卵巢中提取Vn，不暂养。

将抱卵的雌虾放置在水族箱中暂养，水族箱规格为30 cm×20 cm×20 cm。养殖水温控制在26 ℃，自然光照，直到孵化出幼虾。暂养期间投喂颗粒饵料(购于保定市东风桥花鸟鱼虫市场)，主要成分为鱼粉，小麦粉等。每日早、晚各投喂1次，每次投喂时，观察米虾取食情况，投喂量以米虾不再取食为准。

鄱阳湖区圩堤管理单位与堤防管理人员在以往的堤防管理工作中，特别是在在历次的抗洪抢险工作中，在各级水行政主管部门的领导下，发挥了极大的作用，为防洪减灾、为当地的工农业生产和购买经济建设作出了很大贡献。鄱阳湖生态经济区重要圩堤管理单位基本分为县、乡管理模式。如廿四联圩长90km，由新建县廿四联圩管理局管理，属事业单位，管理员6人，年均投入维护资金10万元。这种管理性质的差异体现在管理工作中的结果是职能不清，责任不明，有事无人管，经费无保证。

孵化初期的幼虾以水体中的微生物为食，不需额外投喂。体长1 cm以内的幼虾投喂研细的颗粒饵料，体长1 cm以上的投喂正常颗粒饵料。养殖水温，光照条件，饵料成分和投喂方式同抱卵虾。

1.2 方法

1.2.1 卵黄蛋白纯化 解剖卵巢发育成熟的中华锯齿米虾，获取卵巢，按穆淑梅等的方法[7]获得卵巢粗提液。采用电泳洗脱法[8]获得纯化的Vn。

1.2.2 卵黄蛋白抗体的制备 采用常规免疫程序，参照杨炎的方法[3]，以纯化的Vn为抗原免疫小鼠，获得中华锯齿米虾Vn的多克隆抗体。

青藏高原(Qinghai-Tibet Plateau)由于海拔高、温度低、干旱多风等因素，生态环境条件十分恶劣[1-2]，适合植物生长的时间较短。青海西宁市位于青藏高原东北部，地处湟水及三条支流的交汇处。呈东西向条带状，地势西南高、东北低。四周群山怀抱，南有南山、北有北山。属大陆性高原半干旱气候，年平均日照为1 939.7 h，年平均气温7.6 ℃，最高气温34.6 ℃，最低气温-18.9 ℃，属高原高山寒温性气候。保证和提高高原地区城镇绿化造林质量，是改善青藏高原地区生态环境的主要环节[3]。

1.2.3 卵黄蛋白抗体特异性检验 双向免疫扩散法(Double immunodiffusion test)和免疫印迹技术(Western blot)被用于检验所制备的卵黄蛋白抗体的特异性。

1.2.4 卵黄蛋白免疫定位 参照杨炎等[6]对于中华锯齿米虾性腺早期分化组织学特征的描述及Kankuan等对于卵巢的发育分期及卵原细胞、卵母细胞特征研究[9]，确定分析Vn在卵巢中积累的下述取样时间点。

民主是宪法永恒的价值追求，现代社会依然体现着这个规律，但是对民主难有统一的认识。民主的核心问题有两个：一是少数人的保障问题；二是“多数人暴政”问题。在民主的成长历程中，“多数人的意见”被发现并不是总是对的，极易造成“民主的专制”和“多数人暴政”。民主在属性上具有深刻表现所有参与者共同意志的倾向，多数只能被理解为是对民主的接近，而不能等同于民主，互联网改变了这个窘境，让“无限的多数人”成为可能。

中华锯齿米虾(每次取同日龄米虾10只)分别孵化12，32，43，55，70和82 d后对其卵巢进行免疫固定及包埋(4%的多聚甲醛和0.5%的戊二醛，pH 7.4，4 ℃固定2～3 h；pH 7.4，0.01 mol/L磷酸盐缓冲液漂洗；酒精梯度脱水；丙酮置换；Epon812环氧树脂包埋)，超薄切片机(ULTRACUTE，Reichert-Jung)切片，厚度0.5 μm。切片用含有2 g氢氧化钾，5 mL环氧丙烷，10 mL甲醇的工作液处理5 min，1%醋酸-甲醇液处理1 min，50%醋酸-甲醇液处理5 min，脱去树脂。脱树脂后的切片进行常规免疫组化程序处理，具体步骤参照贾祥磊等的方法[10]。

2 结果与分析

2.1 双向免疫扩散试验检验卵黄蛋白抗体的特异性

[1] 马杰, 张士璀.卵黄蛋白的结构和功能[J].鲁东大学学报:自然科学版, 2012, 28(3): 252-260.

Vn的积累以及合成(或叫卵黄发生Vitellogenesis)在卵母细胞的发育过程中占据着重要的地位[12-13]，Vn可以为发育中的胚胎提供多种营养物质。杨炎等[6]研究发现，26 ℃下孵化的中华锯齿米虾仔虾从第10天开始出现早期的卵原细胞，标志着卵巢分化的开始；孵化第10天至第28天，卵巢中的细胞类型均为卵原细胞；孵化第42天卵巢中的细胞以卵黄合成前的卵母细胞为主。以此为依据，确定了本研究在对中华锯齿米虾Vn的积累情况进行免疫定位研究时的取材节点。免疫组化试验结果显示，相对比成熟卵巢的阳性对照组(图3 g)，孵化12，32，43，55和70 d的卵巢均呈现阴性，说明尚无Vn的积累发生；仅有孵化82 d的卵巢结果为阳性，此时的卵母细胞为OC3期，Vn开始大量积累，开始营养储备。同时期甲苯胺蓝染色的试验组结果和该结果一致。虽然甲苯胺蓝属于碱性染料，但是该染料中的阳离子可以对组织或者是细胞中含有的酸性物质结合进而染色。Vn富含谷氨酸、天冬氨酸等酸性氨基酸，呈酸性[1]，故可以被甲苯胺蓝染成深蓝色。甲苯胺蓝染色结果显示，该时期的卵母细胞中有大量的Vn球存在。

 

a: 1.中华锯齿米虾卵巢粗提液；2.沼虾卵巢粗提液；3.中华绒螯蟹卵巢粗提液；4.PBS缓冲液；5.Vn抗体.

b: 1.卵巢粗提液；2.纯化Vn；3.PBS缓冲液；4.精巢粗提液；5.肌肉蛋白粗提液；6.Vn抗体.

图1 双向免疫扩散结果

Fig.1 The results of double immunodiffusion test

2.2 免疫印迹(Western Blot)对卵黄蛋白抗体的特异性检测

卵巢粗提液经SDS-PAGE电泳后，将凝胶分为2部分，分别进行考马斯亮蓝R-250染色(图2a)和Western Blot检测，DAB显色(图2b)。显示结果为Vn 3条主带均为阳性，这进一步说明了所制备的Vn抗体具有较好的特异性。

  

a: 考马斯亮蓝R-250染色；b: Western Blot.

 

图2 SDS-PAGE和Western Blot分析Vn免疫特性

Fig.2 Analysis of immunogenicity of vitellin by SDS-PAGE and Western Blot

2.3 卵黄蛋白的定位

研究发现，孵化的中华锯齿米虾仔虾从第10天开始出现早期的卵原细胞，标志着卵巢开始分化[6]。故Vn定位研究的取材从第12天开始。试验对所有样品分别进行了甲苯胺蓝染色、免疫组化试验和阴性对照试验(用PBS代替一抗)。为了保证试验条件的准确性与可靠性，阳性对照组选取发育成熟的卵巢(图3 g)。

12 d的卵巢处于卵原细胞(OG)期。细胞形状为圆形并且均有核质大、体积小胞质均匀的特点；细胞外无滤泡细胞包围。免疫组化显示Vn阴性，即OG中无Vn积累(图3 a)。

 

a.孵化12 d卵巢；b.孵化32 d卵巢；c.孵化43 d卵巢；d.孵化55 d卵巢；e.孵化70 d卵巢；f.孵化82 d卵巢；g.成熟卵巢.

OG，卵原细胞；OC1，卵黄发生前早期卵母细胞；OC2，卵黄发生前晚期卵母细胞；OC3，卵黄发生期卵母细胞；OC4，成熟卵母细胞.

图3 中华锯齿米虾卵巢中Vn的免疫组化定位研究(标尺：10 μm)

Fig.3 Immunohistochemistry of vitellin in the ovary ofN.denticulata sinensis

为了对中华锯齿米虾卵巢内Vn的积累情况进行了解，本试验首先在成熟的中华锯齿米虾的卵巢内对Vn进行提取，继而通过免疫学方法制备鼠抗中华锯齿米虾Vn的抗体，最后通过Western Blot和双向免疫扩散试验对该抗体进行特异性检测。

2.2 外植体诱导培养 由表4可知，外植体在接种45 d后，1～6号培养基都有愈伤组织形成(图1)，其中4号培养基诱导形成愈伤组织数量最多，诱导率为40%，其次为3号培养基，诱导率为35%。由此可见，MS+5.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA和MS+5.0 mg/L 6-BA+0.50 mg/L NAA更易诱导形成愈伤组织，并具有分化能力；1～6号培养基都诱导长出芽(图1)，其中1号培养基(MS+2.0 mg/L 6-BA+0.20 mg/L NAA)更易诱导长芽。综合看来初代培养中每种培养基都有较好的效果。

[5] Pateraki LE, Stratakis E.Synthesis and organization of vitellogenin and vitellin molecules from the landcrab Potamon potamios[J].Comp Biochem Physiol, part B, 2000, 125(1): 53-61.

通过Western Blot检测中华锯齿米虾Vn抗体的特异性，试验结果显示制备的抗体和Vn间的特异性较好，所以自制的Vn抗体可以用来检测中华锯齿米虾Vn的定位和积累情况。

3 讨论

3.1 中华锯齿米虾Vn抗体的特异性

32 d和43 d的卵巢包括OG和卵黄发生前早期卵母细胞(OC1)，以OC1为主。相对比OG细胞来说，OC1细胞体积偏大，但细胞质仍较为均匀。免疫组化结果中显示这2种细胞中均不存在Vn。此外，OC1细胞的外部出现少数滤泡细胞，但这些滤泡细胞分布规则性较低(图3 b，c)。

双向免疫扩散结果显示，日本沼虾和中华绒螯蟹的卵巢粗提液与中华锯齿米虾Vn抗体间无免疫沉淀反应，说明在免疫原性上，Vn存在种间特异性。Vn虽然属于较为保守的蛋白并且在甲壳动物的Vn种间特异性较为普遍，但是Vn相同免疫原性的种属也是存在的，如Delmanowski等研究Petrolisthes cinctipes和P.manimaculis Vn的特性，发现Homarus的Vn抗体能够和前2者的Vn相结合，产生免疫反应；但是中华绒螯蟹、Sicyonia ingentis、Triops longicaudatus的Vn抗体不能与P.cinctipes和P.manimaculis的Vn结合[11]。造成这些不同结果的原因可能跟种间亲缘关系的远近有关，当然这一推测还有待于系统发育研究的证实。

1．加强对城乡居民家庭收入与财产的登记，确保城乡低保对象确定的准确。民政部门要联合统计、税务、金融、社保等部门，针对全社会城乡居民的收入和财产设计汇总的方法与信息平台。居委会与村民委员会通过统一发放居民家庭财产与收入登记表，对所辖社区与村民家庭财产与收入逐一登记，逐月逐季逐年，层层汇总，逐级上报，或者录入国家统一规定的财产与收入统计平台，作为城乡居民缴纳所得税、社保费、发放低保金的依据。同时，居民个人申报财产与收入，作为居民家庭财产与收入登记的重要补充。民政部门定期按照城乡居民家庭收入与财产的变化，调整城乡居民低保对象，确保低保发放的精准。

在试验过程中，将中华锯齿米虾的肌肉提取液、精巢粗提液以及卵巢粗提液三者和Vn抗体进行双向免疫扩散试验。试验结果显示，能够和免疫小鼠得到的中华锯齿米虾的Vn抗体发生免疫反应形成免疫沉淀线的只有卵巢粗提液，说明抗体具有组织特异性。这一结果不难理解，因为Vn为雌性特异蛋白，在卵母细胞中积累。

孵化后82 d的卵巢内出现了卵黄发生期卵母细胞(OC3)，并且该时期的细胞由于物质积累增加而体积明显增大，细胞的形状类似于三角形。免疫组化结果为阳性，甲苯胺蓝染色结果与免疫组化结果一致，显示细胞质中出现蓝色深染Vn球，并且该时期的细胞内出现了更多的脂滴泡(图3 f)。

3.2 中华锯齿米虾卵巢发育过程中Vn的积累

当中央孔加中华锯齿米虾Vn抗体，外周孔分别加纯化的中华锯齿米虾Vn、中华锯齿米虾卵巢粗提液、中华锯齿米虾精巢粗提液、雌性中华锯齿米虾肌肉蛋白粗提液和磷酸盐缓冲液时，除了卵巢粗提液和纯化的Vn与抗体之间产生了免疫反应并形成免疫沉淀线外(图1b)，其余样品均未发生此现象，这表明所制备的Vn抗体具有组织特异性。而且中华锯齿米虾卵巢粗提液、纯化的中华锯齿米虾Vn均与抗体形成融合性的沉淀弧，这说明两孔中的抗原是相同的。

作为临床妇产科危害人类生殖健康的一种重要疾病，不孕不育症的发病率近年来随着人们的生活习惯改变而呈现逐年上升趋势，该疾病会对家庭和睦以及社会和谐造成严重影响，是目前临床生殖医学研究的一个重点[4]。有相关研究[5-6]显示，引发不孕不育症的因素有很多，越来越多的生殖系统疾病的病理生理过程中均被发现有免疫机制在参与并发挥作用，人体的生殖过程的多个途径(包括精子的活性、精卵结合、胚胎着床以及胚胎的发育等)均会受到生殖免疫性抗体的干扰，不孕不育的发生与生殖免疫抗体之间存密切关系，且近年来，在不孕不育的研究中，免疫因素的作用越来越受到临床学者的关注。

本试验中通过免疫组织化学方法对中华锯齿米虾卵巢内的Vn积累情况进行定位分析，这可以为中华锯齿米虾的卵巢发育的研究提供基础资料。Kankuan等研究发现，尽管短期饥饿(12 d)，可以诱导罗氏沼虾(M.rosenbergii)卵巢成熟，但代价却是Vn的消耗，因此，长期饥饿势必带来生殖力的衰退[9]。所以，了解卵巢发育时相，掌握Vn积累的时间点，适时给予营养调整与供应，是保证卵巢发育和卵子质量的关键。

免疫组织化学研究多采用石蜡切片、冰冻切片的制样技术，切片厚度一般为4～10 μm。本研究中，以环氧树脂作为包埋剂，切片厚度可降低至0.5 μm，一方面试剂用量可以减少，另一方面所有处理步骤中的试剂作用也更充分，一定程度上能有效避免假阳性结果的出现。因此，本研究也为免疫组织化学分析方法提供了借鉴。

参考文献：

双向免疫扩散试验结果显示，在中央孔加中华锯齿米虾Vn抗体，外周孔分别加中华锯齿米虾卵巢粗提液、日本沼虾(Macrobrachium nipponense)卵巢粗提液、中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)卵巢粗提液和磷酸盐缓冲液时，除中华锯齿米虾卵巢粗提液与抗体之间形成免疫沉淀线外(图1a)，其余样品孔与抗体间并未发生类似反应，这表明所得Vn抗体是一种种间特异性抗体，也说明中华锯齿米虾的Vn具有物种特异性。

[2] 蔡生力, 刘红.十足目甲壳动物卵黄蛋白原的生化特性及生物合成[J].水产学报, 2017, 41(1): 150-157.

[3] 杨炎.中华锯齿米虾性腺早期分化及卵黄蛋白发生免疫定位[D].保定: 河北大学, 2010.

ABB一直积极致力于帮助各行各业的中国客户实现转型升级和智能化生产，提升运行时间、提高质量和产量，构建智能工厂，以更从容的姿态拥抱工业4.0浪潮下的前沿技术。中国已成为工业机器人的消费大国，也是推动工业机器人发展的主要市场。近年来，ABB机器人业务的产能和研发实力也随着中国市场需求的发展不断提升。安世铭表示：“ABB在中国不仅仅是销售机器人，而且已真正实现从研发、生产、销售、系统集成到客户服务的全价值链本地化，我们所提供的不仅是机器人，还包括针对不同行业的相关配套应用。”

[4] 孙海峰, 王兰, 曲运波.甲壳动物卵黄磷蛋白研究进展[J].山西大学学报:自然科学版, 2000, 23(4): 369-372.

55 d和70 d的卵巢中开始出现卵黄发生前晚期卵母细胞(OC2)，并且70 d的卵巢内主要细胞是OC2。相比于OC1而言，OC2的细胞质内出现脂滴空泡，并且细胞的体积进一步增大。免疫组化结果亦为阴性，OC2中无Vn的存在(图3 d，e)。

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王涤非说：“从进出口数据以及国际产能数据分析，整个国际磷肥市场的需求增量大于供应的增量。供需关系的改变导致了价格的变化，特别是2017年与2018年，国际磷肥的价格呈现上涨趋势。”

[8] 穆淑梅, 康现江, 李彦芹, 等.日本沼虾卵黄磷蛋白生化性质分析[J].河北农业大学学报, 2006, 29(5): 72-75.

单桩嵌岩工艺2的具体流程如图2所示。首先通过单桩自沉如泥、桩锤沉桩，将单桩打至岩层表面；其次，在单桩内部下钻机，扩孔钻至设计底标高处；此后，将钻机提出，在单桩内下放内套管；再次，将内套管和钻孔间灌满混凝土，即灌浆环节；最后，用桩锤继续讲单桩沉桩至指定标高。

[9] Kankuan W, Wanichanon C, Titone R,et al.Starvation Promotes Autophagy-Associated Maturation of the Ovary in the Giant Freshwater Prawn, Macrobrachium rosenbergii [J].Front Physiol, 2017, 8: 300.

综上所述，在当前的剖宫产手术当中，疤痕子宫再次妊娠二次剖宫产手术存在较高的风险，这就需要在进行分娩的时候，必须要根据产妇的实际情况，选择最为合适的分娩方式，对剖宫产术的各项指标进行严格的规范，保障产妇的生命安全。

[10] 贾祥磊, 李超红, 蔡瑞艳, 等.大鼠颈动脉体免疫组化实验方法[J].中国老年学杂志, 2016, 36(15): 3621-3623.

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（1）林农的技术基础薄弱。林农是进行林业技术推广的主要对象，林农进行林业种植的水平高低不一，具有专业的林业技术的农户占很少一部分的数量，所以，对林农来说，他们的整体素质还是比较低的，大大阻碍了林业技术推广工作。

[13] Revathi P, Iyapparaj P, Munuswamy N, et al.Vitellogenesis during the ovarian development in freshwater female prawn Macrobrachium rosenbergii (De Man)[J].J Aquat Sci, 2012, 3(2): 13-27.